Visualisation non-lytique exocytose de Cryptococcus neoformans À partir de macrophages au moyen de Digital microscopie optique

Résumé

Nous décrivons comment visualiser macrophages C. neoformans (Cn) les interactions en temps réel, avec un accent particulier sur le processus d'exocytose non lytique en utilisant la microscopie numérique de la lumière. En utilisant cette technique individuellement macrophages infectés peuvent être étudiées pour déterminer différents aspects du phénomène.

Résumé

De nombreux aspects de l'infection des macrophages par Cryptococcus neoformans ont été largement étudiés et bien défini. Cependant, une interaction particulière qui n'est pas clairement comprise exocytose est non lytique. Dans ce procédé, des cellules de levure sont libérés dans l'espace extracellulaire par un mécanisme mal compris que les deux feuilles et le macrophage Cn viable. Ici, nous décrivons comment suivre un grand nombre de macrophages infectés individuellement pendant une période de 24 heures de l'infection par microscopie de temps écoulé. Macrophages infectés sont logés dans une chambre de chauffage avec une atmosphère de CO ₂ fixé à un microscope qui offre les mêmes conditions qu'un incubateur de culture cellulaire. Microscopie numérique en direct peut fournir des informations sur les interactions dynamiques entre un hôte et l'agent pathogène qui n'est pas disponible à partir d'images statiques. Être capable de visualiser chaque cellule infectée peut fournir des indices sur la façon dont les macrophages traitent les infections fongiques, et vice versa. Cette technique isa un outil puissant dans l'étude de la dynamique qui se trouvent derrière un phénomène complexe.

Introduction

Les étapes d'une infection fongique entre les cellules et les macrophages cryptococcose sont bien documentés ^1-3. Après que les cellules de levure sont ingérés par les macrophages, une variété d'interactions peuvent se produire: le macrophage peut lyser libérer sa charge fongique dans l'espace extracellulaire, ou il peut contrôler l'infection par le maintien des cellules de levure dans les limites de sa membrane cellulaire ^4. Cependant, il ya quelques années, un nouveau résultat a été décrit de façon indépendante par deux groupes: exocytose non lytique, un processus dans lequel un macrophage radié partie ou la totalité des cellul....

Protocole

Tous les travaux de l'animal a été fait en conformité avec les règlements et les lignes directrices de l'Institut d'études animales de l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Conditions de croissance de C. neoformans H99 (sérotype A)

1. Croissance individuelle C. neoformans (Cn) colonies sur des plaques de gélose Sabouraud.
2. Un jour avant l'expérience, sélectionnez une colonie et inoculer 10 ml de bouillon de Sabouraud.
3. Laisser la culture se développer pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à une vitesse de 250 tours par minute.

2 Isoleme....

Résultats

Les images que cette technique produit peuvent être analysées dans une variété de façons de recueillir des informations entourant ce qui se passe après que les cellules ont phagocyté C. neoformans. Comme on le voit sur ​​la figure 1, il existe environ 100 qui sont soit les macrophages infectés ou non infectés. Chacun de ces macrophages donne au spectateur l'occasion d'étudier les interactions hôte-pathogène à un niveau très microscopique. Comme les Figures 2 et 3

Discussion

Ici, nous avons décrit une méthode par laquelle les interactions fongiques macrophages peuvent être enregistrées et analysées en temps réel sur une période de 24 heures. Notre laboratoire a utilisé ce protocole pour étudier de nombreux aspects temporels de l'exocytose non lytique et continuera d'utiliser la microscopie en temps réel pour déterminer les composants morphologiques qui entourent ce processus.

Pour cette technique pour obtenir des résultats optimaux, une attention particu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gélose au dextrose Sabouraud	BD	DF0109-17-1
Bouillon de dextrose Sabouraud	BD	DF0382-17-9
Milieu d’aigle modifié de Dubelcco (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Sérum de veau fœtal (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Acides aminés non essentiels	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxique
3003 Culture tissulaire Boîtes de Pétri  ;	Fisher Scientific  ;	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Plats de culture à fond de verre	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Souris IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Anticorps non commercial produit dans notre laboratoire
Axiovert 200M Microscope avec chambre d’incubation	Zeiss