Isoler Potentiated Hsp104 Variantes utilisant de la levure Proteinopathy modèles

Résumé

Les modèles de protéinopathie de levure sont des outils précieux pour évaluer la toxicité et l’agrégation des protéines impliquées dans la maladie. Nous présentons ici des méthodes de criblage des banques de variants de Hsp104 pour les suppresseurs de toxicité. Ce protocole pourrait être adapté pour dépister n’importe quelle bibliothèque de protéines à la recherche de suppresseurs de toxicité de toute protéine toxique chez la levure.

Résumé

De nombreux troubles de mauvais repliement des protéines peuvent être modélisés chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae. Des protéines telles que TDP-43 et FUS, impliquées dans la sclérose latérale amyotrophique, et la α-synucléine, impliquée dans la maladie de Parkinson, sont toxiques et forment des agrégats cytoplasmiques chez la levure. Ces caractéristiques récapitulent les pathologies protéiques observées chez les patients atteints de ces troubles. Ainsi, les levures constituent une plate-forme idéale pour isoler les suppresseurs de toxicité à partir de banques de variantes de protéines. Nous nous intéressons à l’application de désagrégations de protéines pour éliminer les conformateurs de protéines toxiques mal repliés. Plus précisément, nous concevons Hsp104, une protéine hexamère AAA+ de levure qui est capable de solubiliser à la fois les agrégats désordonnés et l’amyloïde et de ramener les protéines à leurs conformations natives. Bien que Hsp104 soit hautement conservé chez les eucaryotes et les eubactéries, il n’a pas d’homologue métazoaire connu. Hsp104 n’a qu’une capacité limitée à éliminer les agrégats désordonnés et les fibres amyloïdes impliqués dans les maladies humaines. Ainsi, nous visons à concevoir des variantes de Hsp104 pour inverser le mauvais repliement des protéines impliqué dans les troubles neurodégénératifs. Nous avons développé des méthodes pour cribler de grandes banques de variants de Hsp104 pour la suppression de la protéotoxicité chez la levure. Comme les levures sont sujettes à une suppression spontanée non spécifique de la toxicité, un processus de dépistage en deux étapes a été mis au point pour éliminer les faux positifs. À l’aide de ces méthodes, nous avons identifié une série de variants potentialisés de Hsp104 qui suppriment puissamment la toxicité et l’agrégation de TDP-43, FUS et α-synucléine. Ici, nous décrivons ce protocole optimisé, qui pourrait être adapté pour cribler des banques construites à l’aide de n’importe quel squelette protéique pour la suppression de la toxicité de toute protéine toxique dans la levure.

Introduction

Levure de modèles proteinopathy ont été développés pour les troubles du repliement des protéines, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie (PD) ^3/1 de Parkinson. L'expression des protéines TDP-43 et FUS, qui misfold chez les patients SLA, sont toxiques et mislocalize à former des agrégats cytoplasmiques dans la levure ^1,2. De même, l'expression d'α-synucléine (α-syn), qui est impliquée dans la MP, est toxique et mislocalizes à former des agrégats cytoplasmiques de levure ^3. Ces caractéristiques récapitulent phénotypes chez les patients atteints de ces troubles ^4,5. Ainsi, les modèles de l....

Protocole

1. Bibliothèque génération

1. Pour construire des banques de Hsp104 utilisant la PCR sujette à l'erreur spécifique au domaine, d'abord amplifier le domaine d'intérêt avec une erreur de l'ADN polymérase ²⁰ sujets.
2. On purifie le produit de PCR par extraction sur gel.
3. Effectuez une étape d'extension de méga-utilisant un protocole de mutagenèse dirigée norme: combiner 50 ng modèle plasmide, 250 ng méga-200 uM de dNTP, et haute-fidélité ADN polymérase dans un tampon PCR, et diluer à 50 pi volume total avec PCR eau de qualité ²⁰ . Exécuter un programme PCR standard.
   REMARQUE: Des amorces spécifiqu....

Résultats

Nous avons construit une banque de variants Hsp104 randomisés dans le domaine intermédiaire et criblés pour la suppression de TDP-43 toxicité. La bibliothèque a été transformée et plaqué sur du glucose et du galactose plaques (figure 2) pour évaluer la rigueur de l'écran. Des colonies isolées ont été sélectionnés et les souches ont été sélectionnées à l'aide contre 5-FOA pour éliminer le plasmide Hsp104. Ces souches ont ensuite été évalués pour confirmer que la toxicité est due à TDP-43 seul, sans les v.......

Discussion

Ici, nous présentons notre approche pour isoler variantes Hsp104 potentialisés qui suppriment la toxicité des substrats associés à la maladie en utilisant des modèles de levure proteinopathy. En utilisant cette approche, les grandes banques de variants peuvent être criblés en haut débit, avec la seule limitation étant le nombre de variantes qui passent l'écran secondaire 5-FOA. En effectuant ces mesures au format 96 puits, nous contrôlons régulièrement jusqu'à 200 coups à la fois dans l'étape 5-FOA au cours .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Boîtes de Pétri	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Plaques	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V& P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200