Régiosélective Biolistic ciblage dans les tranches de cerveau organotypique l'aide d'un pistolet à gènes modifiés

Résumé

Les améliorations récentes apportées aux préparations de coupes de cerveau organotypiques ont permis de les exploiter pour des applications biotechnologiques. Les coupes organotypiques conservent les caractéristiques structurelles locales de la biologie in vivo, y compris les connexions synaptiques fonctionnelles. Nous présentons ici une méthode d’administration biolistique régiosélective pour étiqueter et manipuler génétiquement ces tranches.

Résumé

Transfection d'ADN a été inestimable pour les sciences biologiques et les progrès récents à organotypiques préparations de tranches de cerveau, l'effet de divers gènes hétérologues pourrait donc être étudiée facilement tout en conservant de nombreux aspects de la biologie in vivo. Il a un intérêt croissant pour la transfection de neurones différenciées pour lesquels les méthodes classiques de transfection ont été nombreuses difficultés telles que de faibles rendements et des pertes importantes de viabilité. Transfection biolistique peut contourner la plupart de ces difficultés encore que récemment a été modifié cette technique de sorte qu'il se prête à une utilisation dans des tissus de mammifères.

Les nouvelles modifications apportées à la chambre de l'accélérateur ont amélioré la précision de tir du canon à gènes et l'augmentation de ses profondeurs de pénétration tout en permettant l'utilisation de basse pression de gaz (50 psi) sans perte d'efficacité de transfection ainsi que de permettre une propagation régiosélective ciblée de la paARTICLES à moins de 3 mm. En outre, cette technique est simple et rapide à réaliser que microinjections fastidieuses. Les deux transitoire et l'expression stable est possible avec des nanoparticules bombardement où l'expression épisomique peut être détecté dans les 24 heures et la survie des cellules a été montré pour être supérieur ou au moins égal à des méthodes classiques. Cette technique présente cependant un avantage essentiel: il permet la transfection d'être localisées dans un seul rayon de retenue permettant ainsi à l'utilisateur d'isoler les effets de l'anatomie du gène hétérologue. Nous présentons ici un protocole en profondeur pour préparer adultes viable tranches organotypiques et les soumettre à RÉGIOSÉLECTIVE transfection en utilisant un canon à gènes améliorée.

Introduction

À l’origine, la technique biolistique, une tournure de phrase pour « balistique biologique », a été établie pour le transfert de gènes médié par des particules dans les cellules végétales¹. Cette méthode physique de transformation cellulaire accélère les micro ou nanoparticules à grande vitesse pour surmonter les barrières physiques des membranes cellulaires imperméables afin de livrer des cargaisons telles que de l’ADN ou des colorants. Parce qu’il ne dépend pas de ligands-récepteurs spécifiques et/ou des propriétés biochimiques à la surface des membranes cellulaires, le transfert de gènes médié par les particules peut être facilement appliqué à une variété de systèmes biologiques tels que les coupes de cerveau organotypiques.

L’utilisation de coupes organotypiques présente des avantages par rapport aux autres plateformes in vitro car elles conservent de nombreuses propriétés anatomiques et biochimiques pertinentes pour la biologie in vivo ^2-4. Les tranches conservent principalement les caractéristiques architecturales locales d’où elles proviennent et préservent l’activité neurochimique et la connectivité des synapses. L’utilisation de coupes de cerveau pour la recherche fondamentale et dans les entreprises pharmaceutiques a augmenté en même temps que le nombre de manipulations biotechnologiques possibles pour mesurer et surveiller les comportements neurobiologiques du cerveau dans un contexte de type in vivo ^3,5-7. Les principaux avantages de l’utilisation de systèmes de dosage organotypiques basés sur des tranches sont qu’ils permettent un contrôle expérimental facile et des manipulations précises des environnements extracellulaires.

De manière fructueuse, des systèmes de culture en tranches organotypiques ont été établis à partir d’une variété de régions cérébrales telles que, mais sans s’y limiter, le cortex, la moelle épinière et le cervelet^8-10. De plus, un certain nombre de cocultures ont été mises en évidence, qui permettent d’évaluer la communication intercellulaire entre les régions distales du cerveau ainsi qu’entre les neurones et les cellules pathologiques^11,12. De nombreux protocoles ont déjà été établis pour cultiver avec succès des coupes organotypiques et peuvent maintenir la viabilité à long terme, et de nombreuses études récentes utilisent maintenant les méthodes d’interface membranaire et diverses modifications de celles-ci¹³. Ce principe permet de maintenir les tranches organotypiques à l'interface entre le milieu et l'atmosphère humidifiée de l'incubateur en plaçant les tranches sur un filtre à membrane poreuse. Le milieu peut ainsi fournir suffisamment de nutriments pour nourrir les tranches organotypiques par capillarité. Généralement, les tranches ont été préparées à partir d’animaux postnatals précoces (âgés de 3 à 9 jours ; P3 à 9). Cependant, les tissus cérébraux de ces tranches présentent un niveau élevé de plasticité cellulaire et une résistance inhérente aux stress mécaniques, ce qui est utile pour obtenir des cultures viables, mais les synapses matures et les circuits neuroanatomiques ne se sont pas complètement développés in vivo avant 2 à 3 semaines de^{l’âge de 14} ans. Par exemple, des observations antérieures avaient montré que les coupes d’hippocampe obtenues à partir de nouveau-nés P0-1, bien que très viables après préparation, perdaient progressivement certaines caractéristiques morphologiques. Essentiellement, ils se sont révélés inadaptés aux cultures à long terme, ce qui suggère que les cellules immatures étaient plus susceptibles de se dédifférencier par rapport aux cultures organotypiques d’animaux plus âgés^15,16. Pour cette raison, notre méthode a été optimisée pour les coupes de cerveau organotypiques adultes où la maturation et le développement architectural ont atteint leurs stades terminaux^13,17-21. Néanmoins, cette méthode convient également aux tranches organotypiques de nouveau-nés et de juvéniles.

