PAD4 est une enzyme responsable de la conversion de la peptidyl-arginine en peptidyl-citrulline. La dérégulation de PAD4 a été impliquée dans un certain nombre de maladies humaines. Un test PAD4 basé sur la fluorescence, facile et compatible avec le haut débit, est décrit.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les modifications post-traductionnelles peuvent conduire à des états fonctionnels protéiques modifiés en augmentant les variations covalentes sur les chaînes latérales de nombreux substrats protéiques. Les queues d’histones représentent l’un des tronçons les plus fortement modifiés de toutes les protéines humaines. Il a été démontré que la peptidyl-arginine déiminase 4 (PAD4) convertit les résidus d’arginine en résidu de citrulline non codé génétiquement. Peu d’essais décrits à ce jour ont été faciles à utiliser avec une sensibilité satisfaisante. Ainsi, l’absence de dosages adéquats a probablement contribué à l’absence d’inhibiteurs non covalents puissants de PAD4. Nous y décrivons un nouveau test basé sur la fluorescence qui permet de surveiller l’activité de PAD4. Un analogue de substrat pro-fluorescent a été conçu pour lier l’activité enzymatique de PAD4 à la libération de fluorescence lors de l’ajout de la protéase trypsine. Il a été démontré que le test est compatible avec des conditions de criblage à haut débit et qu’il présente un fort rapport signal/bruit. De plus, le test peut également être effectué avec des lysats de cellules brutes contenant du PAD4 surexprimé.
Introduction
Un grand nombre de protéines de mammifères sont fortement modifiées par l'action d'enzymes suivant la biosynthèse des protéines par le ribosome. Ces modifications post-traductionnelles (MPT) peuvent augmenter considérablement la diversité fonctionnelle du protéome en changeant la taille, la charge, la structure et l'état d'oligomérisation (entre autres fonctions) de protéines 1-3. En conséquence, le changement de structure de la protéine peut avoir des conséquences physiologiques, tels que la dégradation des protéines, la différenciation cellulaire, la signalisation, la modulation de l'expression génique, et les interactions protéine-pr....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. PAD4 transformation, expression et la purification
- Pour PAD4 Transformation, transformer le plasmide pGEX contenant PAD4 TPS fusion dans E. chimiquement compétent Coli (BL21 (DE3)), les cellules pour l'expression de protéine en utilisant la procédure suivante. Préparer chimiquement compétente (chlorure de calcium) E. Coli (BL21 (DE3)), les cellules selon les protocoles standards.
- 50 ul de dégel préalablement préparée chimiquement compétente BL21 (DE3), les cellules sur de la glace et mélanger avec 1 ul du plasmide pGEX PAD4 contenant le gène dans un tube de culture de 5 ml. Incuber le mélange sur de la glace penda....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Dans un premier temps, il a été démontré que ZRcoum peut rendre compte de l'activité de PAD4 dans un format de plaque à 96 puits. Les puits ont été incubés avec la ZRcoum de substrat et en présence / absence de PAD4. Après une période d'incubation de 45 min à 37 ° C, la fluorescence a été mesurée avec un 340/40-475/15 nm filtre (figure 2A). Comme prévu, les niveaux de fluorescence sont restés faibles comme le fluorophore dans ZRcoum (ou la citrulline
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans ce contexte, un test basé sur la fluorescence a été mis au point avec succès pour surveiller l’activité de PAD4. Le test s’est avéré incroyablement robuste dans un certain nombre de conditions à haut débit et est également compatible avec les lysats de cellules entières37.
L’affinité entre les protéines d’histones et les brins d’ADN qui les entourent se relâche en raison de la neutralisation de la charge positive sur la chaîne latérale de l’arginine lors de la citrullination. I.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Lehigh University Start-up Package. Nous remercions le Dr Walter Fast d’avoir fourni le plasmide GST-PAD4 pour l’expression des protéines.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
http://www.perkinelmer.com
<<Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filtre
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com |
| Ampicilline Trihydrate (Poudre blanc cassé), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 ; | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| Tous les sels tampons ; | Fisher Scientific | Peut acheter auprès de Fisher Scieintifc ; VWR ; Acros ; Sigma-Aldrich ; etc. | |
| Protino Glutathion (GSH) agarose ; | Machery-Nagel | 745500.10 | Magasin à 4 ° ; C; http://www.mn-net.com/ |
| Chloroamidine ; | Cayman Chemical ; | 10599 | Magasin à -20 ° ; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com |
| Plaques Corning/Nunclon MicroWell (96 et 384) | Achat chez Corning ; Logiciel de lecture de microplaques Sigma-Aldrich | ||
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control | www.tecan.com | ||
Références
- Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
- Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
