Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

Résumé

in vitro des lymphocytes T et une coloration intracellulaire des cytokines – ont été utilisées pour mesurer la capacité de présentation de l jove_content’antigène des cellules dendritiques et les réponses des lymphocytes T spécifiques de l>'antigène à une infection mutante par le virus du Nil occidental chez la souris.

Résumé

Un virus atténué du Nil occidental (VNO), un non structurale (NS) 4B-P38G mutant, induite par les cytokines supérieur innée et réponses des lymphocytes T de type sauvage VNO chez les souris. Récemment, facteur de différenciation myéloïde 88 (MyD88) la signalisation se est avérée importante pour l'amorçage de cellules T initiale et le développement des cellules T mémoire pendant VNO NS4B-P38G infection mutant. Dans cette étude, deux méthodes de flux basés cytométrie-- in vitro des cellules T dosage dans l'amorçage et une cytokine coloration intracellulaire (ICS) - ont été utilisées pour évaluer les cellules dendritiques (CD) et les fonctions des cellules T. Dans la cellule T amorçage dosage, la prolifération cellulaire a été analysée par cytométrie de flux après co-culture de DC par les deux groupes de souris avec de l'ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) - marqué les cellules de souris transgéniques OTII T CD4 ^+. Cette approche a fourni une détermination précise du pourcentage de la prolifération des cellules T CD4 ⁺ est nettement améliorée avec sensibilité globale de la traditional dosages avec des réactifs radioactifs. Système de tube de microcentrifugation a été utilisé dans les deux procédés de culture de cellules et une coloration de la cytokine protocole ICS. Par rapport au système traditionnel à base de plaque de culture de tissu, cette procédure modifiée était plus facile à réaliser au niveau de la prévention des risques biotechnologiques (BL) 3 des installations. En outre, les cellules infectées WNV- ont été traités avec du paraformaldéhyde dans les deux essais, ce qui a permis une analyse plus poussée en dehors des installations BL3. Dans l'ensemble, ces tests in vitro immunologiques peuvent être utilisés pour évaluer efficacement des réponses immunitaires à médiation cellulaire au cours de l'infection par le VNO.

Introduction

Le virus du Nil occidental (VNO), un neurotrope, plus-détectées flavivirus, est une menace pour la santé publique émergents. Actuellement, aucun vaccin ont été approuvés pour usage humain ^1. Une souche atténuée VNO, qui a une substitution P38G dans le non structurale (NS) protéine 4B, est connu pour induire aucune létalité chez les souris, mais supérieur cytokines innées et les réponses des lymphocytes T chez les souris de type sauvage que le VNO NY99 souche ^2. Souris immunisées avec le mutant NS4B-P38G ont tous été protégés contre un défi secondaire avec de type sauvage létale VNO. Ceci suggère que le mutant NS4B-P38G a des caractéristiques appropriées pour un candidat vaccin idéal. Les mécanismes par lesquels le mutant NS4B-P38G induit haute immunité adaptative de protection ne sont pas encore clairement compris. Toll-like récepteurs (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires associés à des pathogènes, jouent un rôle essentiel dans le déclenchement de l'immunité innée à l'infection virale. La voie de signalisation de TLR de base utilise réponse différenciation myéloïde primaire geNE 88 (MyD88) comme carte principale ^3,4. Dans une étude récente, la signalisation MyD88 a été montré à jouer un rôle important dans le développement de l'immunité à médiation cellulaire au cours VNO NS4B- P38G infection chez la souris mutante ^5. Cellules dendritiques (CD) sont une des plus importantes cellules présentatrices d'antigène présentant la capacité unique d'initier les réponses des cellules T primaires lors de l'infection virale ^6,7. Lymphocytes T CD4 ⁺ et CD8 ⁺ contribuent tous deux à l'immunité protectrice de longue durée et sont importants pour la survie de l'hôte après-type sauvage infection par le VNO ^8,9. Deux dosages immunologiques ont été utilisés dans cette étude pour évaluer les fonctions de ces cellules chez les souris mutantes infecté NS4B-P38G.

