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Article de méthode

Détection de In Situ complexes protéine-protéine à la Drosophila Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

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DOI :

10.3791/52139

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20 janvier 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation.

Résumé

Discs large (Dlg) est un membre conservé de la famille des guanylate kinases associées à la membrane, et sert de protéine d’échafaudage majeure à la jonction neuromusculaire larvaire (NMJ) chez la drosophile. Des études antérieures ont montré que la distribution postsynaptique de Dlg au niveau de la NMJ larvaire chevauche celle de Hu-li tai shao (Hts), un homologue des adducines de mammifères. De plus, on observe que Dlg et Hts forment un complexe l’un avec l’autre sur la base d’expériences de co-immunoprécipitation impliquant des lysats de mouches adultes entières. Cependant, en raison de la nature de ces expériences, on ne savait pas si ce complexe existait spécifiquement au NMJ pendant le développement larvaire.

Le test de ligature de proximité (PLA) est une technique récemment développée utilisée principalement dans la culture cellulaire et tissulaire qui permet de détecter les interactions protéine-protéine in situ. Dans ce test, les échantillons sont incubés avec des anticorps primaires contre les deux protéines d’intérêt à l’aide de procédures immunohistochimiques standard. Les anticorps primaires sont ensuite détectés à l’aide d’une paire spécialement conçue d’anticorps secondaires conjugués à des oligonucléotides, appelés sondes PLA, qui ne peuvent être utilisées pour générer un signal que lorsque les deux sondes se sont liées à proximité l’une de l’autre. Ainsi, les protéines qui se trouvent dans un complexe peuvent être visualisées. Ici, il est démontré comment le PLA peut être utilisé pour détecter in situ les interactions protéine-protéine au niveau de la NMJ larvaire de la drosophile. La technique est réalisée sur des préparations musculaires de la paroi corporelle larvaire pour montrer qu’il existe effectivement un complexe entre Dlg et Hts dans la région postsynaptique des NMJ.

Introduction

Drosophila disques large (DLG) est un élément conservé de la famille guanylate kinase associée à la membrane d'un échafaudage de protéines qui aident à orchestrer l'ensemble de grands complexes de protéines à des sites spécifiques de la membrane plasmique. Initialement identifié comme une protéine suppresseur de tumeur, Dlg sert un déterminant important de l'épithélium 1,2,3 apicobasal de polarité. Dlg sert également un module d'échafaudage majeur à la jonction neuromusculaire (JNM) des neurones moteurs glutamatergiques cours du développement larvaire 4. Dlg joue divers rôles à la JNM des larves, et son pléiotropisme repose sur sa capacité à associer à de multiples protéines 5,6. Une telle protéine est Hu-li tai shao (Hts), un homologue aux adducins mammifères qui ont été décrites principalement en ce qui concerne leurs rôles dans la régulation du cytosquelette d'actine-spectrine 7. Il a été montré précédemment que la DLG et Hts peuvent former un complexe avec l'autre sur la base in vitro expériences de co-immunoprécipitation impliquant toute mouche adulte lysats 8. Un inconvénient de ces résultats, cependant, ce est qu'ils ne indiquent pas où cela formes complexes. Avec l'utilisation de l'immunohistochimie, les distributions de la DLG et sont observés Hts à se chevaucher sur la membrane post-synaptique de la JNM des larves, mais elles sont dans un complexe dans cette région 8? Comme l'a récemment illustré et détaillé plus loin ici, Proximité ligature Assay (PLA) est utilisé pour rechercher une association entre Dlg situ et Hts en particulier au stade larvaire NMJ 27.

