Nous décrivons un protocole d’isolement et de culture de cellules épithéliales amniennes humaines (hAEC) à l’aide de réactifs exempts de produits animaux, conformément aux directives actuelles en matière de bonnes pratiques de fabrication (cGMP).
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Article de méthode
Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules épithéliales amnioïques humaines (hAECs) dérivées de membranes amniotiques à terme ou à terme ont attiré l’attention des chercheurs et des cliniciens en tant que source potentielle de cellules pour la médecine régénérative. La raison de cet intérêt est la preuve que ces cellules ont une capacité de différenciation hautement multipotente, une faible immunogénicité et des fonctions anti-inflammatoires. Ces propriétés ont incité les chercheurs à étudier avec beaucoup de succès le potentiel des hAEC à être utilisés pour traiter une variété de maladies et de troubles dans des études précliniques sur des animaux.
hAECs ont trouvé une large application pour le traitement d’une gamme de maladies et de troubles. Les applications cliniques potentielles des hAEC comprennent le traitement des accidents vasculaires cérébraux, de la sclérose en plaques, des maladies du foie, du diabète et des maladies pulmonaires chroniques et aiguës. Pour passer des études précliniques sur les animaux aux essais cliniques, il faut appliquer des normes plus élevées de contrôle de la qualité et de sécurité aux produits de thérapie cellulaire. Pour des raisons de sécurité et de contrôle de la qualité, il est préférable que les protocoles d’isolement cellulaire utilisent des réactifs sans produits animaux.
Nous avons développé des protocoles pour permettre aux chercheurs d’isoler, de cryoconserver et de cultiver des hAECs à l’aide de réactifs sans produits animaux. L’avantage de cette méthode est que ces cellules peuvent être isolées, caractérisées, cryopréservées et cultivées sans risque de transmettre des agents pathogènes animaux potentiellement nocifs à l’homme, tout en maintenant des rendements, des viabilités et un potentiel de croissance cellulaires appropriés. Pour les chercheurs qui passent des études précliniques sur les animaux aux essais cliniques, ces méthodologies accéléreront considérablement l’approbation réglementaire, réduiront les risques et amélioreront la qualité de leur population de cellules thérapeutiques.
Introduction
Cellules dérivées de sources périnatales, comme le placenta, les membranes placentaires, le cordon ombilical et le liquide amniotique ont attiré l'attention des chercheurs et des cliniciens comme une source potentielle de cellules pour la médecine régénérative 1,2. La raison de cet intérêt est que ces types de cellules possèdent toutes un certain degré de plasticité et immunomodulateur capacité 3, propriétés qui sont fondamentales à leurs applications thérapeutiques potentielles.
HAECs sont une population hétérogène qui épithéliale peut être dérivé de terme ou avant terme membrane amniotique 4, fournissant une source potentielle abondante de matériel cellulaire régénérative. Les propriétés qui rendent HAECs faisant appel en tant que thérapie cellulaire comprennent leur multipotence, une faible immunogénicité, et des propriétés anti-inflammatoires. HAECs se sont révélés être très multipotentes in vitro et in vivo, capable de se différencier en lignées mésodermiques (cardiomyocytes, myocytes, ostéocytes, adipocytes), lignées endodermiques (cellules pancréatiques, les cellules hépatiques, les cellules pulmonaires) et lignages ectodermiques (cheveux, peau, cellules neurales et astrocytes) 5-10.
Rassurant, malgré leurs HAECs de multipotence ne semblent pas soit de former des tumeurs ou de promouvoir le développement de la tumeur in vivo. En outre, sont également HAECs immunitaire privilégié, exprimant de faibles niveaux de classe II antigènes de leucocytes humains courante (AcVC) 8. Cette propriété sous-tend probablement leur capacité à échapper rejet immunitaire après transplantation allogénique et xénogénique, comme l'a démontré dans des études sur des singes immunitaires compétentes, lapins, cobayes, rats et cochons 11-13. HAECs afficher immunomodulateur puissant et des propriétés immunosuppressives et offrent ainsi des avantages pratiques importants pour les applications cliniques potentielles dans la thérapie de la maladie auto-immune. HAECs sont soupçonnés d'exercer des fonctions immunomodulatrices sur les deux systèmes immunitaires innées et adaptatives. Sure des mécanismes suggérés, est par la sécrétion de facteurs immunomodulateur 14.