Une fois que les tranches organotypiques viables ont été produites, la plaque entière contenant les tranches peut être amenée à la monture biolistique et soumise à une administration régiosélective et à une transfection. Le montage correct du canon à gènes (tel que décrit à la figure 1), orienté à 90° à une distance de 10 mm directement au-dessus des tranches (de l’ouverture au tissu), permet l’administration biolistique rapide des cargaisons recouvertes de particules d’or de 40 nm. Ces cargaisons telles que les colorants et les vecteurs d’ADN fluorescents, ainsi que tout gène d’intérêt, sont facilement délivrées dans les tranches viables. Cette méthode décrit ainsi le protocole nécessaire pour livrer, de manière régiosélective, des nanoparticules d’or enrobées de cargaison en tranches de cerveau organotypiques viables. Le canon du pistolet à gènes et le montage optimal peuvent être vus sur la figure 1. Pour plus d'informations sur le canon amélioré et la balistique des nanoparticules, veuillez consulter O'Brien, et al.¹⁷. Aéroport

Les raffinements ultérieurs sont également indiqués à l’utilisateur pour optimiser des conditions telles que la quantité appropriée d’or délivrée par zone cible, définie comme la quantité de charge de microporteur (MLQ), et pour déterminer la quantité d’ADN chargée par mg d’or, définie comme le taux de charge d’ADN (DLR). Avant de précipiter l'ADN sur des particules d'or et de les charger dans le tube de Tefzel qui comprend les véritables « cartouches » du pistolet à gènes, il est nécessaire de calculer la quantité d'ADN et d'or nécessaire pour chaque transfection qui peut différer légèrement selon les tissus et les conditions (le rapport doit être maintenu entre 1 mg d'or et 1 μg d'ADN à 1:5). Il est essentiel de préparer la proportion appropriée de MLQ par rapport au DLR, sinon les particules d’or recouvertes d’ADN pourraient adhérer ensemble pour former une agglomération plus grande que prévu, ce qui pourrait réduire l’homogénéité globale de la propagation biologique et augmenter les lésions tissulaires et la cytotoxicité.

Cette méthode montre les améliorations récentes de l’administration biolistique, qui ont été testées et jugées acceptables pour les coupes de cerveau organotypique néonatal, juvénile et adulte. De plus, en exploitant la propagation biolistique réduite du canon du pistolet à gènes, l'utilisateur est désormais capable de transfecter sélectivement une région ponctuelle du cerveau. Après le temps d’incubation approprié, l’expression des protéines fluorescentes, qui atteint ses taux maximaux entre 24 et 48 heures, peut être visualisée par épifluorescence et microscopie confocale. Ces fluorophores permettent l’analyse morphologique et la localisation de cellules individuelles dans des structures biologiquement pertinentes. Cependant, la modulation régiosélective des coupes organotypiques par d’autres gènes hétérologues peut également être surveillée par tout autre test se prêtant à ces préparations. Les stratégies de travail possibles pour l’administration localisée des gènes sont présentées à la figure 2.

Protocole

L’utilisation d’animaux et de tissus animaux doit strictement respecter l’approbation du comité d’éthique en vertu des règles et réglementations locales. Tous les tissus obtenus au cours de cette étude étaient conformes aux directives du MRC-LMB en matière d'expérimentation animale.

