Profitant de interaction réduite des gouttelettes de la surface pour optimiser le transport de Bioanalytes en microfluidique digitale

Résumé

Le protocole de fabrication et d’exploitation des dispositifs de démouillage de champ (Field-DW) est décrit, ainsi que les études préliminaires des effets des champs électriques sur le contenu des gouttelettes.

Résumé

La microfluidique numérique (DMF), une technique de manipulation des gouttelettes, est une alternative prometteuse pour le développement de plateformes de « lab-on-a-chip ». Souvent, le mouvement des gouttelettes repose sur le mouillage d’une surface, directement associé à l’application d’un champ électrique ; Les interactions de surface, cependant, rendent le mouvement dépendant du contenu en gouttelettes, ce qui limite l’étendue des applications de la technique.

Certaines alternatives ont été présentées pour minimiser cette dépendance. Cependant, ils reposent sur l’ajout d’espèces chimiques supplémentaires à la gouttelette ou à son environnement, qui pourraient potentiellement interagir avec des fractions de gouttelettes. Pour relever ce défi, notre groupe a récemment développé des dispositifs Field-DW pour permettre le transport de cellules et de protéines dans le DMF, sans additifs supplémentaires.

Ici, le protocole pour la fabrication et le fonctionnement du dispositif est fourni, y compris l’interface électronique pour le contrôle du mouvement. Nous poursuivons également les études avec les dispositifs, montrant que des organismes modèles multicellulaires, relativement grands, peuvent également être transportés, sans doute non affectés par les champs électriques nécessaires au fonctionnement du dispositif.

Introduction

La miniaturisation des dispositifs qui fonctionnent avec des liquides est d'une importance primordiale pour le développement de plates-formes "lab-on-a-chip». En ce sens, les deux dernières décennies ont vu un progrès significatif dans le domaine de la microfluidique, avec une variété d'applications. ^1-5 Contrastant avec le transport de fluide dans les canaux fermés (canal microfluidique), DMF manipule gouttelettes sur des réseaux d'électrodes. L'un des mérites les plus attrayants de cette technique est l'absence de pièces mobiles pour le transport de fluides, et le mouvement est immédiatement arrêté en désactivant signaux électriques.

Cependant, le mouvement des gouttelettes dépend contenu de gouttelettes, certainement une caractéristique indésirable pour une plate-forme universelle "lab-on-a-chip». Gouttelettes contenant des protéines et d'autres analytes collent aux surfaces de l'appareil, devenir immobile. Sans doute, cela a été la principale limitation pour élargir le champ des applications DMF; ^6-8alternatives pour minimiser l'encrassement de la surface indésirable impliquent l'ajout d'espèces chimiques supplémentaires à la goutte ou ses environs, ce qui pourrait avoir une incidence sur le contenu de gouttelettes.

Auparavant, notre groupe a développé un dispositif pour permettre le transport des cellules et des protéines dans le DMF, sans additifs supplémentaires (appareils de terrain-DW). ⁹ Ceci a été réalisé en combinant une surface basé sur la suie de bougie, ¹⁰ avec une géométrie du dispositif qui favorise gouttelettes de roulement et conduit à une force ascendante sur la gouttelette, ce qui réduit davantage l'interaction des gouttelettes de la surface. Dans cette approche, le mouvement des gouttelettes est pas associé à un mouillage de la surface ^11.

Le but de la méthode détaillée décrit ci-dessous est de réaliser un dispositif de DMF capable de transporter des gouttelettes contenant des protéines, des cellules et des organismes entiers, sans additifs supplémentaires. Les appareils de terrain-DW ouvrent la voie à des plates-formes entièrement contrôlées de travail en grande partie indépendamment de gouttelettes chimistery.

Ici, nous avons également présentes simulations montrent que, malgré la haute tension nécessaire au fonctionnement du dispositif, la chute de tension aux bornes de la gouttelette est d'une petite fraction de la tension appliquée, ce qui indique des effets négligeables sur l'intérieur de la gouttelette bioanalytes. En fait, des essais préliminaires avec Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nématode utilisé pour une variété d'études de la biologie, qui montrent vers nage normale que des tensions sont appliquées.

Protocole

NOTE: Dans les procédures décrites ci-dessous, les consignes de sécurité de laboratoire doivent toujours être respectées. Il est particulièrement important de la sécurité lorsqu'ils traitent avec haute tension (> 500 V) et manipulation de produits chimiques.

1. revêtement d'un substrat conducteur avec la suie de bougie

1. Cut cuivre métal en rectangles (75 x 43 mm, 0,5 mm d'épaisseur). Nettoyez chaque substrat de cuivre par immersion dans de gravure de cuivre pour environ 30 secondes, laver avec de l'eau du robinet pendant environ 20 secondes, et sécher sur papier.
   NOTE: Si vous utilisez la méthode 1 ci-dessous, changer les dimensions de 75 x 25 mm à insérer dans la machine.
2. Balayer une bougie de paraffine allumé sous le substrat de cuivre pendant 30-45 secondes, pour obtenir un revêtement de suie à peu près uniforme (environ 40 um d'épaisseur). Gardez le substrat à ~ 1 cm à l'intérieur de la flamme. Ne touchez pas la surface de la suie fragile.

