Imagerie en direct d'Innate immunitaire et prénéoplasiques Interactions cellulaires L'utilisation d'un système d'expression / UAS inductible Gal4 dans des larves de poisson zèbre peau

Résumé

Etudier les premiers événements de la progression de cellules prénéoplasiques et l'interaction immunitaire innée des cellules est essentiel pour comprendre et traiter le cancer. Ici, nous décrivons une méthode pour induire une condition transformations de cellules epitheliales et de la formation d'image en temps réel de l'interaction subséquente immunitaire inné avec des cellules exprimant HRAS ^G12V cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre.

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour induire conditionnellement la transformation des cellules épithéliales par l’utilisation du système d’expression¹ de KalTA4-ER^T2/UAS inductible par le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) chez les larves de poisson-zèbre, et l’imagerie en direct subséquente de l’interaction des cellules immunitaires innées avec les cellules cutanées exprimant HRAS^G12V. Le système KalTA4-ER^T2/UAS est à la fois inductible et réversible, ce qui nous permet d’induire une transformation cellulaire avec une résolution temporelle/spatiale précise in vivo. Cela nous offre une occasion unique d’imager en direct comment les cellules prénéoplasiques individuelles interagissent avec les tissus de l’hôte dès leur émergence, puis de suivre leur progression ainsi que leur régression. Des études récentes chez des larves de poisson-zèbre ont montré une fonction trophique de l’immunité innée dans les premiers stades de la tumorigenèse^2,3. Notre système inductible nous permettrait d’imager en direct le début de la transformation cellulaire et la réponse ultérieure de l’hôte, ce qui pourrait conduire à des informations importantes sur les mécanismes sous-jacents de la régulation des réponses inflammatoires trophiques oncogènes. Nous discutons également de la manière dont on pourrait adapter notre protocole pour obtenir un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes ectopiques dans n’importe quel tissu d’intérêt.

Introduction

La prolifération d'une descendance des cellules prénéoplasiques au sein d'une feuille épithéliale ailleurs normal dépend fortement une interaction avec son micro. L'interaction avec son tissu hôte est susceptible d'être le principal facteur déterminant de savoir si une cellule prénéoplasique est en mesure d'établir un créneau clonale à développer en cancer complet soufflé. Malgré son importance dans le développement, cette phase initiale de la progression du cancer est inaccessible dans des systèmes modèles les plus couramment utilisés, in vivo.

Le poisson zèbre, Danio rerio, est un organisme modèle bien établi pour les études d'imagerie en direct en raison de sa transparence au cours du développement, la possibilité pour la manipulation génétique, et l'accessibilité des médicaments solubles dans l'eau. Des études récentes utilisant des larves de poisson zèbre d'un modèle, la surexpression de l'oncogène humain HRAS ^G12V pour transformer des cellules épithéliales, ont montré que la cellule hôte des signaux dérivés, en particulier H ₂ O ₂ à plomble recrutement de cellules immunitaires innées. Fait intéressant, les cellules immunitaires, les neutrophiles et les macrophages recrutés, se sont avérés avoir un rôle trophique pour soutenir la prolifération de cellules prénéoplasiques ^2,3.

Afin de comprendre les événements précoces de l'initiation et la progression tumorale ainsi que la contribution d'une réponse inflammatoire, il faut être en mesure à l'image de ces événements du point de temps le plus précoce,. Par conséquent, il est nécessaire de contrôler les transformations cellulaires d'une manière spécifique dans le temps et les tissus. Nous utilisons le système / UAS Gal4 qui a été adapté avec succès à partir de Drosophila ⁴ à exprimer conditionnellement l'oncogène humain HRAS ^G12V sous le contrôle du promoteur spécifique de la peau kératine 4 (krt4) ^5. La version modifiée de l'activateur transcriptionnel Gal4, à savoir KalTA4 ^6, permet l'expression de HRAS ^G12V sous le contrôle de la séquence d'activation en amont (UAS). Pour induire l'expression conditionnelle de l'activateur de transcription, KalTA4 a été fusionné au domaine mutant de liaison au ligand des récepteurs α d'oestrogène humain (ER ^{T2) 7} qui se lie spécifiquement le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) ^1. En l'absence de 4-OHT l'ER ^T2 est lié dans le cytoplasme par des protéines de choc thermique. Sur 4-OHT liant le choc thermique protéines dissocient, permettant une translocation nucléaire de KalTA4-ER ^T2 et l'activation subséquente de la SAMU gène d'intérêt ⁸ contrôlées (figure 1C, b). Comme ce système d'expression dépend de la présence de 4-OHT, l'expression de KalTA4 contrôlée d'un gène d'intérêt est réversible. Contrairement au système Cre-ER ^T2 / Lox, ce qui conduit à un événement de recombinaison irréversible, l'induction de l'activation de la transcription par KalTA4-ER ^T2 est réversible par addition ou enlèvement de 4-OHT.

