Visualisation non-lytique exocytose de Cryptococcus neoformans À partir de macrophages au moyen de Digital microscopie optique

Summary

Nous décrivons comment visualiser macrophages C. neoformans (Cn) les interactions en temps réel, avec un accent particulier sur le processus d'exocytose non lytique en utilisant la microscopie numérique de la lumière. En utilisant cette technique individuellement macrophages infectés peuvent être étudiées pour déterminer différents aspects du phénomène.

Abstract

De nombreux aspects de l'infection des macrophages par Cryptococcus neoformans ont été largement étudiés et bien défini. Cependant, une interaction particulière qui n'est pas clairement comprise exocytose est non lytique. Dans ce procédé, des cellules de levure sont libérés dans l'espace extracellulaire par un mécanisme mal compris que les deux feuilles et le macrophage Cn viable. Ici, nous décrivons comment suivre un grand nombre de macrophages infectés individuellement pendant une période de 24 heures de l'infection par microscopie de temps écoulé. Macrophages infectés sont logés dans une chambre de chauffage avec une atmosphère de CO ₂ fixé à un microscope qui offre les mêmes conditions qu'un incubateur de culture cellulaire. Microscopie numérique en direct peut fournir des informations sur les interactions dynamiques entre un hôte et l'agent pathogène qui n'est pas disponible à partir d'images statiques. Être capable de visualiser chaque cellule infectée peut fournir des indices sur la façon dont les macrophages traitent les infections fongiques, et vice versa. Cette technique isa un outil puissant dans l'étude de la dynamique qui se trouvent derrière un phénomène complexe.

Introduction

Les étapes d'une infection fongique entre les cellules et les macrophages cryptococcose sont bien documentés ^1-3. Après que les cellules de levure sont ingérés par les macrophages, une variété d'interactions peuvent se produire: le macrophage peut lyser libérer sa charge fongique dans l'espace extracellulaire, ou il peut contrôler l'infection par le maintien des cellules de levure dans les limites de sa membrane cellulaire ^4. Cependant, il ya quelques années, un nouveau résultat a été décrit de façon indépendante par deux groupes: exocytose non lytique, un processus dans lequel un macrophage radié partie ou la totalité des cellules cryptococcose dans l'environnement ou une cellule voisine et à la fois l'hôte et l'agent pathogène restent viables ^{5 -8.} Plusieurs études ont tenté de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cette interaction, mais nous n'avons pas encore une compréhension complète sur ce qui motive ce phénomène.

La capacité de capturer des images en temps réel et d'analyser ensuite infecter multiplesed macrophages permet de répondre à de nombreuses questions sur les propriétés physiques entourant l'exocytose non lytique en ce qui concerne le calendrier, la capacité spatiale, le changement dans la morphologie et même le stress des macrophages lors d'une infection fongique. En permettant aux cellules d'être logés dans un environnement qui est comparable à celle d'un incubateur, on peut apercevoir la nature dynamique de l'interaction de cellules macrophages-fongique. Les chercheurs ont utilisé cette technique pour étudier les différentes composantes de ce processus. Le rôle du phagosome dans ce processus a été rendu évident en utilisant une coloration fluorescente et l'actine agents de blocage ^9, tandis qu'un autre groupe a utilisé cette méthode pour montrer que l'exocytose non lytique a été bloqué dans les cellules qui ont eu le WASH nucléation des domaines protéiques supprimé ^10. L'effet de la signalisation de cytokine a aussi été constatée en utilisant la microscopie en temps réel ^11. Ce procédé n'est pas limité à C. neoformans comme il a également été observée avec Candida albicans, another pathogène fongique qui a la capacité d'infecter les macrophages ^12. Ces résultats sont des exemples de la façon dont cette méthode peut fournir une mine d'informations pour une région que nous connaissons si peu.

Protocol

Tous les travaux de l'animal a été fait en conformité avec les règlements et les lignes directrices de l'Institut d'études animales de l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Conditions de croissance de C. neoformans H99 (sérotype A)

1. Croissance individuelle C. neoformans (Cn) colonies sur des plaques de gélose Sabouraud.
2. Un jour avant l'expérience, sélectionnez une colonie et inoculer 10 ml de bouillon de Sabouraud.
3. Laisser la culture se développer pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à une vitesse de 250 tours par minute.