1. Préparation des matériaux et des milieux de culture

1. Préparez toutes les solutions avec de l’eau Millipore ; utilisez uniquement des réactifs de qualité analytique. Préparez et stockez tous les réactifs chez RT (sauf indication contraire).
2. Préparer 500 ml de solution saline tamponnée HEPES (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtrer à travers une unité de filtration stérile de 0,2 μm. Conserver à 4 °C.
3. Préparez 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4). Stériliser à l’autoclavage.
4. Préparez le milieu neuronal en complétant le DMEM (milieu d’aigle modifié de Dulbecco) avec 25 mM d’HEPES, 10 % de sérum de veau fœtal, 30 mM de glucose, un supplément de N2 1:100, 1 100 U/ml de pénicilline-streptomycine ; pH 7,2. Filtre avec une unité de filtration stérile de 0,2 μm. Conserver à 4 °C.
5. Préparez une solution mère de polyvinylpyrrolidone (PVP) avec 20 mg de PVP dans 1 ml d’éthanol à 100 %. Aliquotez-le en quantités de 1 ml, congelez-le et conservez-le à -20 °C. La solution de travail est de 0,05 mg/ml, ajoutez donc 10 μl de solution mère PVP à chaque 4 ml d’éthanol à 100 %.
6. Préparez une solution mère de spermidine 0,05 M dans de l’eau Millipore et ajustez le pH à 7,2.
7. Préparez une solution d’agarose à 2 % dans du DMEM (2 g d’agarose de qualité électrophorèse dans 100 ml de DMEM dans un flacon à bouchon à vis stérilisé). Passez au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute. Conserver au réfrigérateur à 4 °C pendant plusieurs semaines, si nécessaire.

2. Préparation des tranches organotypiques

1. Euthanasier C57 Black 6 souris de l’âge désiré par asphyxie au CO₂ suivie d’une décapitation. Retirez le cerveau à l’aide de coupes latérales du crâne commençant au foramen magnum et se terminant aux lobes olfactifs. Soulevez doucement le crâne par l’arrière pour exposer le cerveau.
2. Coupe entre les lobes olfactifs et le cortex frontal, et rostrale au cervelet. Soulevez doucement la partie rostrale du cerveau et coupez les nerfs optiques. Enfin, retirez le cerveau et placez-le dans une boîte de Pétri remplie de solution saline glacée tamponnée à HEPES sur de la glace.
3. À l’aide d’un microscope à dissection, retirez la lèvre à l’aide d’une pince fine ; retirez soigneusement les vaisseaux sanguins et les méninges autour du cerveau.
4. Placez la cervelle fraîche dans un petit moule récepteur et couvrez-la avec la solution d’agarose refroidie légèrement au-dessus de RT. Refroidissez ensuite rapidement le moule à 4 °C en le posant sur de la glace.
   REMARQUE : Traitez les tranches aussi rapidement que possible pour éviter la perte de viabilité.
5. Lorsque l’agarose a pris (5 à 10 min), retirez le cerveau incrusté d’agarose du moule (coupez-le si nécessaire), puis collez-le sur la plate-forme du vibrosliceur. Placez-le dans une chambre de vibrotrancheuse contenant du PBS stérile glacé. Désinfectez la chambre de vibrotrancheuse avant de l’utiliser avec de l’éthanol à 70 % afin de minimiser les contaminations ultérieures.
6. Coupez le cerveau à l’aide d’un vibrotrancheur construit sur mesure ou d’un équivalent commercial. Le concept du modèle était de concevoir une trancheuse à tissus capable de générer des mouvements de grande amplitude et à haute fréquence horizontalement jusqu’au bord de la lame tout en minimisant les vibrations verticales.
7. Utilisez la fréquence d’oscillation de 90 Hz, à une amplitude de 1,5 à 2,0 mm, et la lame de coupe positionnée à un angle de 15° par rapport au plan horizontal ; réglez le bloc de montage tenant le cerveau nourri d’agarose pour qu’il se déplace à 1,7 mm/min vers la lame. Prélever des sections (150 μm) dans une chambre contenant un milieu de culture glacé (stylo DMEM/streptocoque + 10 % de FCS). Voir la coupe et la manipulation des coupes de tissu sous forme de vidéo supplémentaire dans Arsenault et O'Brien¹³.
8. Placez délicatement les tranches dans des inserts de culture cellulaire (0,4 μm, 30 mm de diamètre) dans un plateau à 6 puits avec le milieu de culture à l’extérieur de l’insert, et incubez dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂,
   REMARQUE : Pour une bonne viabilité des tissus, soyez extrêmement doux lors du transfert et de la manipulation des tranches. De plus, trop de liquide empêchera les tranches organotypiques d’adhérer à la membrane de l’insert filtrant. Si cela se produit, retirez à nouveau l’excès de liquide ou la plaque.
9. Bien que les tranches organotypiques puissent être cultivées pendant quelques semaines, procéder à la transfection au plus tard 4 jours après le placage pour obtenir les meilleurs rendements de transfection.
   REMARQUE : Pour éviter la prolifération gliale dans des conditions de culture à long terme, utilisez AraC ou un milieu sans sérum².

