Article de méthode

La ligature très efficace de petites molécules d'ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

DOI :

10.3791/52095

⸱

18 novembre 2014

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microARN (miARN) sont une classe de molécules régulatrices largement conservée. Nous décrivons ici une méthode de clonage de miARN qui repose sur deux étapes de ligature puissantes suivies d’un séquençage à haut débit. Notre méthode permet une quantification précise des miARN à l’échelle du génome.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les miARN clonage et le séquençage à haut débit, appelés miR-Seq, représente à elle seule une approche transcriptome à l'échelle de quantifier miARN avec une résolution d'un seul nucléotide. Cette technique de fixation par capture miARN adaptateurs 3 'et 5' des molécules oligonucléotidiques miARN et permet la découverte de novo miARN. Couplage avec puissantes plates-formes de séquençage de nouvelle génération, miR-Seq a joué un rôle dans l'étude de la biologie des miARN. Cependant, des biais importants introduits par oligonucléotides étapes de ligature ont empêché miR-Seq d'être utilisé comme un outil de quantification précise. Des études antérieures montrent que les biais dans les méthodes miR-Seq actuelles conduisent souvent à inexacts quantification miRNA avec des erreurs jusqu'à 1000 fois pour certains miARN 1,2. Pour résoudre ces biais conférées par la ligature de l'ARN, nous avons mis au point une méthode de ligature petit ARN qui conduit à l'efficacité de ligature de plus de 95% pour les 3 'et 5' des étapes de ligature. Analyse comparative de cette improuvé méthode de construction de bibliothèques utilisant miARN synthétiques équimolaires ou différentielle mixtes, donne constamment lit numéros avec un écart de moins de deux fois de la valeur attendue. En outre, cette haute efficacité méthode miR-Seq permet précise l'échelle du génome miRNA profilage à partir d'échantillons d'ARN totaux in vivo 2.

Introduction

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Méthodologies basées séquençage haut-débit ont été largement appliquées à de nombreux échantillons biologiques au cours des dernières années d'expansion grandement notre compréhension de la complexité moléculaire des systèmes biologiques 3,4. Cependant, la préparation des échantillons d'ARN pour le séquençage à haut débit donne souvent des biais spécifiques inhérentes à la méthodologie employée, ce qui limite l'utilité potentielle de ces techniques puissantes. Ces méthodes spécifiques biais ont été bien documentés pour les préparations à base de bibliothèque ligature, petit-ARN 1,2,5,6. Ces préjugés se traduisent par 1000 fois la variation de lit nombre de miARN synthétiques équimolaires, ce qui rend l'inférence de miARN abondance de données de séquençage sauvagement variable et sujette à l'erreur.

Les études portant sur ​​les propriétés de la T4 ligase d'ARN de phages dérivés ont démontré que les enzymes présentent préférences fondées nucléotides 7, qui se manifestent bibliothèques comme biaisés dans des expériences de séquençage à haut débit 1,2,8. Afin de minimiser les distorsions conférées par des ligases d'ARN, plusieurs stratégies ont été employées; macromoléculaire encombrement 9, randomiser la séquence nucléotidique de l'adaptateur qui est à proximité du site de ligature 6, et en utilisant des concentrations élevées de ligature adaptateur 2. Grâce à une combinaison de ces trois approches, nous avons développé un flux de travail pour la préparation impartiale de petites bibliothèques d'ARN compatibles pour le séquençage à haut débit (Figure 1). Pour les comparaisons directes entre les protocoles actuels et notre méthode optimisée, se il vous plaît vous référer à notre récent rapport 2. Cette méthode donne des efficacités optimisé de ligature de plus de 95% à la fois en 3 'et 5' et des mesures permettant la ligature sans biais de petites molécules d'ARN à partir d'échantillons biologiques et de synthèse 2.

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Protocole

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NOTE: Il est essentiel de maintenir des conditions RNase-free pendant toute la procédure.