Le protocole suivant allo ws une transformation conditionnelle des cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre et un contrôle ultérieur de l'interaction avec les cellules immunitaires innées par expression de la protéine fluorescente. Les méthodes de base employées dans ce protocole sont similaires à certaines techniques couramment utilisées au sein de la communauté de poisson zèbre ^9-13.

La production et l'utilisation combinatoire des lignées transgéniques avec la micro-injection de constructions transgéniques permet une approche transitoire seulement transformer des cellules individuelles d'une manière mosaïque. La perméabilité à l'oxygène de la peau embryonnaire et larvaire poisson zèbre soulève la possibilité pour time-lapse études d'imagerie en direct par microscopie à haute résolution de quelques heures à quelques jours. En outre, son accessibilité aux médicaments solubles dans l'eau permettra de futures études mécanistes et le suivi des événements biologiques cellulaires in vivo qui pourraient mener à une meilleure compréhension des premiers stades de développement du cancer.

_content "> Ce protocole peut être adapté pour effectuer l'expression du gène conditionnel dans ne importe quel tissu de l'intérêt chez les larves de poisson zèbre, d'une manière mosaïque. On peut également optimiser le réglage afin de vivre l'image des tissus plus profonds autres que la peau microscope.

Protocole

Les procédures expérimentales suivantes ont été effectuées en stricte conformité avec la loi de 1986 animaux (Scientific Procedures).

1. Préparation d'ADN plasmidique pour la microinjection

1. Purifier le plasmide pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP avec un kit de purification d'ADN plasmidique commerciale selon les instructions du fabricant et diluer l'ADN plasmidique à une concentration finale de solution stock de 100 ng / ul.
2. Linéariser la transposase contenant pT3TS plasmidiques / Tol2 ¹⁴ par digestion de restriction BamHI, en suivant le protocole du fabricant. Cette étape peut être prolongé pendant une nuit. Précipiter l'ADN linéarisé par une extraction au phénol / chloroforme, selon le protocole standard.
3. Transcrire in vitro l'ARNm de transposase à partir du plasmide linéarisé avec un kit de transcription commercial pour de grandes quantités d'ARN coiffée selon les instructions du fabricant, et diluer à aliquoteune concentration finale de solution stock de 100 ng / ul dans l'eau sans nucléase. Assurer la qualité de l'ARN purifié avec un natif 2.1% TAE (Tris 40 mM, acide acétique 20 mM, EDTA 1 mM) électrophorèse sur gel d'agarose (80 à 120 V). Stocker l'ARN à -80 ° C.