Les applications actuelles de HAECs dans les modèles de maladies animales précliniques comprennent le traitement des accidents vasculaires cérébraux, la sclérose en plaques, une maladie du foie, le diabète et les maladies pulmonaires chroniques et aiguës. Les chercheurs ont montré intérêt à utiliser pour traiter HAECs post-AVC inflammation du cerveau en raison de leurs propriétés uniques. Il est prouvé que HAECs peut traverser la barrière hémato-encéphalique où ils peuvent se greffer, survivre jusqu'à 60 jours, se différencier en neurones, diminuer l'inflammation et favoriser la régénération des tissus du système nerveux central endommagé dans des modèles animaux de maladies neurologiques 15.
HAECs offrent la possibilité de cibler de multiples voies et inverser pathologiques qui contribuent au développement et à la progression de la sclérose en plaques. Par exemple, les résultats provenant d'études animales précliniques suggèrent que HAECs sont fortement immunosuppressive etpeut potentiellement induire une tolérance immunitaire périphérique et inverser les réponses inflammatoires en cours. HAECs se sont également avérés avoir la capacité de se différencier en cellules neurales in vivo et améliorer neurorégénération endogène par la sécrétion d'une vaste gamme de facteurs neurotrophiques 16.
Les cellules épithéliales amniotiques humaines et de rongeurs ont déjà prouvé leur efficacité thérapeutique pour le traitement de maladie du foie chez des modèles animaux. Dans un modèle de maladie du foie, la transplantation d'haec conduisent à la prise de greffe de HAECs viables dans le foie, accompagnée d'une réduction de l'apoptose des hépatocytes dommages induction tétrachlorure de carbone, et une diminution de l'inflammation et de la fibrose hépatique 17.
HAECs peut être stimulée à des facteurs pancréatiques exprimées notamment insuline et de glucose transporteurs. Plusieurs études ont étudié le potentiel de HAECs pour rétablir les niveaux de glucose dans le sang chez les souris diabétiques 18. Chez les souris recevantHAECs, deux poids et la glycémie niveaux du corps des animaux a diminué à des niveaux normaux après l'injection des cellules. Ces études présentent un dossier solide pour l'utilisation de HAECs pour le traitement du diabète sucré.
HAECs ont un rôle avéré dans la prévention et la réparation de lésion pulmonaire aiguë et chronique expérimentale dans les deux adultes et néonatales 19 modèles. Ces études ont révélé que HAECs différencient in vitro dans des cellules epitheliales pulmonaires fonctionnel exprimant de multiples protéines pulmonaires associées, y compris Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), le canal ionique qui est muté chez les patients atteints de fibrose kystique 20. En outre, lorsque HAECs sont livrés à l'adulte lésée et du poumon néonatal, ils exercent leurs effets par l'intermédiaire de la modulation de réparation des cellules immunitaires de l'hôte, ce qui réduit le recrutement des leucocytes pulmonaire, y compris les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes 21-23.
Compte tenu de leur abondance,dossier de sécurité, et les applications cliniques éprouvées pour plusieurs maladies, les essais cliniques utilisant HAECs est inévitable. Dans le but d'accélérer l'application des thérapies haec en cliniques-essais, nous avons développé des méthodes pour isoler, la cryoconservation et HAECs de la culture d'une manière appropriée pour les essais cliniques, en utilisant des réactifs de libre-produits d'animaux conformément aux pratiques de fabrication actuelles bonnes (cGMP) des lignes directrices .
Nous avons fondé ce protocole un protocole déjà publié que nous utilisions avec succès pour isoler HAECs utilisant des réactifs d'origine animale 6. Nous avons modifié le protocole original pour remplacer les produits d'origine animale avec des réactifs de libre-produits animaux, et l'optimisation ultérieure a été effectuée pour optimiser le rendement de la cellule, la viabilité et la pureté. Notre objectif était de développer un protocole qui serait conforme aux normes réglementaires pour la fabrication de cellules pour des essais cliniques humains.
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Protocole
REMARQUE: Les placentas doivent être collectées auprès des grossesses saines uniques, avec une préférence pour les césariennes électives terme. Écrit, le consentement éclairé doit être donné pour la collecte de leur placenta. Votre comité d'éthique de la recherche sur les humains pertinent devrait approuver toute la collection et l'utilisation de tissus humains.
1. Isolement des cellules épithéliales Amnion
- Placez le placenta sur une surface stérile dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.