2 Isolement et préparation des os primaire macrophages de C57 / BL6 souris

1. Euthanasier les souris en plaçant l'animal dans une chambre de CO ₂ jusqu'à ce qu'il ne respirait plus. Comme seconde mesure, disloquer cervicale du cou avant de commencer la dissection. Stériliser corps entier avec de l'alcool éthylique à 70%.
2. Retirez les deux fémurs et tibias et place des os dans du DMEM stérile.
3. Retirer l'excès de tissu musculaire et l'aide delicate lingettes jusqu'à ce que les os sont parfaitement propres.
4. Placez les os ne intactes dans une boîte de Pétri contenant de l'alcool éthylique à 70% et incuber pendant 3 minutes pour tuer les micro-organismes associés. Retirez les os et les placer dans un plat de Pétri avec du DMEM stérile.
5. Découpez soigneusement extrémités des os. Tenez os sur un tube conique de 50 ml vides placés sur de la glace et rincer soigneusement 10 ml de DMEM froid à l'aide d'une aiguille 25 G par chaque os.
   REMARQUE: Chaque souris donnera quatre os (2 fémurs, tibias 2). Par conséquent, on devrait donner la souris environ 40 ml de suspension cellulaire.
6. Centrifuger la suspension de cellules à la température ambiante pendant 10 min à 650 x g.
7. Au cours de cette centrifugation, préparer et stériliser par filtration des macrophages de la moelle osseuse alimentation médias qui se compose de DMEM supplémenté avec 20% L929, 10% de sérum de veau foetal, 10% de NCTC-109, 1% de Pen-Strep, 1% de HEPES, 1% de L-glutamine , 1% d'acides aminés non essentiels, 0,1% de 2-mercaptoéthanol.
8. Resuspendre le culot résultant avec 10 ml d'alimentation médias. Passez suspens cellulairesions à travers une passoire 70 um de la cellule de perturber amas de cellules et d'éliminer les gros débris.
9. Planche 1 ml de suspension cellulaire dans 10 ml de milieu d'alimentation dans des boîtes de Pétri qui sont spécifiés pour la culture de tissus (pour un total de 10 plaques).
10. Permettre aux cellules d'adhérer à 37 ° C avec 10% de CO _2. Ajouter 5 ml de milieu d'alimentation frais le jour 3 Au jour 7, remplacer complètement les médias d'alimentation et les macrophages sont prêts à être utilisés.
11. Le jour avant l'expérience, détacher les macrophages de la plaque en enlevant médias alimentation et ajouter 5 ml d'une cellule douce décapage réactif à l'assiette.
12. Incuber pendant 5-10 min à 37 ° C et éliminer les macrophages avec pipetage doux.
13. Cellules granulés par centrifugation à 650 g pendant 10 min.
14. Remettre le culot dans 1 ml de l'alimentation du papier. L'utilisation d'une dilution de 1:20, le calcul de la concentration de macrophages par pipetage de 10 ul de suspension de cellules sur un hémocytomètre.
15. Utilisation de 14 mm à fond de verre des boîtes de Pétri, déposer une feuille deconcentration de 1 x 10 ⁵ macrophages directement sur ​​le puits intérieur qui peut contenir un maximum de 200 pi, afin de prendre attention à ne pas dépasser ce volume comme le montre la figure 4.
16. Permettre aux cellules d'adhérer à la boîte de Pétri en verre en plaçant les capsules dans un incubateur à 37 ° pendant 1 heure.
17. Ajouter 1-2 ml de milieu supplémenté avec alimentation LPS à 1 mg / ml et IFNg à 500 u / ml et permettent aux cellules à incuber pendant une nuit.