2. microinjection d'ADN plasmidique pour Transient expression génique

1. Préparer une plaque d'injection agarose pour maintenir les œufs fécondés pendant l'injection. Verser le liquide 3% d'agarose dans un plat de 90 mm de Pétri. Laissez refroidir agarose à 40-50 ° C et ajouter la micro-injection moule en forme coincée TU-1 au-dessus de l'agarose liquide. Après durcissement à température ambiante, laisser le reste agarose à 4 ° C pendant 30 minutes avant de retirer le moule. moules de micro-injection de magasin à 4 ° C et la réutilisation.
2. Préparer une aliquote de la solution d'injection. Effectuez les étapes suivantes sur la glace. Introduire à la pipette 1 pi d'ADN de plasmide (concentration finale de 10 ng / ul), 2 ul d'ARNm transposase (concentration finale de 20 ng / ul), 2pi de 10 mg / ul isothiocyanate de rhodamine B-Dextran, 2 pl de solution Danieau 5x (290 mM de NaCl, 3,5 mM de KCl, 2 mM de MgSO _4, 3 mM de Ca (NO _{3) 2,} 25 mM de HEPES, pH 7,6) à une volume final de 10 ul dans l'eau sans nucléase.
3. Préparer aiguilles des capillaires de verre borosilicate de 1 mm de diamètre contenant un filament intérieur en tirant le capillaire dans des directions opposées avec une micropipette extracteur. Utilisez le programme suivant: chauffer 530, tirer 200, la vitesse et l'heure 80 150.
4. Remplir une aiguille avec 2 pi de la solution d'injection (conservé sur de la glace). Éviter les bulles en retirant soigneusement la pointe de microloader tout en libérant la solution dans le capillaire. Cassez délicatement la pointe de l'aiguille avec une pince.
5. Réguler la taille de la goutte avec une pompe pneumatique pico. Mesurer le diamètre de goutte / volume (V = 4/3 πr ³⁾ et ajuster la taille de goutte avec un micromètre oculaire sous un stéréoscope diméthylpolysiloxane. Nous vous recommandons100 um, ce qui correspond à 0,5 nl. Ceci assure concentrations uniformes et reproductibles par chaque embryon injecté. Titrer la concentration injectée et ajuster pour chaque préparation de construction et le plasmide.
6. Placez les zygotes (figure 1A) obtenus d'un croisement de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^{G12V) 15} avec io006 Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg ¹⁶ dans les moules de la plaque d'injection par utilisation d'un pastette 3 ml. En attendant, continuez la pointe de l'aiguille d'injection pré préparé en diméthylpolysiloxane pour éviter la solution de sécher et la coagulation.
7. Injecter la chute mesuré au préalable (100 um correspondant à 0,5 nl) sous un stéréoscope à travers le chorion dans le blastodisque ^17, avant le premier clivage (figure 1A). L'injection dans le stade d'une cellule augmente le risque d'une distribution uniforme de l'ADN plasmidique et de l'ARN dans la masse des cellules en développement et la possibilité de transmission de lignée germinale. Il estnotable que l'expression de constructions tend à être plus souvent mosaïque.

3. conditionnelle cellules de la peau Transformation de 4-hydroxytamoxifène (4-OHT)

1. Transférer les embryons injectés dans la solution 0.3x Danieau et les garder à 28,5 ° C dans un incubateur. Retirer les oeufs non fécondés de l'antenne à l'étape de la sphère ^17. La co-injecté isothiocyanate de rhodamine B-dextrane peut être utilisé comme une injection sous-contrôle d'un stéréoscope fluorescent.
2. embryons de l'écran à 24 HPF (h après la fécondation) pour l'expression de eGFP cardiaque. Continuer d'élever CMLC: eGFP embryons de poisson zèbre positifs jusqu'à 72 HPF. Surveiller attentivement la qualité de l'eau (0.3x Danieau).
3. Retirez le chorion de ces embryons qui ne ont pas éclos avec une pince à 72 HPF. Piquez délicatement le chorion avec une pince et le séparer en utilisant l'autre. Sélectionner des embryons pour lysC: expression DsRed2 utilisant un stéréoscope fluorescente.
4. Ajouter 10 ul d'une 10 mMle bilan des (Z) -4-hydroxytamoxifène à 20 ml de solution 0.3x Danieau (concentration finale de 5 uM). Utiliser la solution induction 4-OHT pour une boîte de Pétri standard (90 mm) sur un lot de 40 à 60 embryons.
5. Transférer les embryons dans une nouvelle boîte de Petri contenant 20 ml de fraîchement préparé induction solution. 4-OHT doit être stocké et manipulé dans l'obscurité. Les premiers signes d'expression peut être détectée deux heures après l'induction départ. L'induction-étape peut être prolongé la nuit, en gardant à l'esprit que cellule initiale d'accueil: interactions cellulaires prénéoplasiques peut déjà se produire quelques heures après le traitement.