- Utilisation écheveaux stériles solution saline équilibrée (HBSS), laver autant de sang que possible de la surface de placenta et les membranes.
- Avec le placenta placé avec le cordon ombilical vers le haut, séparer mécaniquement le bord externe de l'amnios et chorion membranes.
- Une fois séparé, enlever manuellement la membrane amniotique de la membrane chorion du placenta, de travail autour du bord de la membrane, vers le cordon ombilical.
NOTE: Soyez CAREFul pour enlever les morceaux de contaminer membrane chorion de l'amnios. - Avec des ciseaux stériles, couper la membrane amniotique d'environ 2 cm de la base du cordon ombilical et le placer dans un récipient fermé 500 ml contenant 250 ml de HBSS.
- Laver soigneusement en agitant la bouteille scellée contenant la membrane amniotique.
- Retirer la membrane amniotique du récipient de collection à l'aide de pinces stériles, et les placer dans un plat 15 cm Petri.
- Couper la membrane amniotique en morceaux d'environ 5 cm de long (lorsqu'on la tient verticalement avec une pince), en écartant morceaux sanglants ou déchirés.
- Placer dans un récipient scellé 500 ml et laver avec 250 ml de HBSS environ 3-5 fois ou jusqu'à ce que la membrane amniotique devient translucide sans contaminer le sang.
NOTE: Toute présence de sang peut réduire l'efficacité de la solution enzymatique digérer. - Transférer tous les morceaux de membrane amniotique dans un récipient contenant 50 ml de la solution enzymatique digérer, en prenant soin deminimiser report de HBSS.
- Incuber les pièces amnios dans enzymatique digèrent solution dans un bain d'eau ou salle chaude à 37 ° C pendant 15 min en agitant doucement pour enlever tout reste de sang.
- Retirez les morceaux de membrane amnios de la solution enzymatique digérer et placer dans un nouveau récipient stérile.
- Ajouter 100 ml de solution enzymatique frais digérer à la membrane amniotique et incuber à 37 ° C pendant 60 min dans un bain d'eau ou salle chaude avec agitation douce (première digestion).
- Retirez les morceaux de membrane amnios et le placer dans une nouvelle prise de conteneurs soins pour permettre à la digestion enzymatique solution se écouler depuis chaque pièce de la membrane.
NOTE: On peut y parvenir en faisant glisser les pièces amnios le long du bord intérieur du récipient. - Ajouter 100 ml de solution enzymatique frais digérer les morceaux de membrane amnios et incuber 60 min dans un bain d'eau ou salle chaude à 37 ° C avec agitation douce (seconde digestion).
- Passez le suspensi cellulaireà partir de l'étape à travers un filtre 1,14 um et 70 centrifuger à 1000 g pendant 10 min.
- Retirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de HBSS contenant un inhibiteur à base de soja 1 mg / ml enzyme. Pipeter doucement plusieurs fois avec une pipette de 1 ml pour obtenir une suspension cellulaire unique.
NOTE: A ce stade, les cellules peuvent être laissées sur la glace jusqu'à ce que les cellules de la seconde digestion sont au même stade de transformation. - Retirez les morceaux de membrane amnios et le placer dans une nouvelle prise de conteneurs soins pour permettre à la digestion enzymatique solution se écouler depuis chaque pièce de la membrane.
NOTE: On peut y parvenir en faisant glisser les pièces amnios le long du bord intérieur du récipient. - Faire passer la suspension de cellules provenant de l'étape à travers un filtre 1,18 um et 70 centrifuger à 1000 g pendant 10 min.
- Retirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de HBSS contenant un inhibiteur à base de soja 1 mg / ml enzyme. Pipette doucement à plusieurs reprises avec un 1 ml de pipette pour obtenir une suspension cellulaire unique.
- Piscine cellules des deux recueils ou encore les garder digère cellulaires séparés qu'après le nombre de cellules.
NOTE: Cela empêche le mélange des cellules de viabilité potentiellement faibles avec des cellules de haute viabilité. - Ajouter HBSS à un volume final de 10 à 20 ml et effectuer le nombre de cellules en utilisant du bleu trypan pour mesurer la viabilité.
- Confirmez le phénotype des cellules épithéliales par cytométrie de flux. Compléter à l'aide des cocktails d'anticorps appropriés anti-EpCAM-PE (dilution 1: 2) anti-CD90-PECy5 (1: 250) et anti-CD105-APC (1: 100) dans du HBSS.