3. Préparation de micro et nano-projectiles recouverts d’ADN

1. Préparez des nano-projectiles à l’aide de particules d’or de 40 nm de diamètre. En bref, ajoutez 50 μl de spermidine 0,05 M et 10 μl d’ADN à 1 mg/ml (pEYFP-N1) à 10 mg de particules d’or.
   1. Ajoutez du calcium et de la spermidine dans le mélange de solution pendant la préparation des microparticules d’ADN afin d’aider à la liaison des molécules d’ADN aux nanoparticules d’or.
      REMARQUE : La quantité d’ADN utilisée par mg de supports d’or (DLR) doit se situer entre 1 et 5 μg d’ADN pour 1 mg d’or. De plus, la quantité de particules porteuses d’or qui seront tirées par cartouche (MLQ), devrait elle-même se situer entre 0,1 et 0,5 mg d’or. Le DLR et le MLQ doivent être essayés et optimisés pour chaque utilisateur en fonction du système particulier étudié ainsi que du type de pistolet à particules et de gènes utilisé.
2. Mélanger à l’aide d’un vortex en ajoutant lentement 50 μl de 1 M de CaCl₂ en fractions de 10 à 15 μl. Après 5 min de vortex occasionnel, centrifuger à 1 000 x g pendant 30 secondes puis retirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille de particules d’or dans 3,5 ml de PVP 0,075 M.
3. Aspirez cette suspension dans un tube (2,36 mm de diamètre intérieur) à l’aide d’une seringue. Placez le tube dans la station de préparation du tube. Laissez les particules d’or se déposer et éliminez le surnageant par aspiration à l’aide d’une seringue. Faites pivoter le tube pour répartir uniformément les particules d’or, qui ont ensuite été séchées sous un débit d’azote constant à raison de 5 L par minute.
4. Pour créer des balles d’ADN, coupez le tube à l’aide d’un coupe-tube en longueurs de 1 cm. Insérez-le immédiatement dans la cartouche du pistolet à gènes ou conservez-le desséché (4 °C) jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

4. Transfection biolistique sur tranches organotypiques

1. Effectuez les étapes suivantes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile.
2. Insérez une pile 9 V et un porte-cartouche vide dans le pistolet à gènes Helios.
3. Fixez le pistolet à gènes au réservoir d’hélium avec le tuyau d’hélium. Tirez 2 à 3 blancs (fentes vides) à 50 psi pour pressuriser le tuyau d’hélium et les réservoirs du pistolet.
4. Chargez les cartouches contenant l’or recouvert d’ADN dans les porte-cartouches et chargez le support dans le pistolet à gènes.
5. Dévissez l’entretoise du pistolet à gènes et fixez le canon du pistolet à gènes modifiés au pistolet à gènes.
6. À l’aide d’une pince stérile, placez un insert filtrant contenant la tranche organotypique dans un plat en plastique stérile.
7. Retirer le milieu des tranches organotypiques.
8. Réglez la pression du gaz à 50 psi.
   REMARQUE : La protection oculaire est essentielle et la protection auditive conseillée.
9. Placez le pistolet à gènes à la distance appropriée à l’aide du support mesuré à 10 mm. Dirigez soigneusement le centre du canon sur la région souhaitée pour l’administration génétique.
10. Après la cuisson, replacez les inserts dans leur plat avec un milieu frais et remettez-les dans des conditions de croissance normales, c’est-à-dire 37 °C avec un incubateur à 5 % de CO₂.
11. Une fois terminé, fermez le réservoir d’hélium, relâchez la pression du pistolet à gènes et détachez le pistolet à gènes du réservoir d’hélium.
12. Retirez le porte-cartouche et jetez les cartouches et nettoyez le pistolet à gènes.
13. Vérifiez la morphologie du tissu et la pénétration réussie en visualisant les coupes à l’aide d’un microscope inversé. Si vous utilisez des microparticules, dispersez uniformément l’or ; Il ne doit pas y avoir de zones denses de particules d’or visibles sur la tranche. Les nanoparticules, en raison de leur petite taille, ne peuvent pas être considérées comme des unités uniques par les techniques de microscopie conventionnelles.
14. Après l’intervalle de temps approprié (généralement 1 à 2 jours), fixez les tranches dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour l’observation microscopique.
    REMARQUE : La fixation en PFA n’est pas toujours souhaitée. Pour l’imagerie de cellules vivantes, évitez cette étape.

5. Fixation et visualisation des tranches de cerveau

1. Après la transfection biolistique, laver les tranches deux fois dans du PBS pendant 2 min.
2. Fixez les tranches en les incubant dans du PFA 4 % de PFA fraîchement préparé et glacé dans du PBS pendant 20 min.
3. Lavez les tranches deux fois dans du PBS pendant 2 min.
4. Découpez doucement autour des supports membranaires à l’aide d’un scalpel, sans déranger les tranches qui y sont montées. À l’aide d’une pince, placez chaque support de membrane/tranche sur une lame de microscope. Posez les tranches organotypiques sur la membrane sur la lame de verre.
5. Ajoutez une goutte de support de montage sur le dessus de la tranche et ajoutez une lamelle doucement sans aucune force directement en contact avec la tranche organotypique.
6. Fixez la lamelle avec une fine couche de vernis à ongles.
7. Visualisez les coupes sur un microscope approprié.