4. Montage et l'imagerie en direct de poisson zèbre larves

1. Préparer une boîte de Pétri de 60 mm en introduisant un trou d'un diamètre de 18-20 mm. Utiliser de la graisse silicone de haute vide pour couvrir et sceller le trou sur le fond extérieur de la boîte de Pétri avec un verre de 25 mm de couverture (figure 1B).
2. Préparez 1% à bas point de fusion (LMP) agarose. Gardez-en un tube de 1,5 mld'agarose LMP à 37 ° C dans un bloc chauffant.
3. Présélection Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; SAMU: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) larves pour la cellule de la peau verte fluorescente et d'expression DsRed2 positif innée des cellules immunitaires, sous un stéréoscope fluorescent. Anesthetize larves par addition de 1 ml de 0,4% tricaïne ¹⁸ à la solution 20 ml d'induction.
4. Transférer les larves présélectionnée avec une pastette dans l'agarose LMP liquide. Que les larves se enfoncer dans l'agarose LMP et de les transférer sur le verre de couverture (figure 1B). Orienter les embryons sous un stéréoscope. Les larves doivent être placés directement sur le verre pour réduire la distance de travail (jusqu'à 6 larves).
5. Couvrir l'agarose LMP avec le tricaïne contenant une solution d'induction après qu'il a durci (figure 1B flèche).
6. L'image de larves embarqué utilisant un fluorescent inversé, à balayage laser ou un disque de filature microscope confocal. Utilisez un 40X ou 63Xobjectif que les objectifs avec des distances de travail long permettent de se concentrer à travers l'ensemble de la larves.

Résultats

Zygotes d'un croisement entre Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 et Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg ont été recueillies 10-15 minutes après la fécondation (figure 1A) pour obtenir une cellule embryons au stade. Après injection, les embryons ont été soulevées jusqu'à 3 dpf, avant l'induction avec 4-OHT et le montage pour l'imagerie en direct (figure 1B). 2-6 heures après l'induction des embryons ont été placés soit montés sous un microscope à fluorescence inversé (figure 2A) ou d'un microscope inversé confocal (Figure 2B-C) et pour imager 2-3 h avec des intervalles de 1,5 min. Des cellules cutanées superficielles prénéoplasiques peuvent être identifiés par leur morphologie plus arrondie par rapport aux kératinocytes normaux, ainsi que l'émission de fluorescence verte de la membrane localisée eGFP-HRAS ^G12V. Domaines de l'imagerie ont été sélectionnés pour la co-localisation des cellules de la peau pré-néoplasiques et des cellules immunitaires innées (figure 2A tête de flèche). En raison de la rapide migprocessus de rationnement des neutrophiles les intervalles time-lapse ont été choisis pour être comprise entre 1 à 1,5 min avec Z pile tailles de pas de 0,7 à 1,7 um pour obtenir projections d'intensité maximale (figure 2, Vidéo 1). Il ya un large éventail de comportements qui peuvent être observés tout imagerie en temps réel: les neutrophiles migrent côté et sous les cellules pré-néoplasiques (figure 2C, vidéo 1), forment des contacts directs aux cellules (Figure 2B et C), enlever les restes de cellules pré-néoplasiques qui subissent apoptose (Vidéo 1), ou activement engloutir des parties de cellules prénéoplasiques (non représentées). Pour saisir le spectre entier des interactions, il est conseillé de suivre leurs comportements par imagerie time-lapse en direct.