- Remettre en suspension un sous-ensemble de cellules de l'une ou des deux produits de digestion dans le cocktail d'anticorps à une concentration de 25 x 10 6 cellules / ml.
- Pour la cytométrie de flux, une tache x 10 6 cellules avec des cocktails d'anticorps contenant contrôles isotypiques (ex. Contrôle-PE IgG + 1 isotype anti-CD90-PECy5 + anti-CD105-APC). Gardez ~ 1 x 10 6 cellules non colorées pour cytomètre de flux set-up.
- Incuber les cellules à un anticorpscocktails à 4 ° C pendant 60 min.
- Laver les cellules 3x dans HBSS et remettre en suspension de 5 à 10 millions de cellules par ml pour cytométrie de flux.
- Effectuer cytométrie de flux et les résultats de note. La pureté de l'isolât de cellule (le pourcentage d'EpCAM positif et CD90 / CD105 cellules négatives) devrait être de 90 à 95% et <1%, respectivement.
- Mettez de côté un nombre approprié de cellules pour tester les critères de contrôle de la qualité ou de libération appropriées tel que déterminé par application finale.
NOTE: Cela peut inclure la maladie / dépistage viral, ou autre sécurité ou des critères biologiques. - Pour les cellules restantes, suivre le protocole de cryoconservation, ou encore placer directement dans la culture (directe à la culture étape 3.6).
2. Cryoconservation de HAECs
- Déterminer le nombre et la viabilité cellulaire en utilisant la cytométrie de flux de données ou de comptage manuel avec exclusion au bleu trypan.
- Centrifuger à 700 g pendant 5 min.
- Remettre en suspension cellulaires entre 1-10000000 cellules par ml chez l'animal médias de cryoconservation produit-libre.
- Pipeter un volume approprié de cellules dans des flacons de cryoconservation O-anneaux et placer dans un appareil de congélation à vitesse contrôlée dans lequel le refroidissement se produit à environ 1 ° C / min jusqu'à -80 ° C soit atteinte.
- Transfert flacons dans l'azote liquide pour le stockage à long terme.
3. La décongélation et la culture de Cyropreserved HAECs
- Retirer flacons de cryoconservation de l'azote liquide et placer sur la glace.
NOTE: Pour le transfert seulement - procéder rapidement à l'étape suivante. - Décongeler les flacons de cryoconservation rapidement à 37 ° C jusqu'à ce que seulement un petit morceau (~ 5 mm x 5 mm) de glace reste.
NOTE: Il est important que la solution de cellules ne réchauffe pas pour réduire les effets toxiques de DMSO dans les médias de cryoconservation. - Diluer médias de cryoconservation 10 fois avec (~ 4 ° C) les médias sans sérum froid, goutte à goutte dans une taille appropriée ajoutéetube d ou conteneur.
- Centrifuger à 700 g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension dans du milieu exempt de sérum, à une concentration approximative de 1 million de cellules par ml. Déterminer le nombre et la viabilité cellulaire en utilisant un comptage automatique ou manuel avec exclusion au bleu trypan. Prévue viabilité post-dégel sera 5-10% de moins que pré-cryoconservation viabilité.
- cellules de la plaque sur la culture traitée articles en plastique cellulaire standard, ou encore utiliser collagène de type I sur les surfaces de culture de manteau.
- Pour collagène de type I revêtement suivre le protocole ci-dessous
- Préparer acide soluble collagène de type I à partir de placenta humain (15 mg de collagène avec 25 ml d'eau désionisée et 50 ul d'acide acétique glacial).
- Couvrir bécher avec Parafilm et remuez modérément à 37 ° C jusqu'à brins de collagène sont dissous.
- Solution de collagène filtre stérile en utilisant un filtre de 0,22 um.
- Diluer le collagène filtrée stocks 1:10 avec de l'eau déminéralisée. Ce stock est diluée la conce travailntration solution pour les surfaces en matière plastique et la membrane de revêtement.
- Collagène couche plastique, les surfaces en verre et la membrane pendant 2 heures à la température ambiante à 37 ° C, ou O / N à 2-8 ° C.
- Retirer l'excès de liquide de la surface revêtue, et laisser sécher O / N.
- Rincer à l'eau stérile de qualité culture de tissu ou HBSS avant d'introduire cellules et le milieu.
- HAECs Plate à une densité de 25 000 cellules / cm2 dans un milieu sans sérum, et permettent l'attachement à se produire pour 72-96 h.