PLA est une technique relativement nouvelle utilisée principalement dans la culture de cellules et de tissus qui permet de détecter les interactions protéine-protéine in situ neuf. Dans ce dosage, les anticorps primaires contre les deux protéines d'intérêt sont détectés avec une paire d'anticorps secondaire spécifique à l'espèce, appelées sondes PLA, qui sont conjugués à des oligonucleotides (Figure 1A, B). Si les deux protéiness sont à proximité étroite les uns des autres (ce est à dire au bout de quelques dizaines de nanomètres), la distance entre les sondes attachées PLA peut être comblé par l'hybridation de deux oligonucléotides connecteurs complémentaires (figure 1C). Dans cette conformation, les extrémités libres des oligonucléotides connecteurs sont suffisamment proches pour entrer en contact avec l'autre, et une molécule d'ADN circulaire fermé peuvent être formées sur la ligature en situ (Figure 1D). La molécule d'ADN circulaire sert de matrice in situ pour l'amplification par cercle roulant, qui est amorcée par l'un des oligonucléotides conjugués à des sondes de l'APL (Figure 1E). Les séquences au sein de la amplifiée, un produit d'ADN concatémère résultant peuvent ensuite être visualisées, avec des sondes oligonucléotidiques complémentaires marquées par fluorescence (Figure 1F). Étant donné que l'ADN amplifié reste attaché à l'une des sondes de l'APL, la localisation subcellulaire de la protéine-protéine interaction withitissus na peut être facilement établi.

Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour détecter les interactions protéine-protéine, y compris des techniques in vitro telles que la co-immunoprécipitation, pull-down des essais et de la levure Double hybride, et dans les techniques in vivo telles que le transfert Förster Resonance Energy (FRET) et bimoléculaire complémentation de fluorescence ( BiFC). Un écueil des techniques in vitro, ce est qu'ils ne identifient pas où l'interaction est endogène produit, tandis que les techniques in vivo l'susmentionnés impliquent dans l'expression artificielle de protéines de fusion qui peuvent ne pas refléter le comportement natif de leurs homologues endogènes. Un avantage majeur de PLA est qu'il est capable de déterminer au sein d'un tissu de la localisation subcellulaire des interacteurs protéiques endogènes qui sont à proximité étroite les uns aux autres et susceptibles formant un complexe, avec le degré de proximité nécessaire pour produire un signal comparable à FRET et BiFC. PLA peut détecter des interactions avec une spécificité élevée et une sensibilité due au couplage de la reconnaissance d'anticorps et l'amplification d'ADN. Ainsi, le dosage peut générer des signaux lumineux discrets, sous la forme de points lacrymaux qui révèlent la position exacte de l'interaction. En outre, les antigènes à peine visibles peuvent être détectés. Enfin, le PLA est une technique relativement simple à réaliser, et il ne prend pas plus d'une procédure standard pour compléter immunohistochimique. Par conséquent, PLA offre un avantage technique sur d'autres tests d'interaction protéine-protéine qui sont souvent en proie à des temps de préparation long et vaste dépannage.

Ce protocole montre comment PLA peut être appliquée à la Drosophile larvaire JNM dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes in situ. Ici, le PLA est effectuée sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps où Dlg et Hts sont présentées d'exister en effet dans un complexe dans la région post-synaptique du NMJs. PLA n'a pas déjà été utilisé pour étudier la JNM des larves, et il ya à l'heure actuelle seule une poignée d'articles publiés qui ont utilisé cette technique dans le tissu drosophile. Il est à espérer que la poursuite de l'exposition de PLA à la communauté Drosophila entraînera dans son utilisation accrue comme un outil supplémentaire pour compléter d'autres, les plus couramment utilisés essais d'interaction protéine-protéine.

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Protocole

1. Préparation du corps mur

REMARQUE: Préparation du troisième stade larvaire parois du corps (par étude des NMJs qui innervent les muscles de la paroi du corps) a été réalisée comme décrit précédemment dans Brent et al dix, ou Ramachandran et Budnik 11,12, mais avec quelques modifications..