Tout d'abord, un test d'amorçage de cellules T in vitro a été utilisé pour comparer la capacité de présentation antigénique des CD de type sauvage du VNO-infectés et MyD88 ^{- / -} souris. Pour augmenter la sensibilité du test, naïfs CD4 ^{+ cellules T ont été isolés à partir de OTII souris transgéniques, qui expriment une spécifique Vα2 / Vβ5 TCR pour l'ovalbumine de poulet (OVA) peptide 323 - ont été purifiés 339. PED de souris infectées par le VNO, et co-cultivées avec carboxyfluorescéine succinimidyl pâques (CFSE ) marqué à des cellules T CD4 + en présence de peptide OVA. Après 5 jours de co-culture, les cellules ont été récoltées et fixées avec du paraformaldehyde (PFA) et analysées par cytométrie en flux. Des dosages de prolifération ont été traditionnellement réalisée par incorporation de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) ou désoxyriboside de thymine tritiée (3 HTdr) 10. Néanmoins, ces tests sont soit radioactifs et / ou dans le besoin d'équipements spéciaux au niveau de biosécurité (BL) 3 des installations, où des études de VNO sont menées. L'analyse par cytométrie de flux de la prolifération des lymphocytes par division par deux en série de l'intensité de fluorescence du colorant vital CFSE est devenue plus couramment utilisé dans des essais immunologiques comme le colorant est plus stableet incorporé uniformément dans les cellules, facilement détectée par cytométrie de flux, et est non-radioactif 11. L'essai a également la possibilité d'évaluer le nombre de divisions cellulaires. Un avantage majeur de l'utilisation de ce test dans les études VNO est que la fixation des cellules infectées avec 1-2% PFA pourrait inactiver VNO 12, ce qui permettra l'acquisition de l'échantillon avec un cytomètre de flux dans un laboratoire de BL2.}

Ensuite, une procédure coloration de cytokine intracellulaire modifié (ICS) a été utilisé pour étudier le rôle de signalisation MyD88 dans la régulation de réponses des lymphocytes T spécifiques du VNO chez les souris mutantes infectées NS4B-P38G. Dans ce dosage, les splénocytes isolés à partir de souris infectées ont été traitées in vitro avec des peptides spécifiques VNO. Bréfeldine A a été ajouté à retenir les cytokines dans la cellule. Après 5 heures d'incubation, les cellules ont été récoltées, lavées et colorées pour des sous-ensembles de cellules T. Les cellules ont ensuite été fixées dans PFA, perméabilisées et colorées pour l'interféron (IFN) -γ et analysées par cytométrie en flux.Comme avec d'autres dosage à base de cytométrie en flux, une fois que les cellules sont traitées avec un tampon de fixation et perméabilisation contenant PFA, les échantillons infectés peuvent être transférés à un laboratoire de BL2 pour un traitement ultérieur et d'analyse. Dans plusieurs études publiées, nous avons utilisé ICS pour mesurer les fonctions T effectrices de cellules chez des souris infectées par le VNO ^13,14. Bien qu'il soit bien établi, un inconvénient majeur de ce test est que la procédure est très longue et pourrait être plus de temps lorsqu'il est effectué à l'intérieur des installations BL3. Ici, un procédé à base d'ICS tube de micro-centrifugeuse de se est révélé être plus facile, plus facile de procéder et moins de temps lorsqu'il est effectué dans un laboratoire BL3.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université du Texas Medical Branch.

1. Isolement des PED de souris non infectées et infectées par le VNO

1. Match de l'âge et le sexe 6-10 semaines-vieux, de type sauvage C57BL / 6 (B6) et MyD88 ^{- / -} souris. Inoculer par voie intrapéritonéale (ip) avec 500 unités formant des plaques (PFU) du VNO NS4B- P38G mutant. Au jour 3 après l'infection, euthanasier B6 et MyD88 ^{- / -} souris avec du CO _2. Utilisation des souris non infectées de deux groupes comme témoins. Utilisez trois souris de chaque groupe.
2. Fourrure mouillée sur le côté gauche de la souris sacrifiées en utilisant 70% d'éthanol et coupé la fourrure le long du côté gauche de la souris, à mi-chemin entre les jambes avant et arrière. Couper ouvrir la cavité du corps. Retirer la rate en utilisant les forceps. Placez la rate dans une boîte de Pétri avec du RPMI.
3. Isoler DC spléniques en utilisant des billes magnétiques anti-CD11c selonles instructions du fabricant.