1. adénylation de 3 'Linker

  1. Diluer l'ADN oligonucléotide conçu pour les réactions 3 'de ligature à 100 um dans la nucléase-free H 2 O.
    NOTE: L'oligonucléotide doit avoir un 'groupe phosphate, un dinucléotide randomisée en 5' 5 extrémité, et un '3 didésoxycytosine. Le groupe 5 'phosphate est une exigence de l'enzyme efficace pour Mth 5' 10 adénylation. Le phosphate peut être ajouté par un pré-traitement de l'oligonucléotide avec une polynucléotide-kinase, ou commandé par la modification directement. Le dinucléotide randomisée à l'extrémité 5 'est important pour minimiser la préférence de l'ARN ligases qui présentent pour certaines extrémité de jonction bout-réactions sur les autres six séquence. La 3 'didésoxycytosine place un élément de blocage à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide to inhiber la formation de concatémères-linker lieur au cours des étapes ultérieures de ligature et sert également à bloquer l'extrémité de la molécule miARN-groupe de liaison formé à l'extrémité de l'extrémité 3 'de la 3 réaction de ligature 11. La séquence oligonucléotidique de liaison choisi pour le procédé de miR-Seq impartiale est la suivante: 4 5'PO NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3.
  2. Monter la réaction suivante d'adénylation: 200 pmol 3 'de l'oligonucléotide lieur, 4 pl 10x 5 "tampon d'ADN adénylation, 4 pi de 1 mM d'ATP, 4 ul Mth ARN ligase, sans nucléase H 2 O à un volume final de 40 ul.
  3. Incuber la réaction à 65 ° C pendant 1 heure. Mettre fin à la réaction par chauffage à 85 ° C pendant 5 min.
  4. Précipiter lieur polyadénylé par l'addition de 2,5 volumes d'éthanol à 100% et 1/3 volume de 10 M d'acétate d'ammonium pour éliminer l'ATP résiduel et pour éviter des ligatures imprévus dans les réactions ultérieures.
    1. En bref, mélanger le alalcool, des sels, et une solution d'oligo jusqu'à homogénéité, tournant à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse (~ 15 000 x g) à 4 ° C pendant 20 min. Laver le culot dans 70% d'éthanol, l'air sec, et remettre en suspension dans le volume approprié de la nucléase-free H 2 O pour donner 50-100 uM d'oligo adénylé.
  5. Confirmer adénylation en exécutant un gel de polyacrylamide à 18%.
    1. Préparer le gel en mélangeant les ingrédients suivants ensemble: 6,3 g d'urée, 6,75 ml de 40% d'acrylamide, et de 1,5 ml de TBE 10x. Ajouter H 2 O à 15 ml.
    2. Mélanger jusqu'à dissolution complète de l'urée et ajouter 150 ul de 10% (p / v) de persulfate d'ammonium (APS) et 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED).
    3. Une fois que le gel a mis, avant-course pendant 30 min à 24 V / cm de largeur de gel avec TBE 1x tampon fonctionnant à température ambiante. Une fois 30 min est au ras des puits avec du tampon en cours d'exécution.
    4. Mélanger 5 pmoles d'oligonucléotides et polyadénylé avec un volume égal de 2x tampon de dénaturation de l'ARN de chargement (95% (v / v) de formamide,0,02% (p / v) de SDS, 0,02% de bleu de bromophénol (p / v), 0,01% (p / v) Xylène Cyanol, EDTA 1,0 mM), de la chaleur brièvement à 75 ° C et refroidi sur de la glace par encliquetage. Distribuer ensemble de l'échantillon dans le puits du gel. Comprennent également un montant identique de contrôle non-adénylé, et les normes de taille de faible poids moléculaire.
    5. Exécuter le gel à 24 V / cm jusqu'à ce que le bleu de bromophénol est ¾ du chemin vers le bas du gel. Démonter appareil, gel post-tache avec une solution SYBR-or 1x 1x en TBE et de visualiser sur la boîte transilluminateur UV (Figure 2).
      REMARQUE: Gel purifier l'oligo adénylé d'une manière similaire à celle décrite ci-dessus, si «aucun ARN de départ" commandes se traduisent par une grande quantité de produit de PCR par comparaison à des échantillons avec de l'ARN d'entrée.