  1. Dissection
    1. Augmenter les stocks et les croix mouche à 25 ° C pendant cinq à six jours en utilisant des procédures standard 13.
    2. Choisissez ramper troisième stade larvaire de flacons ou bouteilles en utilisant une pince fine.
    3. Laver les larves dans une petite boîte de Pétri contenant un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les particules alimentaires.
    4. Placez une seule larve sur un disque de Sylgard et la plonger dans quelques gouttes de PBS glacé. Utilisation de PBS glacé aidera étourdir la larve qui rend plus facile à manipuler. Tout au long de la dissection, veiller à ce que la préparation est toujours immergé dans du PBS pour l'empêcher de sécher.
    5. Placez le larva avec sa face dorsale orientée vers le haut de sorte que les deux secteurs de la trachée sont visibles sous un microscope à dissection (figure 2A). En utilisant les forceps pour saisir une broche de minuties, épingler la larve vers le bas à l'extrémité postérieure près des stigmates (figure 2B). Avec une autre épingle, percer à travers la cuticule à l'extrémité antérieure près de l'embouchure crochets. Étirer doucement la larve sur la longueur, puis épingler le bas (figure 2B).
    6. Avec des ciseaux de microdissection, pincez l'extrémité postérieure près de la broche pour créer une petite ouverture. L'incision doit être assez superficielle juste passer à travers la cuticule.
    7. Mise en place de la pointe de la lame inférieure des ciseaux dans l'incision, coupé le long de toute la longueur de la ligne médiane dorsale entre les deux voies trachéaux (figure 2C). Dirigez les lames de ciseaux légèrement vers le haut lors de la coupe pour éviter d'endommager les muscles de la paroi ventrale du corps.
    8. Faire une petite incision horizontale légèrement antérieur au posteeriorly broche placée (figure 2C). Faire une autre incision similaire légèrement postérieure à la broche antérieurement placé (figure 2C). Les incisions doivent simplement passer à travers la cuticule.
      NOTE: Les trois incisions des étapes 1.1.7 et 1.1.8 combinés devrait ressembler à un " figure-protocol-1 "Une fois terminé, ce est à dire, un volet de gauche et de droite sur la face dorsale du corps de la larve devrait être produite.
    9. Nettoyer soigneusement les organes internes avec la pince. Ajout de quelques gouttes de PBS énergiques aidera déplacer les organes du corps larvaire, rendant ainsi plus facile de les enlever. Évitez piquer le corps des larves car il risque d'endommager les muscles de la paroi du corps.
    10. Déroulez le corps des larves ouverte et épinglez les coins vers le bas (Figure 2D). Lorsque l'épinglage, étirer la paroi du corps à la fois horizontalement et verticalement pour former un rectangle uniformément tendu (soie Figure 2G pour la forme), en prenant soin de ne pas déchirer les muscles de la paroi du corps dans le processus.
    11. Terminer la suppression de tous les organes internes restants (figure 2E).
  2. Fixation et perméabilisation
    1. Plonger les parois du corps épinglés dans plusieurs gouttes de solution de Bouin. Incuber pendant 15 min sur la glace. Vous pouvez également utiliser paraformaldéhyde 4% (PFA) comme un autre fixateur; incuber pendant 30 min.
    2. Rincer trois fois avec du tampon phosphate salin avec du Triton (PBT).
    3. En utilisant des pinces fines, retirez soigneusement les broches et transférer les parois du corps par leurs coins en 0,65 ml microtube siliconé.
    4. Conserver les parois du corps dans PBT à 4 ° C jusqu'au moment de PLA. Pour des résultats optimaux, commencer immunocoloration les parois de la caisse dans un jour ou deux de dissection.
      REMARQUE: Pour enregistrer sur les réactifs et d'assurer que tous les murs du corps sont traités de manière égale pendant l'essai, différents génotypes peuvent être placés dans un seultube. Les génotypes peuvent être distingués en coupant les coins des parois de la caisse différemment (voir la figure 2F pour des exemples).

2. immunohistochimie

REMARQUE: Immunomarquage de troisième stade larvaire parois du corps a été effectuée comme décrit précédemment dans Brent et al 14 et Ramachandran et Budnik 11, mais avec quelques modifications 11,14..
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à la température ambiante et sous agitation douce, sauf indication contraire.