Figure 1: Schéma de conditionnelle transformation des cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre. (A) Une image d'un zygote de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; LysC: DsRed2) poisson zèbre à 10 min après la fécondation (MPF). L'ovule fécondé est entouré par le chorion (tête de flèche). Le site d'injection est la blastodisque (astérisque), formé par des ruisseaux cytoplasmiques du jaune (flèche) qui définit le pôle animal de l'embryon. (B) Montage de larves de poisson zèbre. 60 mm boîte de Petri avec un trou de 18 à 20 mm (tête de flèche) qui est fermé hermétiquement par un couvercle en verre de 25 mm. Les larves de poisson zèbre sont immobilisés et monté sur le couvercle en verre de 1% agarose LMP. Solution 0.3x Danieau (flèche) contenant 5 uM 4-OHT est utilisé pour couvrir l'agarose LMP. (C) 4-OHT transformations de cellules superficielles de la peau. (A) de profil en coupe transversale schématique de la peau larvaire induite. La peau embryonnaire et larvaire est composé de deux couches de cellules épithéliales, des cellules d'une couche superficielle et une couche cellulaire basale de kératinocytes qui sont connectés à la membrane basale sous-jacente (BM). (B) L'expression transitoire système to induire un clone de cellules prénéoplasiques chez les cellules superficielles de la peau. KalTA4-ER ^T2 est exclusivement exprimée dans la couche la plus externe de la peau entraîné par le promoteur de krt4 (jaune). Expression mosaïque de KalTA4-ER ^T2 active UAS contrôlée (bleu) eGFP-HRAS ^G12V expression dans les cellules superficielles, conduisant à un clone de cellules pré-néoplasiques (vert). (D) Schéma du système d'expression transitoire. (A) la cassette Tol2 de la pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: vecteur d'expression utilisé eGFP transitoire (b) l'induction de l'expression conditionnelle activateur transcriptionnel.. KalTA4 est fusionnée au domaine de liaison au ligand mutant du récepteur oestrogène humain α (ER ^T2) qui se lie spécifiquement le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT). En l'absence de 4-OHT l'ER ^T2 est lié dans le cytoplasme par des protéines de choc thermique Hsp90 (). Lors de la liaison 4-OHT Hsp90 dissocie, permettant une translocation nucléaire de KalTA4-ER^T2 et l'activation subséquente de la SAMU contrôlées expression eGFP-HRAS ^G12V. Barre d'échelle A = 500 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 2: imagerie en direct de l'interaction des cellules immunitaires prénéoplasique et innée. (AC) Images d'un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) embryon, qui a été injecté avec pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP et transposase ARNm à une étape de la cellule. Les images ont été prises après six heures de 4-OHT induction (A) Vue latérale de la région de la nageoire caudale à 6 heures après le traitement, montrant des taches de eGFP-HRAS ^G12V exprimant cellules de la peau (flèche), et lysC:. DsRed2 + neutrophiles (flèche). (BC) des images représentatives taken d'un film confocale time-lapse, montrant neutrophiles (rouge) interactions avec eGFP-HRAS ^G12V exprimant cellules de la peau (en vert). (B) Une cellule prénéoplasique forme une extension filopodial court avec le neutrophile contact (flèche). (C) Les neutrophiles (rouge) est en contact étroit avec un clone de cellules de la peau prénéoplasiques (vert). La barre d'échelle dans A = 100 um; B / C = 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Vidéo 1 : Time-lapse imagerie en temps réel de l'interaction des cellules immunitaires prénéoplasique et innée. Time-lapse d'un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) embryon, injecté avec pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP et transposase ARNm à une étape de la cellule. Confocale film accéléré 6-9 hours après 4-OHT induction montrant lysC: DsRed2 + neutrophiles (rouge) interactions avec eGFP-HRAS ^G12V exprimant cellules de la peau (en vert). Neutrophiles migrent côté et sous les cellules pré-néoplasiques et enlever les restes d'une cellule prénéoplasique qui subit l'apoptose. Intervalles time-lapse de 1,5 min pendant 3 heures avec la pile Z tailles de pas de 1,3 um.

