Vasculaire Balloon blessures et de l'administration chez le rat Intraluminal artère carotide

Résumé

Ce protocole utilise un cathéter à ballonnet pour provoquer une blessure sur intraluminale de l'artère carotide de rat et désormais provoquer une hyperplasie néo-intimale. Ce est un modèle bien établi pour étudier les mécanismes de remodelage vasculaire en réponse à une lésion. Il est également largement utilisé pour déterminer la validité des approches thérapeutiques potentielles.

Résumé

Le ballon modèle de lésion de l'artère carotide chez le rat a été bien établie depuis plus de deux décennies. Il reste un moyen important d'étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dédifférenciation vasculaire du muscle lisse, la formation de néo-intima et le remodelage vasculaire. Des rats Sprague-Dawley sont les animaux les plus fréquemment employé pour ce modèle. Des rats femelles ne sont pas préférés comme des hormones féminines sont de protection contre les maladies vasculaires et donc introduisent une variation dans cette procédure. La carotide gauche est généralement blessé à la carotide droite servant de témoin négatif. Lésion de la carotide gauche est causée par le ballonnet gonflé qui dénude l'endothélium et s distendre la paroi du vaisseau. Après une lésion, les stratégies thérapeutiques potentielles telles que l'utilisation de composés pharmacologiques et soit gène ou transfert shRNA peuvent être évalués. Typiquement pour le gène ou le transfert shRNA, la section blessés de la lumière du vaisseau est transduit localement pour 30 min avec vparticules Iral codant soit une protéine ou un shRNA pour la livraison et l'expression dans la paroi du vaisseau blessé. Épaississement néo-intimale représentant cellules prolifératives des muscles lisses vasculaires pics habituellement à 2 semaines après la lésion. Les navires sont souvent récoltées à ce point de temps pour l'analyse cellulaire et moléculaire des voies de signalisation cellulaire ainsi que le gène et l'expression des protéines. Les bateaux peuvent également être récoltées à des moments antérieurs afin de déterminer l'apparition de l'expression et / ou l'activation d'une protéine ou d'une voie spécifique, en fonction des objectifs expérimentaux destinés. Les navires peuvent être caractérisés et évalués en utilisant une coloration histologique, immunohistochimie, les dosages de protéine / ARNm, et des dosages d'activité. La intacte l'artère carotide droite du même animal est un contrôle interne idéal. Les changements induits blessures dans les paramètres moléculaires et cellulaires peuvent être évaluées en comparant l'artère blessés vers la droite artère de contrôle interne. De même, les modalités thérapeutiques peuvent être évalués en comparant le blesserd et traités artère pour le contrôle blessé ne artère.

Introduction

Les cathéters à ballonnet sont des dispositifs médicaux utilisés dans le mode opératoire de l'angioplastie, dans le but d'élargir site (s) obstruée de l'athérome ou d'un thrombus dans un vaisseau sanguin. La lumière de vaisseau rétréci est forcé à ouvrir par le ballon gonflé et l'approvisionnement en sang seraient restaurées de manière séquentielle pour soulager les symptômes d'ischémie en aval, tels que l'angine de poitrine, infarctus du myocarde, et la douleur de la jambe. Néanmoins, le grand succès de l'angioplastie a été diminué de complications post-opératoires telles que les résultats de la force causant barotraumatisme vasculaire (lésion par ballonnet), à savoir paroi du vaisseau remodelage et dans de nombreux cas, une nouvelle rétrécissement de la lumière des vaisseaux (resténose) ^1.

Un certain nombre de modèles animaux ont été développés imitant la procédure d'angioplastie pour aider les enquêteurs à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le navire mur remodelage liés à ballonnet ² blessures. Parmi toutes les espèces d'animaux utilisés pour la modélisation, le rat est le plus fréquemment utilisé. Car rapport aux lapins, les chiens et les porcs, les avantages de rats sont leur faible coût, leur relative facilité d'utilisation et les connaissances actuelles de la physiologie du rat. Bien que les souris ont un avantage supplémentaire dans une large gamme de souches manipulées génétiquement, le récipient de souris est trop petite pour insérer un cathéter à ballonnet. Au cours des trois dernières décennies, les rats expérimentaux ont permis aux chercheurs d'acquérir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la formation de néo-intima et le remodelage vasculaire ^3-6. Au-delà de la lésion par ballonnet, le remodelage vasculaire sont également impliqués dans la plupart des maladies vasculaires majeurs, tels que l'athérosclérose ^7,8, l'hypertension ⁹ et ¹⁰ anévrisme. Ainsi, les connaissances acquises par le modèle de blessure par ballon est en général bénéfique pour les études globales de la maladie de la paroi vasculaire.