  1. Blocage
    1. Laver les parois du corps avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun.
    2. Bloquer avec 1% de sérum-albumine bovine (BSA) pendant 1 heure.
  2. Immunocoloration
    1. Incuber les parois de la caisse avec la souris et le lapin primaires d'anticorps contre les deux protéines d'intérêt (dilué dans 1% de BSA) pendant 2 h à température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Dans ce cas, utilisez 01:10 souris anti-Dlg et 1: 250 de lapin d'unenti-HtsM 15,16. Les anticorps dirigés contre des marqueurs qui ne sont pas faites chez la souris ou le lapin peuvent également être inclus - par exemple, utiliser 1: 200 de chèvre anti-HRP pour délimiter les membranes neuronales.
    2. Laver avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun.
    3. Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore à détecter les marqueurs (dilué dans 1% de BSA) pendant 2 h à température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Comme le signal PLA est ensuite visualisée avec un fluorochrome rouge, un autre fluorophore doit être utilisé pour détecter le marqueur - par exemple, en utilisant 1: 200 anti-chèvre conjugué à FITC pour détecter l'anticorps anti-HRP de chèvre. En raison de l'utilisation de réactifs sensibles à la lumière, garder les tubes dans l'obscurité partir de ce point.
      REMARQUE: Le kit qui est utilisée permet de PLA à effectuer entre anticorps primaires soulevées dans la souris et le lapin, avec le signal visualisé sur le canal rouge sous microscopie confocale. Si on le souhaite, d'autres kits sont disponibles qui permettent à l'essai à effectuer avec primaanticorps ry soulevées dans d'autres espèces, et le signal visualisées sur d'autres canaux.

3. Proximité ligature Assay

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à la température ambiante et sous agitation douce, sauf indication contraire.

  1. PLA Sondes
    1. Laver les parois du corps avec PBT trois fois pendant 10 minutes chacun.
    2. Incuber avec des sondes PLA (1: 5 de chaque dilution dans 1% de BSA) pendant 2 h à 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 40 pi de sonde PLA MOINS anti-souris, 40 pl de sonde PLA anti-lapin PLUS et 120 pi de 1% de BSA pour assurer l'immersion correcte et le mélange de 5-10 parois du corps. Jusqu'à une dilution 1:25 des sondes PLA peut encore se traduire par un rapport adéquat signal-sur-bruit (par exemple, pour cette expérience).
  2. Ligature
    1. Laver les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pendant 5 min chacune.
    2. Incuber avec une solution de ligature (1h40 de dilution de ligase dans un tampon de ligature) pendant 1 heure unt 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 5 ul de ligase, 40 pi de tampon de ligature et 5 155 pi d'eau de haute pureté pour assurer l'immersion approprié et le mélange de 5 à 10 parois de la caisse.
  3. Amplification
    1. Laver les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pour 2 minutes chacun.
    2. Incuber avec une solution d'amplification (1:80 de dilution dans du tampon de polymerase amplification) pendant 2 heures à 37 ° C. Dans ce cas, utiliser 2,5 pi de la polymérase, 40 pi de tampon 5 Amplification et 157,5 pi d'eau de haute pureté pour assurer l'immersion correcte et le mélange de 5-10 parois du corps.
  4. Préparation for Imaging
    1. Laver les parois du corps avec le tampon de lavage B deux fois pour 10 minutes chacun.
    2. Laver avec 0,01x tampon de lavage B une fois pour 1 min.
    3. Équilibrer dans quelques gouttes de solution de montage pour au moins 30 min avant le montage ou la conserver pendant une nuit à 4 ° C.
    4. En utilisant des pinces fines, transférer soigneusement les parois du corps sur une lame de la plateforme wvec leurs cuticules vers le bas. Positionner les parois de la caisse dans des rangées et dans la même orientation à l'intérieur d'une ou deux gouttes de milieu de montage. Placez un 22 mm x 40 mm lamelle sur la préparation en prenant soin de ne pas générer des bulles d'air, puis sceller la lame avec vernis à ongles transparent.
    5. Conserver les diapositives dans l'obscurité à -20 ° C jusqu'au moment de l'imagerie confocale.

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Résultats

Dans de type sauvage troisième stade larvaire NMJs, Dlg est principalement trouvé à la membrane postsynaptique de type I boutons glutamatergiques, avec des niveaux d'immunoréactivité Dlg étant plus marquée dans le type Ib boutons que le type est boutons (figure 3A) 4. Hts est présent tout au long du muscle, mais se concentre dans la région post-synaptique avec Hts niveaux d'immunoréactivité apparaissant égale dans les deux boutons de type I, et se retrouve également présynaptique (fig...