6. Applications confocales

1. Visualisez les coupes à l’aide d’un microscope confocal laser à balayage vertical équipé d’un objectif à immersion dans l’huile à ouverture numérique (NA) 60X/1,4.
   REMARQUE : La caractéristique la plus problématique du microscope confocal est la taille du sténopé (fixée à 1 UA) qui est capable d'isoler et de collecter un plan de foyer, éliminant ainsi la « brume » floue normalement observée avec un échantillon fluorescent. Les détails fins sont souvent obscurcis par cette brume et ne peuvent pas être détectés par un microscope non confocal.
2. Réglez le laser à argon sur une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et optimisez la collecte de la lumière émise dans la bande de 500 à 520 nm. En règle générale, collectez des images à 1 024 x 1 024 pixels et avec des piles de sections z à des intervalles de 0,5 μm pour englober toute la largeur de chaque cellule nerveuse analysée.
   1. Pour observer la morphologie du noyau, contre-colorez ces cellules avec du DAPI (longueur d’onde d’excitation fixée à 405 nm et lumière d’émission collectée entre 420 - 4 40 nm). Enfin, pour examiner la fluorescence rouge, réglez le laser à 561 nm pour l’excitation et à 565 - 620 nm pour l’émission.
3. En règle générale, l’acquisition d’images à l’aide d’un zoom de balayage 4X couvrant une zone de 57,6 μm² ; la taille des images était de l’ordre de 1 024 x 1 024 pixels. Enregistrez des piles de sections z à des intervalles de 0,5 μm et des projections de 5 à 8 images combinées.

Résultats

La viabilité des tranches organotypiques peut être surveillée à l’aide de l’activité de la lactate déshydrogénase, du marquage à l’iodure de propidium et de la coloration dUTP, comme cela a été signalé précédemment^13,22. De toute évidence, la viabilité et l’intégrité des tranches sont importantes pour l’expression durable à long terme de la cargaison génétique livrée. Après l’administration biolistique dans les coupes organotypiques, l’expression du gène hétérologue fluorescent a été surveillée par microscopie confocale. L’étanchéité de la propagation biologique à l’aide du canon modifié peut être observée à la figure 3A. La figure 3B montre une image représentative de la région de l’hippocampe transfectée à l’aide de nanoparticules d’or recouvertes d’ADN. La figure 4 montre des images représentatives de coupes organotypiques de souris adultes transfectées. Comme on peut le voir sur la figure 4A, un neurone de Purkinje avec un port dendritique remarquable trouvé à l’interface de la couche de Purkinje et de la couche moléculaire du cervelet montre un marquage prononcé après une transfection biolistique transitoire avec pEGFP-N1. La figure 4B montre un grossissement plus élevé de ces dendrites où l’on peut observer des épines. La figure 4C montre une cellule pyramidale trouvée dans la région CA1 de l’hippocampe après l’administration biolistique de nanoparticules d’or enrobées de pDSredFP.

Les colorants au lieu de cargaisons d’ADN codés par fluorescence peuvent également être utilisés de manière similaire pour visualiser les caractéristiques morphologiques dans des coupes organotypiques. DiO, qui marque les membranes plasmiques, peut délimiter plus rapidement les morphologies cellulaires individuelles ou peut être utilisé en conjonction avec une bioliste enrobée d’ADN livrée dans la même région pour confirmer la régiosélection. Comme on peut le voir sur la figure 5A, un neurone coloré au DiO dans l’hippocampe présente également de longues dendrites avec de nombreuses épines. Une flèche indique l’axone, qui est identifié par la présence de boutons synaptiques par rapport aux épines denttritiques des autres neurites. La figure 5B montre un autre exemple du CA1, qui met en évidence de nombreuses projections hippocampiques avec une contre-coloration DAPI pour marquer le noyau. La figure 5C montre un grossissement plus élevé de ces types de dendrites parallèles avec de nombreuses épines.

De toute évidence, ces images illustrent des caractéristiques morphologiques suite au marquage cellulaire. Rien n’empêche l’application de la même méthodologie pour délivrer un nombre quelconque de gènes exogènes enrobés sur les nanoparticules d’or. Pour permettre une confirmation visuelle de la réussite de la transfection, un seul plasmide peut être construit pour co-exprimer à la fois le gène d’intérêt et une protéine rapporteure fluorescente sur le même vecteur.