L'objectif global du modèle de lésion par ballonnet de rat ne est pas seulement pour mieux comprendre les maladies vasculaires mais aussi de tester la puissance de nouveaux agents pourcontrôle de la maladie ^11,12. Traitement de la toxicomanie à la resténose clinique actuelle est appliquée par les stents à élution médicamenteuse passées via la lumière du vaisseau juste après angioplastie. Dans les modèles animaux, d'une manière encore plus économique efficace pour les essais de l'agent nouveau, ce est une méthode bien développé perfusion intraluminale locale. Les agents candidats qui ont été testés grâce à cette méthode comprennent les médicaments à petites molécules ^13,14, cytokines ou des facteurs de croissance ^15,16, Gene manipulation agents (clones d'ADNc, siRNA, etc.) ^17-20, et de nouvelles formulations pharmaceutiques ^21,22.

Jusqu'à présent, le ballon modèle de lésion de rat reste l'un des modèles les plus utiles pour l'étude des maladies vasculaires / troubles. Ce est l'étape fondamentale du laboratoire au chevet du patient, généralement comme la première étape de déplacement in vitro in vivo, mais il ne devrait pas être la dernière. Le résultat d'expériences de rat doit être délibéré et caractérisé en outre avant la traduction en humainel'utilisation clinique, en raison de la différence dans les lits vasculaires et anatomie navire ainsi que les différences entre les espèces intrinsèques humain et de rat ^23-26. Néanmoins, il est encore un outil essentiel dans la recherche médicale translationnelle. Bien que cette recherche a utilisé être limitée par le manque de rats génétiquement modifiés, il n'a plus été un problème car de nouvelles approches génomiques tels que le zinc-nucléases doigt ^{27, 28} et TALENs CRISPR-Cas ²⁹ ont fait rats knockout facilement accessible.

Protocole

NOTE: L'utilisation d'animaux pour les expériences suivantes a été examiné et approuvé par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC).

1. Procédures préopératoires

1. Stériliser les instruments chirurgicaux avant utilisation.
   1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux 24 heures ou moins avant la chirurgie. Si de multiples interventions chirurgicales sont effectuées le même jour, stériliser les instruments par un stérilisateur à billes à sec entre des interventions chirurgicales.
2. Filtre stériliser la solution saline avant utilisation.
3. Peser le rat et le calcul de la dose de médicaments anesthésiques kétamine (80 mg / kg de xylazine et 7 mg / kg).
4. Administrer les médicaments anesthésiques intra-péritonéale (ip).
   1. Vérifier l'adéquation de la sédation par pincement de l'orteil en 5-10 min. Administrer une petite dose additionnelle de drogues (kétamine 7 mg / kg et de xylazine 0,6 mg / kg), si la sédation ne est pas complète.
   2. Assurez-vous que l'aiguille est assez profond pour les médicaments de livraison intra-paritoneally parce que l'échec à fournir la solution de médicament ensemble dans la cavité péritonéale va provoquer une sédation inadéquate.
      REMARQUE: Les ulcères et la perte de cheveux dans la peau au site d'injection seront visibles plusieurs jours après la chirurgie, en raison de sous-cutanée (sc) injection accidentelle de solution médicamenteuse.
5. Injecter 3 ml solution saline stérile voie sous-cutanée (sc). En utilisant un coton-tige stérile, appliquer une petite quantité de pommade ophtalmique à deux yeux pour éviter les cornées de se dessécher.
6. Préparer l'équipement de chauffage. Coussins chauffants Préchauffage des micro-ondes ou par bain d'eau.
7. Mettez l'animal passivement sur la plateforme chirurgicale.
   1. Enlever les poils dans la région du cou ventral. Appliquer l'épilateur avec un coton-tige, attendez 30 secondes et essuyer complètement avec de la gaze.
   2. Badigeonner le cou avec Povidone-iode broussailles et de 70% d'éthanol.
8. Revêtir un équipement de protection individuelle, y compris des blouses, couvrir les cheveux, masque chirurgical et des lunettes. Mettez sterile gants chirurgicaux à la fin avant de manipuler les instruments et les fournitures chirurgicales stériles.
9. Drapé le rat avec une feuille chirurgicale stérile avec seulement la région du cou exposé.