2. Purification et d'étiquetage des cellules T de souris transgéniques OTII

1. Récolte une rate d'une souris OTII naïve comme décrit dans l'étape 1.2 ci-dessus et homogénéiser la rate entre les extrémités de deux diapositives givrées. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml, ajouter du milieu RPMI à 14 ml. Laissez la suspension reposer pendant 5 min et 13 ml de transférer à un nouveau tube de 15 ml conique.
2. Isoler les cellules T CD4 ⁺ spléniques en utilisant un kit T CD4 ⁺ d'isolement des cellules selon les instructions du fabricant.
3. des cellules de transfert dans un tube conique de 50 ml, rincer deux fois avec du PBS. Resuspendre les cellules dans du PBS avec 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) à 1 x 10 ⁶ cellules par ml, et ajouter 0,5 pmol / ml de CFSE. Incuber à 37 ° C pendant 10 min, à l'abri de la lumière.
4. Ajouter 5 ml de milieu complet froid (RPMI-1640 avec 10% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur, 1/100 voldes antibiotiques / antimycosiques, 1/100 en volume de L-glutamine et 1/1000 x 1000 vol de 2-mercaptoéthanol).
5. Incuber sur de la glace pendant 5 min. Laver les cellules une fois avec du PBS, fixent 0,2 x 10 ⁶ cellules T CD4 ⁺ marquées dans 2% de PFA et d'acquérir sur un cytomètre de flux. Utilisez cet exemple pour déterminer le niveau de base de CFSE. Re-suspendre le reste de cellules marquées dans un milieu complet.

3. Co-culture OTII cellules T avec DC de souris infectées par le VNO

1. Culture 2 x 10 ⁵ cellules T CD4 ⁺ purifiées de souris OTII seul ou avec PED purifiées de type sauvage ou MyD88 ^{- / -} souris (2 x 10 ⁴⁾ dans une plaque à 24 puits avec ou sans OVA résidus 323-339 (1 g / ml) dans 1 ml de milieu complet par puits.
2. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 jours. cellules de récolte, laver deux fois dans un tampon FACS (PBS avec 1% de FBS) et fixent dans 0,25 ml 2% PFA. Vortexer immédiatement.

4. cytométrie en flux in vitro </ Em> T Cell Amorçage

1. Pour l'acquisition, double-cliquez sur l'icône de la cytométrie de flux logiciel. Pour une parcelle de densité linéaire FSC-A vs SSC-linéaire A, sélectionnez canaux 0 à 200 000 sur FSC-A et de 0 à 200 000 le SSC-A. Ensuite, créez une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 1A).
2. Pour analyser l'intensité de fluorescence de CFSE, ouvrez l'histogramme pour le canal FL1 et d'acquérir 20 000 événements sur la population fermée. Mettre en place un marqueur sur des échantillons pour les cellules OTII cultivées seules (figure 1A).
3. Acquérir des échantillons de cellules OTII co-cultivées avec des DC de type sauvage (figure 1B) ou MyD88 ^{- / -} PED (figure 1C) d'une manière similaire.

5. Isolement et stimulation de splénocytes pour dosages de cytokines

1. Infecter B6 et MyD88 ^{- / -} souris avec mutant VNO NS4B-P38G en utilisant la même procédure que celle décrite dans ste1,1 p. Au jour 30 post-infection, nouveau défi souris survivantes avec 2000 UFP de type sauvage VNO souche ip Au jour 8 et 21 infection par le VNO post-primaire ou au jour 4 après l'infection secondaire, euthanasier les souris avec du CO ₂ pour la collecte des rates .
   NOTE: Nous avons utilisé 2-3 souris par groupe pour chaque point de temps.
2. Faire une suspension cellulaire unique de splénocytes comme décrit ci-dessus dans l'étape 1.2 et 2.2 étape. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et remettre en suspension dans 10 ml eux de milieu complet.
3. Diluer les cellules avec du milieu complet à 2,5 x 10 ⁶ cellules / ml. Ajouter 1 ml de splénocytes dans 1,5 ml d'un tube de micro-centrifugeuse.
4. Pour simuler les cellules T CD8 ^+, diluer NS4B et E peptides spécifiques de l'infection par le VNO (SSVWNATTA et IALTFLAV) à 1 mg / ml dans du DMSO. Pour la stimulation des cellules T CD4 ^+, diluer NS3 et E peptides spécifiques de l'infection par le VNO (RRWCFDGPRTNTILE et PVGRLVTVNPFVSVA) à 1 mg / ml dans du DMSO. Ajouter 10 ul de peptides aux cellules followed par une pi d'une solution Bréfeldine. Utiliser des cellules sans traitement des peptides comme témoins. Mélanger les cellules.
5. Poinçon deux trous avec une aiguille de 18 G dans le bouchon du tube. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 heures.

