Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

Résumé

in vitro des lymphocytes T et une coloration intracellulaire des cytokines – ont été utilisées pour mesurer la capacité de présentation de l jove_content’antigène des cellules dendritiques et les réponses des lymphocytes T spécifiques de l>'antigène à une infection mutante par le virus du Nil occidental chez la souris.

Résumé

Un virus atténué du Nil occidental (VNO), un non structurale (NS) 4B-P38G mutant, induite par les cytokines supérieur innée et réponses des lymphocytes T de type sauvage VNO chez les souris. Récemment, facteur de différenciation myéloïde 88 (MyD88) la signalisation se est avérée importante pour l'amorçage de cellules T initiale et le développement des cellules T mémoire pendant VNO NS4B-P38G infection mutant. Dans cette étude, deux méthodes de flux basés cytométrie-- in vitro des cellules T dosage dans l'amorçage et une cytokine coloration intracellulaire (ICS) - ont été utilisées pour évaluer les cellules dendritiques (CD) et les fonctions des cellules T. Dans la cellule T amorçage dosage, la prolifération cellulaire a été analysée par cytométrie de flux après co-culture de DC par les deux groupes de souris avec de l'ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) - marqué les cellules de souris transgéniques OTII T CD4 ^+. Cette approche a fourni une détermination précise du pourcentage de la prolifération des cellules T CD4 ⁺ est nettement améliorée avec sensibilité globale de la traditional dosages avec des réactifs radioactifs. Système de tube de microcentrifugation a été utilisé dans les deux procédés de culture de cellules et une coloration de la cytokine protocole ICS. Par rapport au système traditionnel à base de plaque de culture de tissu, cette procédure modifiée était plus facile à réaliser au niveau de la prévention des risques biotechnologiques (BL) 3 des installations. En outre, les cellules infectées WNV- ont été traités avec du paraformaldéhyde dans les deux essais, ce qui a permis une analyse plus poussée en dehors des installations BL3. Dans l'ensemble, ces tests in vitro immunologiques peuvent être utilisés pour évaluer efficacement des réponses immunitaires à médiation cellulaire au cours de l'infection par le VNO.

Introduction

Le virus du Nil occidental (VNO), un neurotrope, plus-détectées flavivirus, est une menace pour la santé publique émergents. Actuellement, aucun vaccin ont été approuvés pour usage humain ^1. Une souche atténuée VNO, qui a une substitution P38G dans le non structurale (NS) protéine 4B, est connu pour induire aucune létalité chez les souris, mais supérieur cytokines innées et les réponses des lymphocytes T chez les souris de type sauvage que le VNO NY99 souche ^2. Souris immunisées avec le mutant NS4B-P38G ont tous été protégés contre un défi secondaire avec de type sauvage létale VNO. Ceci suggère que le mutant NS4B-P38G a des caractéristiques app....

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université du Texas Medical Branch.

1. Isolement des PED de souris non infectées et infectées par le VNO

1. Match de l'âge et le sexe 6-10 semaines-vieux, de type sauvage C57BL / 6 (B6) et MyD88 ^{- / -} souris. Inoculer par voie intrapéritonéale (ip) avec 500 unités formant des plaques (PFU) du VNO NS4B- P38G mutant. Au jour 3 après l'infection, euthanasier B6 et MyD88 ^{- / -} souris avec du CO _2. Utilisation des souris non infectées de deux groupes comme témoins. Utilisez trois souris de chaque groupe.
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Résultats

Dans l'essai d'amorçage des cellules T, les cellules T CD4 ⁺ marquées CFSE ont été cultivées avec des DC purifié à partir du type sauvage NS4B-P38G mutant infecté et MyD88 ^{- / -} souris en présence ou en l'absence de peptides OVA. Les cellules T cultivées seules marqués avec ou sans OVA pendant 5 jours ont été utilisés comme témoins négatifs. Comme le montre la figure 1A, les cellules T totaux ont été bloqués pour l'analyse de l'intensité de fluorescence sur le canal FL1. Le marqueu.......

Discussion

VNO est un agent pathogène BL3. En raison des règlements de sécurité, les dosages immunologiques avec des échantillons de VNO-infectés sont souvent limités par la disponibilité de l'équipement au BL3 installations ou plus longue et fastidieuse à effectuer. Dans une étude récente, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la cytométrie de flux pour étudier les réponses immunitaires à médiation cellulaire lors de l'infection par le VNO ^5. Dans les deux essais, les cellules infectées par le VNO ont été.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640	Invitrogen	11875	échauffement à 37 ° ; C
billes magnétiques anti-CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001	suivre le fabricant s instructions
anti-CD4 billes magnétiques	Miltenyi Biotec	130-095-248	suivre le fabricant' s instructions
CFSE	Invitrogen	C34554
Résidu OVA 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptides	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A solution	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
CD4	conjugué APCe-Bioscience	17-0041-81
CD8 conjugué à la FITC	e-Bioscience	11-0081-82
Solution de fixation/perméabilisation	BD-Bioscience	554722
Tampon de perméabilisation/lavage	BD-Bioscience 554723
anti-IFN&gamma ;-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Cytomètre en flux Accuri	BD Bioscience