2. Interventions chirurgicales

1. Au cours de la procédure chirurgicale, vérifiez la profondeur de l'animal de la sédation par pincement de l'orteil dans toutes les 15 min. Si l'animal répond à pincement de l'orteil, ajouter petite dose supplémentaire (10% de la dose initiale) de la kétamine et de xylazine.
2. Disséquer gauche artère carotide commune (CCA)
   1. Utiliser un scalpel pour faire une incision longitudinale droite au milieu du cou. La longueur approximative de l'incision de la peau est de 1,5 à 2 cm, dans le but d'isoler une partie de 1,5 à 2 cm de l'artère. La longueur peut varier dépend de l'objet d'étude.
   2. Carrément disséquer le tissu conjonctif de la peau. Gardez les forceps conseils et assurez-vous de ne pas percer la peau ou des tissus sous-jacents.
   3. Disséquer couches musculaires longitudinalement along le côté gauche de la trachée.
   4. Lors de l'ouverture jusqu'à la couche musculaire, visualiser le CCA gauche avec le nerf vague étroitement attachée. Carrément à côté de la disséquer artère carotide gauche avec une extrême prudence pour séparer le nerf vague avec des étirements minime.
   5. Disséquer CCA distale jusqu'à la bifurcation. Disséquer soigneusement la bifurcation et deux branches - l'artère carotide interne (ACI) et l'artère carotide externe (CEA).
   6. Gardez dissection autour de la CCA, jusqu'à environ une partie de 1,5-2 cm de l'artère est isolé des tissus environnants.
3. blessures de Balloon
   1. Faire définitivement une ligature sur le CEA à environ 5 mm de bifurcation. Permanence ligaturer la branche occipitale de la CEA qui est proche de la bifurcation de la CEA et ICA. Aussi ligaturer permanence autres branches, le cas échéant, la localisation entre la bifurcation et la CEA ligature - par exemple, la thyroïde branche supérieure. Suture utilisé pour tous les ligatures est 4-0 noirsoie. Clip sur l'extrémité proximale du CCA et l'extrémité distale de l'ICA.
      NOTE: Maintenant, le flux sanguin a été arrêté de façon permanente par ligature (la CEA) ou temporairement par écrêtage (sur la DPA et ICA). Contenu luminal dans la zone de bifurcation ont été isolés à partir de la circulation systémique.
   2. Faire une incision de la CEA par artériotomie petite micro ciseaux. Assurez-vous que l'incision est proche de la suture noeud distale. Sang propre avec une solution saline et des cotons-tiges.
   3. Insérez le cathéter à ballonnet gonflé 2F dans la lumière de la CEA. Avancer le cathéter à ballonnet proximale à la lumière de l'ACC. Gardez avancer le cathéter proximale jusqu'à son extrémité atteint lorsque le clip reste.
   4. Connecter le dispositif de gonflage du ballonnet à un verrou de Luer femelle sur un robinet à 3 voies et connecter le verrou de Luer mâle du robinet à 3 voies au cathéter à ballonnet.
   5. Gonfler lentement le ballon avec environ 1,5 atm de pression, afin de dilater l'artère carotide à 1,5 fois le diamètre.
   6. Tirez doucement le ballon en rotation revenir à la bifurcation.
   7. Dégonfler le ballon et de faire avancer de nouveau à l'extrémité proximale. Gonfler et répétez la procédure tirant arrière deux fois plus.
   8. Retirer le cathéter à ballonnet de la lumière de l'artère.
4. Intraluminal administration de réactifs (par exemple, siRNA, médicaments)
   REMARQUE: Ici, le réactif utilisé était une solution contenant des particules lentiviraux codant soit shRNA ciblant Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1) ou non-ciblage contrôle shRNA. STIM1 est un endoplasmique protéine transmembranaire unique réticulum (ER) qui est un capteur ER Ca ²⁺ commander l'activation de la membrane plasmique des canaux de ^{Ca2 +} et est régulée à la hausse au cours de dédifférenciation lisses vasculaires de muscle en un phénotype prolifératif ^12,30-33 migratoire.
   1. Joindre une over-the-aiguille cathéter intravasculaire à une seringue (24 G, 1,6 cm). Aspirer solution à 30 ul du GCI de testents. Insérer le cathéter dans la même incision sur la CEA.
   2. Avancer la pointe du cathéter dans le CCA et attacher un morceau de suture avec une seule noeud sur le CEA pour fixer le cathéter et fermer l'incision temporairement.
   3. Injecter la solution de réactif de test dans la lumière du CCA. Conserver la solution dans la lumière du vaisseau pendant 30 min. Gardez le tissu exposé humide avec une solution saline et le couvrir avec un morceau de gaze humide.
   4. Après incubation, aspirer la solution restante. Desserrez ce seul nœud et retirer le cathéter.
   5. Attachez le CEA avec un morceau de fil de suture proximale à l'incision de artériotomie. Faire le nœud le plus proche possible de la bifurcation.
5. Fermer la plaie.
   1. Depuis la blessure de ballon et l'introduction de cathéter peuvent provoquer une fuite ou d'une ponction du vaisseau sanguin, retirer le clip sur la CIA et vérifier se il ya une fuite. Si le saignement est observé, appliquer un morceau de gaze et appliquer une légère pression pour arrêter le saignement.
   2. Supprimerl'autre clip sur la DPA.
   3. Assurez-vous qu'il n'y a pas de signes de saignement, puis retirez tous les colliers et autres instruments chirurgicaux. Coupez sutures excédentaires.
   4. Fermer la plaie en utilisant des sutures cutanées (4-0) de soie noire. Swab de tous les côtés de la plaie fermée avec le Povidon-iode ou d'autres anti-septique / bactéricide / agent virucide. Injecter 3 ml de solution saline stérile sc