Figure 1. Canon et montage du pistolet Gene.(A) Le canon amélioré mis au point par M. O'Brien au MRC-LMB qui a une propagation biolistique restreinte qui minimise les dommages aux tissus en abaissant la pression requise pour l'accélération des particules. (B) Vue latérale d’un montage optimisé du canon à gènes mis au point par le Dr Henderson et le Dr Andras Nagy de l’Université de Toronto. Le support maintient le pistolet à gènes à 90° précisément perpendiculairement aux coupes organotypiques tout en permettant à l’utilisateur de contrôler avec précision la distance d’administration biolistique. Pour des conditions biologiques optimales, l’ouverture du canon doit être placée directement sur la région d’intérêt, à une distance de 10 mm des coupes organotypiques. (C) Vue arrière du montage du canon à gènes. La région d’intérêt à transfecter doit être placée directement sous l’ouverture du canon. Le ciblage peut être confirmé par un colorant (diolistique) ou une transfection de protéines fluorescentes (biolistique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Préparation de coupes organotypiques et ciblage régiosélectif.(A) Un cerveau de souris adulte intégré au DMEM prêt à être tranché. (B) Le moule a été collé sur le support de la trancheuse vibrante avec la lame prête à couper une tranche. (C) Stratégies d’expression génique hétérologue régiosélectives pour l’administration biolistique dans des coupes de cerveau organotypiques coronaux. Images préparées à partir d’images obtenues à partir de l’atlas anatomique de référence²³ de l’Allen Brain Atlas. Le panneau de gauche montre deux régions cérébrales différentes ciblées à titre d’exemple. Restreindre l’expression du gène (1) à la zone corticale de l’hémisphère gauche. Restreindre l’expression du gène hétérologue (2) à la région de l’hypothalamus du cerveau. Le panel du milieu montre que l’expression de deux gènes hétérologues (3 et 4) peut être isolée et compare l’hippocampe de deux hémisphères dans la même tranche organotypique, éliminant essentiellement tout biais lié à l’utilisation de différentes sections et/ou accordant la possibilité d’aborder la diaphonie distale des effets de ces gènes. Le panneau de droite montre le chevauchement possible de l’administration transgénique pour exprimer le premier gène (5) dans une région corticale précise tout en exprimant un autre gène (6) dans une zone corticale disparate mais chevauchante. Cela permet d’analyser l’effet de la modulation génétique de chaque gène hétérologue seul et également en combinaison au sein d’une même tranche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Schéma de diffusion biolistique observé sur du papier filtre et image à faible grossissement.(A) Le canon amélioré a été tiré sur du papier filtre pour déterminer la propagation des particules d’or. Le côté gauche montre la distribution du canon amélioré tandis que le panneau de droite montre le canon normal. Barre noire : 1 cm. Image tirée de O'Brien, et al.¹⁷. (B) Image à faible grossissement montrant le schéma de transfection stochastique dans la propagation biolistique de 3 mm dans la région de l’hippocampe de souris âgées de 6 semaines. Barre blanche : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Livraison biolistique d’ADN codé par la protéine fluorescente dans des tranches organotypiques de souris âgées de 6 semaines.(A) Images confocales inversées d’une tranche organotypique fixe du cervelet d’une cellule de Purkinje transfectée de particules d’or enrobées de pEGFP-N1. L’image a été prise à un grossissement de 40X. Barre noire : 30 μm. (B) Montre un grossissement de 60x du port denttritique d'une autre cellule de Purkinje pour mettre en évidence les épines. Barre noire : 5 μm. (C) Montre une image confocale de coupes fixes prélevées dans la région de l’hippocampe à un grossissement de 60x de quatre cellules pyramidales transfectées par DSredFP. Barre noire : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5. Administration diolistique de colorants fluorescents de marquage membranaire en tranches organotypiques.(A) montre l’imagerie en direct d’un neurone de l’hippocampe marqué avec DiO sous un grossissement de 20X. Les épines denttritiques sont clairement observées ainsi que l’axone comme l’identifie l’absence d’épines denttritiques et la présence de boutons synaptiques indiqués par une flèche blanche. Barre blanche : 30 μm. (B) Coloration prononcée de la région de l’hippocampe marquée au DiO et contre-colorée au DAPI. Barre blanche : 30 μm. (C) Grossissement plus élevé (60x) des épines denttritiques trouvées dans la région CA1 de l’hippocampe. Barre blanche : 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit des approches pour administrer des colorants et du matériel génétique dans des coupes organotypiques adultes à l’aide d’un canon à gènes amélioré. Essentiellement, les types de colorants et la variété des gènes possibles rendent cette méthode multiforme et apte à répondre à un large éventail de questions biologiques. La méthode d'administration régiosélective utilisée, dans ce cas, à une région spécifique du cerveau, ouvre de nouvelles voies d'expérimentation, car la modulation génique hétérologue de zones localisées au sein d'une architecture biologiquement pertinente n'a pas été facilement réalisable auparavant. Nous avons précédemment déterminé que cette méthode peut être utilisée sur des coupes organotypiques adultes, où les synapses matures sont complètement formées, car elle a montré une amélioration de la survie cellulaire et de l’expression génique hétérologue pendant de nombreuses semaines¹³. Avec l’avènement de conditions de culture nouvelles et améliorées pour le cerveau des mammifères ainsi que pour d’autres tissus, l’utilisation de modulations génétiques régiosélectives deviendra de plus en plus utile pour une grande variété d’analyses biochimiques.