2. Protéger la couche de suie avec revêtement

NOTE: La couche de suie est très fragile, Et doit être recouvert d'une protection. Deux alternatives simples (méthodes 1 et 2 ci-dessous) sont proposées ici, mais les protocoles plus robustes sont actuellement en cours de développement.

1. Méthode 1
   1. Charger l'échantillon dans l'évaporateur de métal ou d'un système de pulvérisation cathodique. En suivant les procédures de fonctionnement du système, évacuer la chambre, et commencer dépôt contrôlé de l'or sur la couche de suie (150-200 nm). Laissez l'appareil refroidir à la température ambiante.
   2. Dip-couche métallisée du substrat dans une solution de 1-dodécanethiol (1% v / v dans l'éthanol à 95%, ACS / qualité USP), pendant 10 minutes dans une hotte chimique. Ensuite, en tenant l'appareil à un angle proche de 60 °, laver délicatement la surface avec plusieurs gouttes d'éthanol seulement. Que les dispositifs sec, du jour au lendemain.
2. Méthode 2
   1. Dans une hotte chimique, immédiatement après le revêtement du substrat avec de la suie et alors que le substrat est encore chaude de la flamme de la bougie, déposer des gouttelettes de liquide fluoré sur un côté de lasubstrat, et incliner le substrat à un angle proche de 90 °. Déposez plusieurs gouttelettes, et laissez-les rouler sur la surface de la suie entier.
      NOTE: Lorsque la gouttelette tombe sur un point, la suie sera emporté de cette région. Que les gouttelettes de liquide fluoré propagation le plus possible.
   2. Cuire le substrat sur une plaque chauffante (160 ° C pendant 15 min) à l'intérieur d'une hotte chimique.
   3. Laissez le substrat reposer toute la nuit à la température ambiante avant de l'utiliser. Stocker indéfiniment.

3. Fabrication de électrodes supérieures (Adapté de Abdelgawad et al. ¹²⁾

1. Dessiner les électrodes à l'aide de logiciels de conception graphique. Chaque électrode est de 2 mm de long, 0,3 mm de largeur, et l'écart entre les électrodes est de 0,3 mm. L'écart entre contacts (à enclencher dans le connecteur, voir ci-dessous) est de 2,3 mm (figure 1).
2. Coupez un stratifié de cuivre souple (35 um d'épaisseur) dans le format Monarch (3,87 x 7,5 pouces). Utiliser d'autres tailles if compatible avec l'imprimante. Chargez le stratifié dans le bac d'alimentation manuelle d'une imprimante couleur.
3. Assurez-vous d'utiliser "noir riche", ou "inscription noire", lors de l'impression sur la feuille de cuivre (voir Abdelgawad et al. ¹² pour plus de détails) afin de permettre une couche plus dense de l'encre noire sur le substrat de cuivre, de protéger le motif imprimé lors de la gravure . Laissez le substrat sèche complètement imprimé, du jour au lendemain.
4. A l'intérieur d'une hotte chimique, réchauffer (40 ° C) avec un bécher de 50 ml de solution d'attaque du cuivre. Trempez le stratifié imprimé dans le bécher, et secouez-la délicatement dans la solution pendant environ 10 min. Gravure temps dépend de la solution de gravure de cuivre. Toutes les quelques minutes, vérifier la corrosion et voir si le motif est intact.
5. Laver soigneusement le stratifié avec de l'eau, et enlever le revêtement avec de l'acétone et de l'éthanol dans la hotte chimique. Laver une fois de plus, et doucement sécher le stratifié avec une serviette en papier.
6. Fixez avec précaution le stratifié avec des électrodes à un gladiapositive ss (75 x 25 mm, ~ 1 mm d'épaisseur), en utilisant du ruban adhésif double face. Éviter les poches d'air.
7. Fixer un film de perfluoroalkoxy PFA pour les électrodes à l'aide de ruban adhésif. Cela sert à éviter tout contact accidentel des électrodes avec la goutte, ce qui endommage les électrodes supérieures en raison de court-circuit.