Discussion

Au cours de l'embryogenèse et le développement des larves, la peau du poisson zèbre embryonnaire est composé de deux couches épithéliales, la couche superficielle appelé périderme et une couche de kératinocytes basaux qui sont attachés à la membrane basale sous-jacente ¹⁹ (Figure 1C, a). Le protocole présenté ici décrit une méthode simple pour induire conditionnellement transformation de cellules prénéoplasiques dans la couche de peau superficielle de larves de poisson zèbre, et permet d'analyser l'interaction subséquente avec des cellules immunitaires innées par imagerie en temps réel. Les méthodes de base de notre protocole suivent techniques de poisson zèbre bien établies ^9-13, et notre protocole peuvent être facilement adaptés et modifiés.

Le promoteur de krt4 ⁵ utilisée ici entraîne KalTA4-ER ^T2 expression spécifiquement dans la couche la plus externe de la peau (figure 1C, b). Cependant, la porte d'entrée MultiSite modulairestratégie de clonage utilisée pour générer le krt4: KalTA4-ER ^T2 construction (figure 1D, a), offre la possibilité de cloner ne importe quel promoteur d'intérêt devant KalTA4-ER ^T2 dans une étape de clonage unique. Une adaptation de la méthode présentée dans ce document est donc possible pour la plupart des tissus et au cours de l'embryogenèse stades larvaires. La disponibilité des séquences de promoteur est par les présentes le facteur limitant. En outre, presque ne importe quel gène d'intérêt cloné derrière un UAS peut être surexprimé conditionnellement à différents stades de développement par l'utilisation de l'expression spatiale et temporelle contrôlée KalTA4-ER ^T2. Par conséquent, notre protocole peut être adapté pour effectuer l'expression du gène conditionnel dans un tissu d'intérêt pour larves de poisson zèbre, de manière mosaïque. On peut également optimiser le réglage afin de vivre l'image des tissus plus profonds tels que le foie ou le pancréas microscope.

Nous avons décrit une application utilisant le protocole qu'ilRe, de même, on peut surexprimer d'autres modulateurs de l'inflammation en utilisant ce protocole pour étudier la régulation des réponses inflammatoires, comme on peut facilement l'image neutrophiles en direct et les changements de comportement suivants macrophages l'induction et l'arrestation dans l'expression d'un modulateur inflammatoire candidat. En outre, le protocole adapté serait également bénéfique pour ceux qui veulent retracer le mouvement des cellules et le changement de comportement au cours des différentes étapes de la morphogenèse des tissus et la formation d'organes et, l'image enfin vivre l'interaction des interactions de cellules immunitaires innées avec d'autres lignées cellulaires spécifiques qui peuvent être ciblées par le système d'expression ^T2 / SAMU KalTA4-ER inductible.

Nous avons utilisé le vecteur de la pDestTol2CG Tol2kit de poisson zèbre ^20-23 qui contient une cmlc2: eGFP-pA cassette (figure 1D, a) qui permet la sélection ultérieure des embryons par fluorescentes vertes coeurs positifs comme un soilection marqueur ²⁰ qui simplifie le processus de dépistage de F0. Une insertion stable du gène flanqué de transposon dans le génome d'intérêt est facilitée par co-injection de l'ADN plasmidique avec l'ARNm transposase. La préparation d'ADN plasmidique et l'ARNm de transposase pour microinjection suit des protocoles standard. Cependant, une bonne intégration de la construction dans le génome dépend de la transposition à base de Tol2 ^14. Cela souligne l'attention particulière soit accordée à travailler sur de la glace dans des conditions stériles pour éviter les contaminations et les dégradations par RNases et DNases. Microinjection dans des embryons de stade unicellulaire est une technique robuste et bien établie pour le gain et la perte de fonction dans les études de ^9,10 poisson zèbre. Bien que une personne bien entraînée peut facilement injecter dans le jaune de plus de 1000 embryons dans une heure, l'injection dans le blastodisque (figure 1A, astérisque) nécessite plus d'expérience et de formation. Critique au cours de cette procédure is la manipulation de l'aiguille. L'aiguille doit être très mince pour pénétrer dans la cellule sans dommage et doit être rompu seulement sur sa pointe très conséquent. Il est important de contrôler régulièrement et mesurer la taille des gouttes au cours de l'injection pour assurer une injection uniforme dans chaque embryon. Manipulé avec soin, l'aiguille peut être utilisé pour faire tourner l'embryon. Ce est souvent nécessaire pour trouver le blastodisque et l'angle de pénétration optimal.