Comme nous le soulignerons ici et comme d’autres l’ont déjà mentionné²⁴, de nombreux facteurs différents peuvent facilement affecter la précision et la fiabilité de l’administration biologique. Tout d’abord, la préparation de la particule d’or liée aux colorants ou à l’ADN doit être équilibrée de manière adéquate pour éviter l’agrégation et faciliter l’expulsion de la cargaison de la cartouche. Le calcium et la spermidine dans la solution de microparticules d’ADN-or peuvent aider à la liaison des molécules d’ADN aux nanoparticules d’or. La capacité des nanoparticules à pénétrer dans les cellules sous une pression réduite a été précédemment déterminée¹⁷. Deuxièmement, le pistolet à gènes doit être monté aussi stable que possible avec l’angle et la distance corrects. Un manomètre fiable est également nécessaire pour la reproductibilité, pour maintenir l’intégrité des tissus et pour accélérer correctement les particules d’or vers leurs cibles prévues. En effet, la distance, l’orientation et la stabilité de l’équipement sont également des facteurs cruciaux pour le ciblage et la précision de la livraison régiosélective. Comme ces structures cérébrales sont très petites, des variations mineures de l’angle de tir pourraient facilement rendre l’ensemble de la procédure moins fiable. Enfin, la préparation et la maintenance de coupes organotypiques viables ont été semées d’embûches pendant de nombreuses décennies, mais des protocoles abondants et fiables pour différents animaux, régions du cerveau, âges et cocultures sont actuellement disponibles^2,4,25,26. Ces procédures doivent être optimisées pour l’utilisateur avant de soumettre les tissus à des procédures biolistiques. Cela permettra plus facilement à l’utilisateur de déterminer de manière impartiale l’impact des particules biolistiques et l’effet du gène hétérologue sur ses propres cultures. À cette fin, l’utilisation de gènes fluorescents tels que EYFP et EGFP peut à la fois permettre à un nouvel utilisateur de tester la précision du ciblage et de suivre la viabilité cellulaire par l’expression de gènes hétérologues sur une période prolongée¹³. De nombreuses étapes critiques pour une utilisation fiable et reproductible de ce protocole sont mises en évidence dans les trois paragraphes suivants.

Pour une transfection efficace, la concentration d’ADN doit être appropriée. Des concentrations trop faibles entraveraient le rendement de transfection, tandis que des concentrations trop élevées peuvent provoquer une agglomération des nanoparticules. Les agrégats d’or peuvent réduire considérablement l’efficacité de la transfection, provoquer des distributions inégales et entraîner une augmentation de la cytotoxicité et du stress oxydatif. Les problèmes d’efficacité de l’enrobage sont probablement dus à l’expiration de la solution de spermidine (doit être remplacée tous les 2 à 3 mois). Pour une propagation biologique adéquate, l’étiquetage doit être uniforme. Un marquage non homogène de la suspension de nanoparticules d’or/ADN peut être dû à la solution PVP. Il faut également le remplacer tous les 2 à 3 mois. Le revêtement des nanoparticules d’or peut être observé sur l’électrophorèse sur gel d’agarose comme une bande MW supérieure^{de 27}.

Chaque système biologique étudié ainsi que chaque instrument utilisé peuvent nécessiter de petits changements de pression de gaz pour atteindre des niveaux optimisés de transfection et de propagation biologique. Le paramètre critique est la pression de l’impulsion d’hélium nécessaire pour extraire les micro ou nano-supports de la cartouche en plastique et les propulser dans le tissu. Une pression de gaz élevée affectera la survie cellulaire, car elle créera des ondes de choc à travers la cible et perturbera ou détachera le tissu de la matrice¹⁷. Il est important de viser le canon du pistolet à gènes et d’avoir l’appareil exactement perpendiculaire au tissu pour une administration biolistique précise. La zone sélectionnée doit être placée au centre direct du canon à précisément 10 mm de l’ouverture extérieure. Il en résulte un diamètre de 3 mm de livraison de particules d’or autour de l’épicentre. Le canon du pistolet à gènes doit être nettoyé avec de l’éthanol à 70 % après chaque utilisation. Pour protéger le tissu des gros agrégats de particules, le canon contient également une maille en nylon qui doit être remplacée régulièrement pour maintenir des performances optimales. Afin de remplacer la maille, dévissez le capuchon puis insérez une nouvelle maille en nylon entre le capuchon et le joint torique.

Les cellules marquées par fluorescence doivent être visibles au moins 1 à 2 jours après la transfection autour de l’épicentre. L’absence ou le désalignement de l’étiquetage peut résulter d’une préparation inadéquate et d’une instabilité du montage du canon à gènes. L’observation des cellules à l’aide de la microscopie confocale dépend d’un certain nombre de facteurs : la longueur d’onde de la lumière d’excitation/émission, la taille du sténopé, l’ouverture numérique de la lentille de l’objectif, l’indice de réfraction des composants dans le trajet de la lumière, la profondeur du tissu et l’alignement de l’instrument. Ces facteurs doivent être optimisés pour chaque système à l’étude.

Les progrès récents de la biolistique ont été exploités pour le succès de cette méthode. Le canon du pistolet à gènes utilisé dans cette étude a été modifié afin de réduire la pression nécessaire ainsi que de canaliser le modèle de diffusion biolistique dans une zone plus contrainte et spécifique^17,19. D'autres modifications du canon ont tenté de restreindre la propagation biologique et de réduire la pression d'écoulement²⁸ , mais ce canon de pistolet à gènes conçu sur mesure et conçu par le Dr O'Brien est un seul composant monté sur le pistolet à gènes Helios standard. Par la suite, des particules d’or submicrométriques ont été utilisées pour réduire le caractère invasif des particules micrométriques qui, selon nous, causaient des dommages cellulaires et, finalement, une perte d’expression génique hétérologue soutenue. Ces modifications apportées à la procédure biologique ont amélioré la faisabilité et la reproductibilité globales de la méthode¹³. D’autres améliorations apportées à la préparation des tranches, telles que le dépannage approfondi de la procédure de tranchage, l’utilisation d’une matrice DMEM-Agarose pour préserver le cerveau, et de nombreuses autres avancées utiles dans la préparation de coupes de cerveau organotypiques précédemment signalées¹³ nous ont permis d’explorer l’utilisation de tranches adultes qui ont développé des réseaux synaptiques matures.