6. intracellulaire de cytokines coloration

1. cellules de transfert à un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Spin cellules pendant 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant. Ajouter 1 ml tampon FACS, rotation 5 min à 300-400 xg et remettre en suspension les cellules par pipetage avec 120 ul tampon FACS.
2. Ajouter 2 ul de Fc de blocage et incuber les cellules à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque tube. Spin 5 min à 300-400 x g.
3. Re-suspendre les cellules dans 300 pi FACS tampon et les diviser en trois tubes (environ 0,8 x 10 ⁶ cellules par tube). Comme le montre le tableau 1, se réserver le premier tube de chaque condition de culture de rat IgG-PE coloration. Pour le second tube, ajouter 3 ul d'anti-CD4 APC pour CD4 peptides cellules traitées, 3 μl d'anti-CD8 FITC à des cellules CD8-peptides traités à la fois des anticorps ou des cellules sans traitement des peptides. Utilisez le troisième tube d'indemnisation coloration. Pour chaque condition de culture, utiliser trois tubes de cellules colorées avec APC conjugué CD4, CD8 conjugué au FITC ou PE- anticorps marqués CD3 seul (3 pi par tube) que les contrôles de compensation pour FL1, FL2 et des canaux de FL4.
4. cellules Vortex brièvement. Laisser sur la glace pendant 20 min et protéger de la lumière. Ajouter 1,4 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant.
5. Agiter à perturber culot cellulaire (ou vortex brièvement). Re-suspendre culot cellulaire dans 250 pi de fixation / perméabilisation solutionby pipetage. Incuber à température ambiante pendant 20 min et à protéger de la lumière.
6. Ajouter 1,2 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans un tampon FACS 300 pi.
   NOTE: A ce stade, les cellules peuvent être transférés à un laboratoire BL2 pour un traitement ultérieur ou stocké dans un réfrigérateur et protégé de la lumière pour up à trois jours.
7. Ajouter 500 pi de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans 500 pi de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g.
8. Re-suspendre les cellules dans 100 ul 1x Perm / Wash, ajouter 3,5 pi anti-IFN-PE au tube précédemment ajouté avec des anticorps pour CD4 et ou marqueurs cellulaires / T CD8 à l'étape 6.3 et 3.5 pi rat IgG-PE dans le tube réservé pour le contrôle IgG pendant 25 min sur de la glace et de protéger de la lumière. Laver les cellules en ajoutant 1,4 ml de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g. Répétez l'étape de lavage en ajoutant 1,4 ml 1x tampon perméabilisation / lavage.
9. Spin 5 min à 300-400 xg et décanter surnageant. Laver les cellules par addition de 1,4 ml de tampon FACS et remettre en suspension dans 400 ul de tampon pour FACS pour l'acquisition finale.

7. cytométrie en flux de cytokine intracellulaire coloration

1. Utilisez les mêmes paramètres d'acquisition comme dans l'étape 4.1. Create une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 2A). Réglez les tensions en utilisant les tubes de rémunération pour chaque groupe.
2. Ouvrez deux nouveaux tracés de points, une pour afficher les données recueillies pour FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), et l'autre est d'afficher les données collectées pour FL4 vs. FL2 (vs CD4. IFN-γ). Acquérir 50 000 événements pour la population fermée de chaque échantillon.

Résultats

Dans l'essai d'amorçage des cellules T, les cellules T CD4 ⁺ marquées CFSE ont été cultivées avec des DC purifié à partir du type sauvage NS4B-P38G mutant infecté et MyD88 ^{- / -} souris en présence ou en l'absence de peptides OVA. Les cellules T cultivées seules marqués avec ou sans OVA pendant 5 jours ont été utilisés comme témoins négatifs. Comme le montre la figure 1A, les cellules T totaux ont été bloqués pour l'analyse de l'intensité de fluorescence sur le canal FL1. Le marqueu...

Discussion

VNO est un agent pathogène BL3. En raison des règlements de sécurité, les dosages immunologiques avec des échantillons de VNO-infectés sont souvent limités par la disponibilité de l'équipement au BL3 installations ou plus longue et fastidieuse à effectuer. Dans une étude récente, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la cytométrie de flux pour étudier les réponses immunitaires à médiation cellulaire lors de l'infection par le VNO ^5. Dans les deux essais, les cellules infectées par le VNO ont été...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640	Invitrogen	11875	échauffement à 37 ° ; C
billes magnétiques anti-CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001	suivre le fabricant s instructions
anti-CD4 billes magnétiques	Miltenyi Biotec	130-095-248	suivre le fabricant' s instructions
CFSE	Invitrogen	C34554
Résidu OVA 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptides	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A solution	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
CD4	conjugué APCe-Bioscience	17-0041-81
CD8 conjugué à la FITC	e-Bioscience	11-0081-82
Solution de fixation/perméabilisation	BD-Bioscience	554722
Tampon de perméabilisation/lavage	BD-Bioscience 554723
anti-IFN&gamma ;-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Cytomètre en flux Accuri	BD Bioscience