La concentration de l'ADN et l'ARNm transposase utilisée pour l'injection presque certainement une influence sur l'efficacité d'expression. Des doses plus élevées peuvent conduire à une plus grande proportion de cellules exprimant le transgène, mais avec des concentrations plus élevées d'ADN (> 50 ng / ul) et transposase ARNm (> 100 ng / ul) a également le potentiel d'effets toxiques parmi les embryons injectés ne se pose. Nous préférons l'utilisation de 10 ng / pl d'ADN et 20 ng / pl d'ARNm transposase pour l'injection, ce qui correspond à 50 pg d'ADN de plasmide et 100 pg d'ARN injecté par embryo. 100% des embryons injectés avec ces concentrations ne se développent normalement, et entre 40 à 70% montrent eGFP-HRAS ^G12V expression, après 4-OHT induction, en fonction de l'efficacité de l'injection dans la cellule unique. Parmi les embryons positifs nous trouvons normalement environ 30% qui ont de 1 à 10 clones, 40% qui ont de 10 à 50 clones et 30% ayant plus de 50 clones. Grâce à nos objectifs de recherche, nous privilégions l'utilisation d'embryons ayant moins de clones exprimant eGFP-HRAS ^G12V. Nous sélectionnons avec 10-50 embryons clones de nos expériences transitoires. Pour la génération de poissons fondateur transgénique, nous recommandons de ne sélectionner que les embryons à la fois avec le marqueur cardiaque positif eGFP et un grand nombre de clones positifs eGFP-HRAS ^G12V dans leur épiderme.

(Z) -4-hydroxytamoxifène subit une cis-trans (EZ) interconversion lorsqu'il est exposé à la lumière ^24. On a constaté que l'isomère cis (E) est inférieure 100x anti-oestrogénique que son homologue trans ^25,26. Exposure à la lumière doit donc être évité. La solution mère de 4-OHT dissous dans de l'éthanol peut être conservé à -20 ° C dans l'obscurité pendant une longue période de temps. Nous recommandons l'utilisation d'une boîte pour protéger les boîtes de Pétri de la lumière lors de l'induction du gène cible dans l'incubateur et le transport. Bien que le domaine de l'imagerie est très faible et l'exposition du 4-OHT à la lumière UV est réduite à un minimum, un échange constant de la solution d'induction toutes les 2 heures tout en imagerie sur des périodes de temps plus longues est recommandé de maintenir les niveaux d'expression maximales. 4-OHT perméabilise efficacement à travers le chorion et les couches les plus externes de la peau au cours de l'embryogenèse le poisson zèbre, donc elle peut induire l'expression de gène très rapidement. Nous pouvons facilement observer eGFP émissions après 2 h d'induction et il a été rapporté que les premiers signes d'expression du gène cible peuvent être observés après 1 heure et 3 heures plateau après traitement ^8. Les différences peuvent être dues à la différence de promoteur utilisé dans notre étude. Comme il a été previously rapporté que 4-OHT traitement dépend de la dose ^{de 8,27,} nous avons choisi d'utiliser la plus forte concentration de 5 uM d'atteindre des niveaux d'expression robustes et reproductibles dans notre approche transitoire. Cela devrait garantir que toutes les cellules portant le transgène vont induire l'expression du gène cible.

Il doit être pris en compte que le transitoire approche présentée ici pourrait conduire à des niveaux d'expression différents en raison de la possibilité de multiples événements aléatoires et d'insertion du génome. En outre, l'utilisation de l'ARNm de transposase dans le Tol2 fond transgénique de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 peut conduire à des transpositions potentiels du transgène UAS pouvant entraîner l'inactivation de gène ou d'interruption. Cependant, comme la méthode présentée ici représente une approche transitoire, la pré-sélection des embryons ultérieures de l'injection est obligatoire. De nombreux laboratoires ont trouvé que les séquences UAS ont tendance à être réduit au silence dans la descendance transgénique, donc dansjecting l'pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP construction dans Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 embryons pourrait ne pas être aussi efficace que l'injection d'un SAMU construction dans Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: GFP embryons). L'utilisation de la lignée transgénique stable Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2) croisé avec Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 permettra un suivi précis de ON / OFF cinétique de l'époque-dosage d'activation dépend du gène 4-OHT .