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Discussion

Ce rapport montre comment PLA peut être appliqué à la drosophile larves NMJ. Le dosage est réalisé sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes présentes à la jonction neuromusculaire. Avec cette technique, Dlg Hts et sont indiqués pour être à proximité immédiate de l'autre, et ainsi exister dans un complexe, en particulier dans la région post-synaptique 27. À l'appui de ce résultat, une étude précédente a four...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Bloomington Drosophila Stock Center pour fournir des stocks de mouches. Nous remercions également le Hybridoma Banque études développementales et le Dr Lynn Cooley (Université de Yale) pour fournir des anticorps. Un merci spécial à AhHyun Yoo pour son aide sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds acier Isabelle Ada (Krieger) Conseil de recherches en génie du Canada (Krieger) les sciences naturelles et le William et et les Instituts canadiens de recherche en santé (Harden).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pince (fine #5)AlmedicA10-704
Sylgard DiscWorld Precision InstrumentsSYLG184Mélanger la base d’élastomère et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Laisser reposer pendant 30 min. Verser dans un moule ( par exemple utiliser une plaque de culture cellulaire à 12 puits). Laisser durcir pendant au moins 24 heures. Collez le couvercle d’une boîte de Pétri de 60 x 15 mm lors de la dissection.
Pin’s Minutien (0.0125  ; mm diamètre de la pointe)Fine Science Tools26002-10
Microdissection Ciseaux (ultra fins)Fine Science Tools15200-00
Lames deCollez deux lamelles de 22 x 22 mm 2 sur une lame de microscope avec du vernis à ongles transparent, en laissant un < Espace de 20 mm entre les deux pour le montage de l’échantillon.
w1118Bloomington Drosophila Stock Center3605
hts01103Bloomington Drosophila Stock Center10989stock a été rééquilibré sur un équilibreur GFP afin que les mutants homozygotes puissent être sélectionnés en fonction de l’absence de signal GFP.
1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate) : 3  ; mM NaH2PO4, 7  ; mM Na2HPO4, 130  ; mM NaCl, pH 7,0NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Solution de BouinSigma-AldrichHT10132 4 %
PFA (paraformaldéhyde) : 4 % PFA dans 1x PBSPFA (Anachemia Science - 66194-300). Voir doi :10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 pour des instructions sur la façon de préparer la solution.
[en-tête]
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton) : 1x PBS avec 0,01 % de TritonTriton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1 % BSA (Bovine Serum Albumin) : 1 % BSA dans 1x PBTBSA (Bioshop Canada - ALB001). Conserver à 4 °C.
souris anti-Dlg (Disques grands)Etudes développementales Hybridoma Bank4F3Utilisation à une dilution de 1:10 dans 1 % BSA.
lapin anti-HtsM (Hu-li tai shao)Fourni par le Dr Lynn Cooley (Université de Yale). Utiliser à une dilution de 1:250 dans 1 % BSA.
anti-Pak de lapin (kinase activée par p21)Fourni par le Dr Nicholas Harden (Université Simon Fraser). Utiliser à une dilution de 1:500 dans 1 % BSA.
souris anti-Wg (sans ailes)Etudes développementales Hybridoma Bank4D4Utilisation à une dilution de 1:5 dans 1 % BSA.
chèvre anti-Hrp (Raifort peroxydase)Jackson  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; ImmunoResearch123-065-021Utilisation à une dilution de 1:200 dans 1 % BSA.
Âne conjugué FITC anti-chèvreJackson  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; ImmunoResearch705-095-003Utilisation à une dilution de 1:200 dans 1 % de BSA.
Sonde PLA in situ Duolink anti-souris MOINSSigma-AldrichDUO92004
Sonde PLA in situ Duolink anti-lapin PLUSSigma-AldrichDUO92002
Réactifs de détection in situ Duolink RedSigma-AldrichDUO92008
1x tampon de lavage A : 0,01 M Tris, 0,15  ; M NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 7,4Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x tampon de lavage B : 0,2  ; M Tris, 0,1  ; M NaCl, pH 7,5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Tampon de lavage B : 2  ; mM Tris, 1  ; mM NaCl, pH 7,5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Milieu de montage in situ Duolink avec DAPISigma-AldrichDUO82040
plate-forme Le

Références

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