- À la suite de l'attachement, changer de support par aspiration avec précaution et le remplacer par un volume de milieu sans sérum approprié tous les 2-3 jours.
- Passage cellules utilisant le protocole ci-dessous
- Aspirer milieux de culture de cellules et laver avec 1x volume de HBSS stérile
- Ajouter le volume 1x solution de digestion enzymatique et incuber pendant 5 à 15 min, ou jusqu'à ce que les cellules sont observées détachant de la surface de culture cellulaire.
- Récupérer enzymatique digérer solution contenant des cellules, assurant CElls sont détachées de la surface de culture de cellules en pipetant plusieurs fois la solution de digestion enzymatique sur la surface de culture cellulaire
- Centrifuger à 700 g pendant 5 min.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume de HBSS contenant un inhibiteur approprié à base de soja 1 mg / ml de l'enzyme. Pipeter doucement plusieurs fois avec une pipette de 1 ml pour obtenir une suspension cellulaire unique.
- Ajouter du milieu sans sérum à une concentration approximative de 1 million de cellules / ml. Déterminer le nombre et la viabilité cellulaire en utilisant un comptage automatique ou manuel avec exclusion au bleu trypan.
- HAECs Plate à une densité de 25 000 cellules / cm2 dans un milieu sans sérum, et continuent avec les méthodes de culture standard.
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Résultats
Lorsque cette procédure est correctement suivie, un rendement moyen de 120 millions de HAECs devrait se attendre, avec une gamme typique de 80 à 160.000.000 cellules. De ces rendements, une viabilité moyenne de 83 ± 4% peut être attendue. Le rendement augmenté et la viabilité moyenne légèrement inférieure à la méthode clinique peut être due à l'activité de la trypsine élevé que le produit d'origine animale, et peut-être également en raison de l'absence de protéines sériques. HAECs isolés ont un profil de surface de cell...
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Discussion
Il ya plusieurs paramètres critiques qui peuvent avoir un impact important dans le succès de cette méthodologie. Stockage du placenta ou amnios jusqu'à 3 heures avant l'isolement du HAECs peut être souhaitable à des fins logistiques ou d'horaires, il est toutefois recommandé que le tissu est traité dès que possible. Si le tissu doit être stocké, il est recommandé que le stockage est effectué après dissection et de lavage de la membrane amniotique. Amnios peut être stocké dans HBSS contenant des antibiotiques...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient le soutien financier du programme de soutien à l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kit de | |||
| Plateau de dénudage | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Pince à pansement, pointue 13 cm | Fisher Scientific | S17329 ; | |
| Ciseaux - Tranchants/Émoussés Droits, | Fisher Scientific | NC0562592 ; | |
| Gants stériles en latex ; | Fisher Scientific | 19-014-643 ; | |
| Vêtements | |||
| Vêtements de protection (blouse) | U-line | S-15374-M | |
| Blouses d’isolement | U-line | S-15374-M | |
| Gants stériles en latex ; | Fisher Scientific | 19-014-643 ; | |
| Masque facial à usage général | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Couvre-chaussures | U-line | S-7873W | |
| Médias et réactifs | |||
| Hanks' Solution saline équilibrée (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | sans calcium ni magnésium |
| TrypZean (produit animal&ndash ; trypsine recombinante libre) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Inhibiteur de la trypsine de soja ; 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue réactif | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| ISOTYPE PE contrôle | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| contrôle de l’isotype PeCy5 | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| contrôle de l’isotype APC | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagène de type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consommables | |||
| Pipette graduée 50 ml | BD/Falcon | 356550 | |
| Pipette graduée 10 ml | BD/Falcon | 356551 | |
| Pipette graduée 5 ml | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml Tubes Faucon | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml Tubes Faucon | BD/Falcon | 352096 | |
| Boîtes de Pétri de 15 cm | Corning | 351058 | |
| 70 &mu ; m filtres | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 &mu ; m filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pointes | de pipette Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 &mu ; l Pointes de pipette | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| Seringue 20 ml | BD/Medical | 309661 | |
| Spatule en plastique | Fisher Scientific | 14-245-97 ; | |
| Peseur en plastique | Fisher Scientific | 02-202-102 ; | |
| Flacons cryogéniques | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| M. Frosty | Fisher Scientific | A451-4 ; | |
| Armoire |
Références
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Réimpressions et autorisations