Une étape critique lors du montage de larves est le transfert dans l'agarose LMP et sur ​​la vitre de recouvrement (figure 1B). Il ya seulement un court laps de temps pour le liquide température agarose LMP qui permet un transfert sûr et l'orientation des larves présélectionné sans nuire le poisson soit par choc thermique ou de durcissement du gel. Les larves doit être orienté directement sur le verre de couverture afin de réduire la distance de travail pour l'analy microscopique ultérieureSIS. Comme cela peut être un facteur limitant lors de la microscopie le choix des objectifs appropriés est obligatoire. Une fois montée, la larve peut être maintenue en jours.

La conditionnalité du système de modèle présenté ici permet la transformation répétée par l'activation du 4-OHT du transgène. Le système d'expression dépend de la présence de 4-OHT et donc l'expression de KalTA4 contrôlée d'un gène d'intérêt est réversible (figure 1D, b). Contrairement au système Cre-ER ^T2 / Lox, ce qui facilite un génomique événement de recombinaison irréversible ^28, KalTA4-ER ^T2 / UAS peut être activé et désactivé lors de l'addition ou l'enlèvement de 4-OHT et ce potentiel d'induction répétée est un avantage de la technique sur le système ^T2 / Lox Cre-ER. Cependant, l'exigence d'un niveau constant de 4-OHT est une limitation si l'expérience doit être prolongée de quelques jours à quelques semaines.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(Z)-4-Hydroxytamoxifène	Sigma Aldrich	H7904	se diluer dans de l’éthanol et le stocker dans l’obscurité à -20  ; ° ; C
20X Objectif	Zeiss		20X/0.5 Ph2 &infin ;/0.17
40X Objectif	Zeiss		40X/1.2W Korr &infin ;/0.14-0.18
63X Objectif	Zeiss		63X/1.4 Oil Ph3 &infin ;/0.17
BamHI	New England Biolabs	R0136S
Microscope confocal	Zeiss		LSM 510 META
verre	VWR	631-0171	Diamètre 25 mm
Diméthylpolysiloxane	Sigma Aldrich	DMPSV
Dow Corning graisse silicone sous vide poussé  ;	Sigma Aldrich	MKBL4135V
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller	Sutter Instruments Co.	P-97	: chaleur 530, traction 200, vitesse 80 et temps 150
Stéréoscope fluorescent.	Leica		M205 FA
Kwik-Fill Capillaires en verre brosilicaté	World Precision Instruments	1B100F-4
Moule de micro-injection TU-1	Adaptive Science Tools	TU-1
Pointe de microchargeur	Eppendorf	930001007
Microscope	Zeiss		Axiovert 200
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion	AM1348
Eau sans nucléase	Invitrogen	AM9937
Pico pompe pneumatique	World Precision Instruments  ;	PV820  ;
Picopompe pneumatique	Warner Instruments	PLI-90A
pTol2-krt4 :KalTA4-ERT2 ; cmlc2 :eGFP			Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/Université d’Édimbourg
QIAprep Spin Miniprep Kit	Quiagen	27106
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma Aldrich	R8881 10	mg/&mu ; l dans l’eau
Stéréoscope	Leica		M80
Tg(lysC :dsRed2)nz50Tg			BMC Developmental Biology 7, 42, doi :10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS :eGFP-HRASG12V)io006			PloS One 5 (12), e15170, doi :10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaïne/MS-222	Sigma Aldrich	A5040
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
UltraPure Agarose à faible point de fusion  ;	Invitrogen	16520-050
Phénol ultra-pur : Chloroforme : Alcool isoamylique	Invitrogen	15593-031	25:24:1, v/v