3 co-incubation de macrophages murins primaires et C. neoformans

1. Le jour de l'expérience, retirer 1 ml de cellules en culture pendant une nuit et culot levure inoculées par centrifugation pendant 5 min à 420 x g.
2. Laver les cellules 3 fois avec du PBS stérile pour éliminer les médias et les produits cryptococciques extracellulaires comme le polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) à la vitesse et l'heure mentionnée ci-dessus.
3. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de PBS stérile et faire une dilution de 1: 100. Pipette 10 ul de til dilution sur un hémocytomètre et compter les cellules. Ajouter les cellules de levure à une MOI de 1: 5. Par exemple, s'il existe une 10 x ⁵ macrophages / puits, faire une suspension de cellules de 5 x 10 ⁶ / ml de Cn et ajouter 100 ul de cette solution à une quantité totale de 5 x 10 ⁵ Cn.
4. Ajouter le volume calculé de suspension cellulaire à une cryptococcose ml de milieu d'alimentation avec l'anticorps mAb 18B7 à une concentration de 10 pg / ml. Incuber la suspension de cellules à la température ambiante pendant 5 min.
5. Retirez le support d'alimentation de verre à fond plat de Pétri et laver 1x avec du PBS stérile. Ajouter 100 ul de opsonisé Cn directement à bien.
6. Laisser les cellules à incuber pendant 2 heures à 37 ° C avec 10% de CO _2.
7. Après co-incubation, vérifier au microscope que les macrophages ont intériorisé Cn. Pour être considéré comme intériorisé, les cellules cryptococciques devraient être clairement visibles dans les limites de la macrophages.
8. Laver boîte de Pétri 3x avec PBS stérile pour éliminer toute extracellular Cn.
9. Ajouter 1-2 ml d'alimenter les médias sans l'ajout de l'anticorps monoclonal 18B7, et mettre en place microscope.

4 Visualisation non-lytique exocytose en temps réel utilisant Digital Light Microscopy

NOTE: Pour effectuer ces essais, un microscope qui comprend une chambre qui comprend l'incubation de joint livraison de CO ₂ et une unité de chauffage est nécessaire.

1. Avant l'expérience, de pré-chauffer la chambre à incuber pendant au moins 30 min à 37 ° C. Assurez-vous que l'unité de CO ₂ lit 5% au début de l'expérience.
2. Lieu fond de verre boîte de Pétri sur la plate-forme de microscope, couvrir avec du CO ₂ couvercle, et fermer toutes les portes afin de s'assurer qu'aucune chaleur s'échappe.
3. Utilisation de l'objectif 10X avec le microscope à contraste de phase, se concentrer sur un champ libre de macrophages infectés. Sur la base de l'expérience, de déterminer l'objectif utilisé par le nombre de macrophages doivent être étudiés.
4. Configurer le logiciel de microscope à take une image toutes les 4 min pour une période de 24 heures.
5. Après 24 h, l'expérience aura atteint la fin et un total de 361 images a été recueilli. Export de ces images comme .jpegs à une compression de 5%. Utilisation de logiciels Image J, visualiser les images d'une pile visuelle à 5 images par seconde. Si le film doit être vu pour publication ou une présentation, soit l'enregistrer comme un avi ou mov fichier selon le format qui fonctionne le mieux pour le spectateur.

Results

Les images que cette technique produit peuvent être analysées dans une variété de façons de recueillir des informations entourant ce qui se passe après que les cellules ont phagocyté C. neoformans. Comme on le voit sur ​​la figure 1, il existe environ 100 qui sont soit les macrophages infectés ou non infectés. Chacun de ces macrophages donne au spectateur l'occasion d'étudier les interactions hôte-pathogène à un niveau très microscopique. Comme les Figures 2 et 3

Discussion

Ici, nous avons décrit une méthode par laquelle les interactions fongiques macrophages peuvent être enregistrées et analysées en temps réel sur une période de 24 heures. Notre laboratoire a utilisé ce protocole pour étudier de nombreux aspects temporels de l'exocytose non lytique et continuera d'utiliser la microscopie en temps réel pour déterminer les composants morphologiques qui entourent ce processus.

Pour cette technique pour obtenir des résultats optimaux, une attention particu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gélose au dextrose Sabouraud	BD	DF0109-17-1
Bouillon de dextrose Sabouraud	BD	DF0382-17-9
Milieu d’aigle modifié de Dubelcco (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Sérum de veau fœtal (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Acides aminés non essentiels	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxique
3003 Culture tissulaire Boîtes de Pétri  ;	Fisher Scientific  ;	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Plats de culture à fond de verre	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Souris IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Anticorps non commercial produit dans notre laboratoire
Axiovert 200M Microscope avec chambre d’incubation	Zeiss