Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation

Résumé

La signalisation des chimiokines provoque des altérations marquées de la morphologie cellulaire et certaines redistributions importantes des protéines intracellulaires. Ici, un protocole rapide et détaillé est fourni pour étudier ces événements.

Résumé

Les cellules répondent à la stimulation par la chimiokine perdre leur forme ronde dans un processus appelé polarisation, et en modifiant la localisation subcellulaire de nombreuses protéines. Techniques d'imagerie classiques ont été utilisées pour étudier ces phénomènes. Cependant, ils doivent l'acquisition manuelle de nombreuses cellules, suivie par une quantification du temps de la morphologie et de la co-localisation de la coloration de plusieurs dizaines de cellules. Ici, un procédé rapide et puissant est décrit à étudier ces phénomènes sur des échantillons constitués de plusieurs milliers de cellules en utilisant une cytométrie en flux de la technologie de formation d'image qui combine les avantages d'un microscope à celles d'un cytomètre. Utilisation de lymphocytes T stimulés avec CCL19 et coloration pour les molécules MHC de classe I et de l'actine filamenteuse, une stratégie de déclenchement est présenté simultanément à mesurer le degré de modifications de forme et l'étendue de la co-localisation de marqueurs qui sont affectés par la signalisation de CCL19. En outre, cette stratégie de porte nous a permis de OBSERVe la séparation de l'actine filamenteuse (à l'avant) et phosphorylée Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) protéines (à l'arrière) dans les cellules T polarisées après CXCL12 stimulation. Cette technique est également utile pour observer l'effet de blocage sur la polarisation de deux éléments différents: l'inhibition de la polymérisation de l'actine par un inhibiteur pharmacologique et l'expression de mutants de la / voie de signalisation de la PKC atypique PAR6. Ainsi, la preuve montre que cette technique est utile d'analyser les altérations morphologiques et redistributions de protéines.

Introduction

Les chimiokines sont de petites protéines solubles qui attirent les cellules à des endroits spécialisés ^1. Par conséquent, ils participent au positionnement correct de cellules dans les tissus, un rôle crucial dans le développement et la physiologie. Le système immunitaire ne fait pas exception à cette règle car il repose sur l'action de nombreux différents types de cellules qui agissent de concert pour monter une réponse immunitaire efficace. En contrôlant la localisation spécifique d'un type de cellule immunitaire dans un état donné, les chimiokines sont des pré-requis avant antigènes étrangers peuvent être détectés et neutralisés.

Protocole

1. Préparation des lymphocytes T

1. Préparer la souris primaire ou cellules T humaines comme décrit ^10,11.
2. Cultiver les cellules T humaines dans un milieu complet RPMI avec 10% de sérum AB humain à une densité de 2-3 x 10 ⁶ cellules / ml.
   NOTE: L'utilisation de sérum de veau foetal (FCS) à la place du sérum humain peuvent induire la polarisation spontanée d'une grande fraction de cellules T humaines en culture. Gardez ces cellules en culture pendant 4-5 jours, et autre processus à tout moment pendant cette période.
3. Maintenir les cellules T de souris dans du milieu RPMI complet supplémenté avec 10% de FC....

Résultats

Le premier exemple choisi ici concerne l'utilisation de lymphocytes T primaires humains stimulés avec CCL19. Cependant, la même stratégie peut être utilisée avec des cellules T de souris primaires, des lignées de cellules T ou tout autre type sensible à la stimulation de chimiokine sur les cellules. La stratégie présentée ici de déclenchement comprend une série de fenêtres qui sélectionnent les événements ciblés, puis les cellules individuelles. Enfin la plage d'intensité de fluorescence est suivie ici à titre d'exemple.......

Discussion

Grâce à une technologie récente des flux d'imagerie de cytométrie une stratégie rapide et informative déclenchement d'analyser des événements cellulaires et moléculaires induits par la stimulation de la chimiokine est présenté. A partir d'une seule expérience, on peut obtenir deux types d'informations: les changements dans la morphologie cellulaire induites par stimulation de la chimiokine et la distribution subcellulaire de protéines différentes pendant le processus de polarisation. Fait intéressant, la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI	Gibco	61870-010
Sérum humain AB	PAA	C11-021	Préchauffer pour inactiver le complément.
Sérum de veau fœtal	PAN Biotech	P30-3300	Préchauffer pour inactiver le complément.
Kit de nucléofacteurs de cellules T humaines	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	aliquotes sont décongelées sur de la glace avant d’ajouter la chimiokine aux cellules.
humaines CCL19	Peprotech	300-29B	sont décongelées sur de la glace avant d’être ajoutées à la chimiokine dans les cellules.
humaines CXCL12	Peprotech	300-28A	sont décongelées sur de la glace avant d’être ajoutées à la chimiokine dans les cellules. Cette chimiokine peut également être utilisée sur les lymphocytes T de souris.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	Il s’agit d’une solution de PFA à 8 % dans l’eau. Mélanger volume à volume avec 2x PBS pour obtenir une solution de PFA à 4 % dans du PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 Phalloïdine	Invitrogen	A12381
Anticorps FITC-anti-HLA-ABC	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anticorps anti-P-ERM	Technologie de signalisation cellulaire	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis

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