4. L'interface électronique (circuit de la figure 2)

1. Souder les relais et les condensateurs C à une carte de circuit universel.
2. Assemblez le reste des 10 pilotes relais sur une planche à pain sans soudure pour circuits électroniques.
3. Fil d'entrée de chaque conducteur de relais à un canal dans le panneau de contrôle.
4. Casser délicatement les électrodes supérieures dans un connecteur (Figure 3). Fil de sortie de chaque commande de relais à une électrode supérieure, comme représenté sur la figure. Notez qu'il ya un contact du connecteur à la terre entre une paire de fils de relais, pour réduire le bruit électrique.
   REMARQUE: Le connecteur se trouve sur une plate-forme réglable pour contrôler til distance (0,1-0,5 mm) entre le substrat (suie-plaqué) haut et en bas.
5. Utilisez un programme pour contrôler le calendrier pour haute tension (HT) application (environ 0,8 sec) pour 4 électrodes en même temps, en déplaçant une électrode dans la direction du mouvement (par exemple, pour 0.8 sec, actionner 1234, puis 2345, 3456, etc. ., 0,8 sec pour chaque groupe, puis vers l'arrière, se déplace de façon gouttelettes dans la direction opposée aussi bien).

5. Visualisation des gouttelettes et la manipulation

1. Pour enregistrer le mouvement des gouttelettes, en utilisant le système de visualisation, qui est composé d'un 24X - Ensemble de grossissement 96X associé à une caméra CCD. Connectez le magnétoscope à la caméra en utilisant S-vidéo.
2. Introduire à la pipette une goutte 4 pl contenant C. elegans dans un milieu sur le fond du substrat revêtu de la suie.
3. Apportez les électrodes supérieures à ~ 0,3 mm au-dessus de la gouttelette. La goutte doit être proche de la moyenne, juste en dessous de la cinquième électrode, pour faciliter l'opération.
4. Tournez sur l'interface électronique et haute tension (500 V _RMS), et régler la distance d'électrode supérieure de la gouttelette jusqu'à ce qu'il commence à se déplacer. Ne laissez pas les électrodes supérieures touchent la gouttelette.
5. Recueillir des données en enregistrant le nombre de transferts de gouttelettes de succès sur le dispositif en réponse à des impulsions électriques. Un essai réussi est caractérisé par au moins 700 transferts de gouttelettes, soit un transfert après chaque impulsion électrique.
6. Recueillir des données en continu, jusqu'à ce que la goutte ne bouge pas en réponse à 5 à 10 impulsions.
   NOTE: Lorsque la surface commence à se dégrader, le mouvement pourrait être rétablie en mettant les électrodes supérieures proche de la gouttelette.

Résultats

Auparavant, nous avons utilisé les appareils de terrain-DW pour permettre le mouvement des protéines dans le DMF. En particulier, les gouttelettes avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) peuvent être déplacés à une concentration 2000 fois plus élevée que celle rapportée précédemment par d'autres auteurs (sans additifs). Cela était dû à l'interaction réduite entre gouttelettes et surface; La figure 4 montre une gouttelette contenant étiquetées par fluorescence BSA (voir Freire et al ⁹...

Discussion

L'étape la plus critique de ce protocole est la protection de la couche de suie, directement associée à la réussite dans les gouttelettes en mouvement. Métallisation de la couche de suie (méthode 1 ci-dessus) permet à près de 100% de réussite de la fabrication. Toutefois, la durée de fonctionnement maximale est d'environ 10 min; éventuellement, les fractions sont gouttelettes mouillent la suie à travers des trous dans la couche de métal. Le revêtement de la couche de suie avec le liquide fluoré est l'alterna...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
		à la paraffine	N’importe quelle bougie à la paraffine
Système de pulvérisation Denton	Vacuum, Moorestown, NJ		Etude de pulvérisation Desk V HP équipé d’une cible Au.  ;
1-dodécanéthiol	Sigma-Aldrich	471364
Téflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Liquide fluoré : Préparez la résine téflon-AF dans le Fluorinert FC-40, 1:100 (p/p), pour créer le revêtement hydrophobe.
Logiciel de conception graphique -Adobe Illustrator	Adobe Systems		D’autres logiciels peuvent également être utilisés.
Dupont	LF9110		de cuivre
	Xerox	Phaser 6360 ou similaire	Vérifiez la compatibilité avec « noir riche » ou « noir d’enregistrement » (voir texte).
Cuivre Etchant	Transene	CE-100
Film perfluoroalcoxy (PFA)	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 ou similaire	Assez grand pour permettre l’assemblage de 10 pilotes.
Carte de circuit universel	Allied Electronics	70219535 ou similaire
Connecteur	Allied Electronics	5145154-8 ou similaire
Carte de commande et programme de commande (logiciel LabView)	National Instruments	NI-6229 ou similaire
Amplificateur haute tension	Trek	PZD700
Condensateurs C et C1, 100 nF, 60 V	Allied  ;
8817183 Transistor T, NPN	Allied  ;
Diode D, 1N4007	Allied  ;
2660007 Relais  ;	Alliés  ;
Système de visualisation	Edmund Optics	VZM 200i ou similaire	Grossissement du système 24X – ; 96X. Il est combiné avec une caméra couleur CCD Hitachi KP-D20B 1/2 po.
Enregistreur	Sony	GV-D1000 NTSC ou similaire	Il est relié à la caméra par un câble S-vidéo.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4