2. Linker ligature à l'extrémité 3 'de miARN

  1. 3 'Ligation
    1. Assembler les éléments suivants sur la glace dans l'ordre indiqué: 1,0 ul de 50% (p / v) de PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x tampon d'ARN ligase (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de MgCl2, 10 mM de DTT), 1,0 pi polyadénylé en 3 'Lieur (100 pM), un inhibiteur de la RNase 0,5 ul, 0,5 à 8,0 ug d'ARN total, 0,5 ul d'ARN ligase de T4 2, sans nucléase H 2 O à un volume final de 5 ul.
    2. Mélanger la réaction par pipetage de la solution est trop visqueuse pour vortex dû à la forte concentration de PEG 8000. Une fois intimement mélangé, placer la réaction dans un cycleur thermique à couvercle chauffé. Régler le bloc à 16 ° C, et on incube pendant 4 heures.
      REMARQUE: La réaction peut être réduite jusqu'à un volume final de 20 ul, sans aucune perte d'efficacité de ligature. Réagir pendant 4 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C pour obtenir l'efficacité de ligature sensiblement identiques.
  2. Gel Purification
    1. Après 3 'ligature, mélanger la réaction avec un volume égal de tampon de charge 2x ARN. Chauffer à 70 ° C pendant 5 min, et enclenchez refroidir sur glace.
    2. Exécuter l'échantillon sur un gel de Polyacrylamide à 15% pour PAGE purification.
      1. Préparation d'un gel de polyacrylamide à 15% contenant 7 M d'urée, d'une manière similaire à celle décrite précédemment à l'étape 1.5.
      2. Pré-exécuter le gel à 24 V / cm de largeur de gel pendant au moins 30 min. Coupez l'alimentation, rincer les puits, échantillon de charge et gel de course à même tension que pré-terme.
      3. Chargez l'échantillon et exécuter la page jusqu'à ce que le bleu de bromophénol vient juste de sortir le gel. Le produit désiré va migrer à proximité de la cyanol de xylène.
  3. La coloration, la visualisation et l'excision
    1. Démonter appareil de gel et gel de lieu dans le bac propre avec 1x courir tampon (TBE), 1x SYBR-or, et le rock pendant 15 min.
    2. Retirer le gel de plat coloration et de visualiser sur la boîte de transilluminateur UV recouvert d'une pellicule de plastique propre. Le produit de ligature doit être d'environ 45 nucleotides de longueur.
    3. Exciser la région contenant le produit de ligature avec un Razo proprelame de r et dans 0,5 ml tube de micro-centrifugeuse.
  4. Isolement du produit et des précipitations
    1. Pierce bas de 0,5 ml Tube à centrifuger avec une aiguille 30 G et placer le tube percé dans un second propre, à faible rétention, 1,5 ml microtube. Centrifugeuse pendant 5 min à ~ 15 000 x g.
    2. Visuellement confirmer que la tranche de gel entière est passée à travers le trou dans le tube intérieur. Si nécessaire, utilisez une pointe de pipette propre à pousser certains fragments de gel plus près du trou.
    3. Jeter le tube vide de 0,5 ml et ajouter 400 ul de tampon de colonne riche en sel (NaCl 400 mM HSCB, Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, 0,1% de SDS) à la suspension de l'acrylamide. tube (s) de Rock à 4 ° C pendant la nuit.
    4. Transfert suspension à une colonne d'acétate de spin de 0,22 micron de cellulose à l'aide d'une pipette de gros calibre. Centrifuger pendant 3 min à la température ambiante à ~ 15 000 x g pour recueillir tout liquide loin de la matrice de gel d'acrylamide.
    5. Transférer le liquide à une faible rétention de nettoyage, le tube de 1,5 ml contienttion 1 ul de 20 mg / ml de glycogène. Ajouter un volume égal d'isopropanol et 1/10 volume d'acétate de sodium. Mélanger la solution par inversion de tubes à plusieurs reprises avec le précipité dans le congélateur à -80 ° C pendant 20 min.
    6. Centrifugeuse à pleine vitesse à 4 ° C pendant 20 min pour sédimenter l'acide nucléique. Retirer le surnageant et laver à l'éthanol à 70%. Air culot sec pendant 10 min à température ambiante et procéder directement à 5 'étape de ligature.