3. Procédures postopératoires

1. Gardez rat sur coussin chauffant après la chirurgie. Administrer une dose de 0,05 mg / kg de buprénorphine par injection intramusculaire (im) chez le rat. Au cours de la procédure de recouvrement, garder les yeux et la bouche des animaux humide. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il soit éveillé et ambulatoire.
2. Placez l'animal dans une cage propre sans aucune literie jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli. Après la récupération, l'animal sera retourné à la salle des animaux et occupe individuellement.

Résultats

Deux semaines après la blessure, les artères carotides sont récoltées, sectionnées et soumises à l'analyse morphologique. Les artères sont en coupe transversale et colorées avec H & E (figures 1, 2B, C et 3). Paroi de l'artère carotide Rat contient quatre couches de lame élastique, qui apparaissent comme des lignes roses. La zone comprise entre la strate extérieure, lamina élastique externe (EEL) et de la lame la plus intérieure, la lamina élastique interne (IEL) est le média couche musculaire lisse...

Discussion

La blessure carotide ballon de rat a été bien décrit par Tulis en 2007 ^34. Il a été entièrement discuté tous les détails de cette procédure par le Dr Tulis. Les lecteurs qui se intéressent à cette procédure sont fortement recommandés pour lire le protocole de Tulis. Cependant, il ya une chose que nous ne sommes pas d'accord avec le Dr Tulis: Au lieu de gonfler le ballon avec une solution saline ou un autre type de liquide, nous avons proposé à gonfler avec de l'air. Selon notre expérience personnelle, gonfler avec le liqu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cathéters d’embolectomie par ballonnet de Fogarty, 2	Edwards Lifesciences, Allemagne	; 120602F
Carte d’opération Deltaphase - Comprend 2 coussinets et 2 isolateurs	Braintree Scientific, Inc.	39OP
	Fisher Scientific	12-563-501  ;
Hartmann Pince à moustiques 4 » incurvé	Apiary Medical, Inc. San Diego, CA	gS 22.1670
Crile Retractor 4 » double extrémité	Apiary Medical, Inc.	gS 34.1934
Autres instruments chirurgicaux	Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD
Intraveineuse périphérique (I.V.) Canule, 24 G	BD	381312
Kétamine HCl, 100 mg/ml, 10 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-803-6637  ;
Xylazine (AnaSed), 20 mg/ml, 20 ml	Ketaset- Patterson Vet	07-808-1947
Buprenex, 0,3 mg/1 ml (5 ampoules/boîte)	Ketaset- Patterson Vet	07-850-2280
Nair Baby Oil Hair Removal Lotion - 9 oz	Amazon/Walmart/CVS	N/A
Dispositif de gonflage	Demax Medical	DID30
D300 Robinet d’arrêt 3 voies	B.Braun Medical Inc.
pommade pour larmes artificielles  ;	Laboratoires Rugby, Duluth, Géorgie	N/A

Source lumineuse LED 4599543