3. Linker ligature à extrémité 5 'de miARN-3' Linker hybride

  1. Pour un acide nucléique granulés, ajouter les composants suivants: 2 ul de PEG 8000 (50% p / v), 0,5 pi de tampon de ligase ARN 10x, 0,5 pi d'ATP (10 mM), 0,5 pi de N, N-ARN oligo (100 uM), et H 2 O pour un volume final de 4 pl.
    REMARQUE: La composition de la 'NN-ARN oligo' est comme suit 5'-didésoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 inversé "et a été purifié par HPLC par le fabricant.
  2. Mélangercet échantillon par aspiration et à plusieurs reprises vers le bas. Pour ce faire, pendant un certain temps (jusqu'à 5 min) pour s'assurer que la pastille a été complètement re-solubilisé. Si re-solubilisation est problématique, faire chauffer l'échantillon brièvement (3-5 min) à 37 ° C et reprendre pipetage pour mélanger.
  3. Une fois la pastille est de retour dans une solution, transférer le contenu d'un tube de PCR propre contenant 1 ul d'un mélange 1: 1 d'inhibiteur de RNase et T4 ARN ligase 1 (5 unités). Encore une fois mélanger par aspiration et refoulement.
  4. Incuber la réaction dans un thermocycleur à 37 ° C pendant 4 heures. Procéder immédiatement à la synthèse de l'ADNc.

4. Transcription inverse / de synthèse d'ADNc

  1. Ajouter les éléments suivants à l'extrémité 5 'la réaction de liaison: 2 pl de tampon 5x RT, 0,75 ul de 100 mM de DTT, 1 pi Illumina RT amorce 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 uM), et 0,5 dNTP ul (10 mM).
  2. Mélanger par pipetage et de la chaleur à 65 ° C pendant 5 min. Puis refroidir lentement sur le banc top.
  3. Une fois que la réaction est refroidie à la température ambiante, placer le tube sur la glace et ajouter 0,5 pi de chaque enzyme de la transcriptase inverse et un inhibiteur de RNase. Mélanger par pipetage et dans cycleur thermique pour l'étape d'extension est indiqué dans les instructions du fabricant.
  4. Après ajout total de 5 ul sans nucléase H 2 O pour amener le volume final de la banque d'ADNc à 15 ul.

5. Bibliothèque Préparation

  1. Pour l'indexation PCR, assembler la réaction suivante sur la glace: 6 pi de 5x Phusion tampon, une dNTP ul (10 mM), 0,9 pi de DMSO, 0,75 pl amorce 5 '(25 pM), 0,75 pl amorce 3' (25 pM), 3 pl de bibliothèque d'ADNc (concentration variable en fonction du montant de l'entrée), 0,5 pi de polymerase Phusion (1 unité), sans nucléase H 2 O à un volume final de 30 ul. Des séquences d'amorce à assurer la compatibilité avec la matrice et la plate-forme de séquençagechoix.
    1. Exécuter la réaction de PCR avec les paramètres suivants: dénaturation initiale à 98 ° C pendant 3 min, pour les 4 premiers cycles, dénaturation à 98 ° C pendant 15 sec, recuit à 50 ° C pendant 15 s, extension à 72 ° C pendant 15 sec .
      REMARQUE: En fonction de la quantité de la matière d'entrée, varier le nombre total de cycles de PCR. Typiquement, pour une entrée de 1-2 pg d'ARN total, 13 cycles de PCR totaux sont suffisantes pour générer la bibliothèque miR-Seq.
    2. Effectuer des cycles ultérieurs, par exemple des cycles de 5 à 12, de manière à deux étapes où les cycles de recuit et d'extension sont combinées et réalisées à 70 ° C pendant 30 sec et la dénaturation est de nouveau à 98 ° C pendant 15 s.
      REMARQUE: Le volume de réaction est de 30 pi pour permettre une pause le programme PCR et supprimer une aliquote de 10 pi au nombre de cycles pré-déterminé à suivre pour l'apparence de produit désiré. En règle générale, les cycles 10, 13, et 16 sont choisis pour l'essai d'un échantillon d'ARN total.
  2. Préparerun gel non dénaturant d'acrylamide à 8% en mélangeant 2 ml de 40% d'acrylamide, 1 ml de TBE 10X, et H 2 O à 10 ml. Puis ajouter 100 ul de 10% d'APS et 10 pi de TEMED. Verser gel et laisser l'ensemble.
    1. Pré-exécuter le gel à 12 V / cm de largeur de gel pendant 30 min. Rincer les puits. Ajouter 1 pi de 10 x tampon de charge (15% de Ficoll-400 mM, EDTA 66 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (p / v) de SDS, 0,01% (p / bleu v) de bromophénol), ajouter 10 ul de échantillon dans chaque puits de dimensions 5 mm x 1 mm x 15 mm. Typiquement, chaque bien peut charger jusqu'à 30 pi d'échantillons. Exécuter le gel de l'échantillon à 10 V / cm de largeur sur gel dans du tampon TBE 1x jusqu'à ce que le colorant bleu de bromophénol passe juste en dehors de la partie inférieure du gel.
    2. Colorer et visualiser gel comme décrit dans l'étape 2.3.
    3. L'excision de la bande de 146 paires de base et éluer la nuit dans 0,25 ml de HSCB d'une manière similaire à ce qui est décrit dans la section 2.4. Précipiter l'ADN dans un volume égal d'isopropanol et 1/10 volume d'acétate de sodium. Laver le culot dans 70% eTHANOL et remettre en suspension dans un tampon TE.
    4. Quantifier la bibliothèque à l'aide PicoGreen selon les recommandations du fabricant.

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Résultats

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Les résultats attendus pour la méthode précédente doivent d'abord être l'observation d'un seul changement de nucléotide (augmentation) de la taille de l'oligonucléotide d'ADN qui a été soumis à adénylation par Mth ARN ligase (Figure 2). Suite à 3 'ligation, la visualisation du gel d'acrylamide montre (voir figure 3) des bandes de poids moléculaire élevé tranchants de poids évidents dans la région de 100 à 300 nucléotides du gel. Ceci indique que l'échantillon d'ARN total utilis...

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Discussion

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La méthodologie décrite ici fait usage de plusieurs variables clés pour maximiser l'efficacité de la ligature, à savoir de fortes concentrations de PEG, l'utilisation de linkers randomisés, et une forte concentration de linkers 2,6,9. Cette approche permet aux bibliothèques de séquençage fiable quantitatives à partir d'échantillons d'ARN total 2. Nous avons effectué plusieurs titrages d'ARN d'entrée et avons conclu que la méthode précédente est le mieux adapté pour le total ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Yi, en particulier Zhaojie Zhang pour les discussions fructueuses concernant la conception des linkers et l’efficacité de la ligature, ainsi que l’American Cancer Society pour avoir soutenu ce travail par le biais d’une bourse postdoctorale (#125209) à J.E.L. La recherche rapportée dans cette publication a également été soutenue par le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01AR059697 (à R.Y.) et une bourse de recherche de l’Institut Linda Crnic pour le syndrome de Down. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3' Linker (5' phosphorylé, 3' bloqué)Integrated DNA Technologiescustom
5' LinkerIntegrated DNA Technologiescustom5' bloqué, HPLC purifié
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351SSpecialized pour la ligature d’adaptateurs d’ADN pré-adénylés
10x Tampon de ligature (sans ATP)Nouvelle-Angleterre BiolabsInclus avec M0351S
10x Tampon de ligature (avec ATP)New England BiolabsInclus avec M0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
Polyéthylène glycol (poids mol. 8 000)New England BiolabsInclus avec M0204L
Eau sans nucléaseAmbionAM9937Nous avons constaté que l’eau recueillie à partir d’un appareil de distillation est de qualité égale.
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III RT kitInvitrogen18080-051  ;
Kit PCR PhusionNew England BiolabsM0530S
Amorce Illumina RP1Technologiesd’ADN intégréesInformations sur la séquence disponibles auprès d’Illumina
Amorce RTIntegrated DNA Technologiessurla séquence disponibles auprès d’Illumina
Illumina index amorce(s)Technologies d’ADN intégréespersonnaliséesInformations sur la séquence disponibles auprès d’Illumina
40 % AcrylamideFisher ScientificBP14081
UreaSigma AldrichU6504
Persulfate d’ammoniumSigma AldrichA3678
Tétraméthyéthylènediamine (TEMED)Sigma AldrichT9281
2x Tampon de chargement d’ARN dénaturantNew England BiolabsInclus avec lames de rasoir M0351S
VWR55411-050
SpinX Centricontubes CostarCLS8161
Tubes microfuge à faible rétentionFisher Scientific02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
Kit d’adénylationNew England BiolabsE2610L
personnalisées Informations

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Ligation de petits ARNadaptateurs oligonucl otidiquesm thode miR Seqefficacit de ligation de l ARNpurification sur gelsynth se d ADNcr action en cha ne par polym rasemiARN synth tiques

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