Dans notre étude, nous avons principalement utilisé des colorants et des gènes hétérologues fluorescents pour visualiser la morphologie cellulaire comme une lecture de l’efficacité de la transfection et une capacité à imager les caractéristiques morphologiques des neurones dans les tissus cérébraux de souris. Le rapport signal sur bruit de la livraison stochastique dans un rayon défini nous a permis d'isoler complètement le port denttritique d'une seule cellule dans son contexte natif. Étant donné que de nombreux efforts sont déployés pour étudier ces caractéristiques morphologiques, cartographier la connectomique ou pour marquer des cellules uniques pour diverses analyses, cette méthode pourrait facilement être combinée avec des protocoles existants tels que l'électrophysiologie et les mesures de neurites^29,30. De toute évidence, les combinaisons de gènes hétérologues fluorescents pourraient permettre une délimitation beaucoup plus robuste des cellules uniques comme la distribution stochastique des protéines fluorescentes, et leur combinaison déterminerait la couleur des cellules individuelles^31,32. L’utilisation de promoteurs cellulaires spécifiques tels que la synapsine et la protéine d’acide fibrillaire glial en amont de l’exon du gène hétérologue peut également restreindre l’expression aux sous-populations³³. En effet, la variété infinie du matériel génétique pourrait également être délivrée de manière régiosélective par des nanoparticules d’or en utilisant ce même procédé. Les régions transfectées totales pourraient ainsi être analysées avec des méthodes traditionnelles, telles que la dissection et la soumission de cette région à l’immunoblot occidental pour analyser l’effet localisé du gène hétérologue.

L’amélioration des procédures de coupe organotypique permettra également une utilisation plus large des tissus cérébraux pour l’expérimentation à long terme, ainsi que l’utilisation d’autres tissus et cocultures et facilitera les procédures de transfection. Il a déjà été rapporté que la transfection des lipides et des polymères affecte l’homéostasie membranaire, l’internalisation, la perméabilité aux protéines³⁴ et montre souvent une très faible efficacité pour transfecter les neurones différenciés en phase terminale. Le ciblage de la cargaison spécifique aux cellules ne se prête également qu’aux cellules qui expriment les récepteurs de surface cellulaire nécessaires à l’internalisation, et bien que cette méthode puisse être très sélective, elle peut manquer de régiosélectivité ciblée³⁵. Par ailleurs, les vecteurs viraux sont souvent difficiles et coûteux à produire, nécessitent des réglementations strictes et ont parfois démontré des problèmes de sécurité. L’administration biolistique a donc une capacité inégalée à transfecter de manière régiosélective des neurones et d’autres types de cellules dans des tissus viables. Comme l’or n’est pas toxique, d’autres progrès dans l’utilisation de la biolistique pourraient ouvrir la voie à des utilisations biomédicales telles que l’administration pharmaceutique transdermique, l’administration non invasive de gènes in vivo , ainsi que les thérapies géniques non virales localisées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système de pistolet à gènes Helios	Bio Rad	165-2431	Station de préparation de pistolets à gènes et de tubes
HEPES  ;	Sigma	83264-100ML-F
NaCl	Sigma	S7653-250G
KCl	Sigma	P9333-500G
Na2HPO4	Sigma	S7907-100G
KH2PO4	Sigma	P9791-100G
0.2 µ ; m unité de filtration stérile	Millipore	SCGPU05RE	à média filtrant
DMEM	Gibco	21885-025
Sérum de veau fœtal	Gibco	10270-098
D-Glucose	Sigma	G8270-100G
N2	Life Technologies	17502-048
Pénicilline/Streptomycine	Sigma	p4333
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	856568-100G
Éthanol  ;	Sigma	277649-100ML
Spermidine	Sigma	S2626
Agarose	Bio Rad	161-3100EDU
Vibroslicer	Laica	VT1200	Nous avons utilisé une conception personnalisée
Support			Construit en interne à l’Université de Toronto
Incubateur de culture cellulaire humidifié Nanoparticules
d’or	cytodiagnostic	G-40-20
pEYFP-N1	Clontech
Coupe-tube	Bio Rad	165-2422
Tube en tefzel	Bio Rad	165-2441
Cylindre			Fabriqué sur mesure par le LMB
Insert de culture cellulaire	Millipore	PICM0RG50
Paraformaldéhyde	Sigma	76240 Fluka
		de dissection	pour plus de commodité
Microscope			défini par l’utilisateur pour l’utilisation
Lame de verre	VWR	2588-CA48323-185
Verre Microcover	VWR	2448-CA48366-067-1
Média de montage Vectashield	Vector laboratories	H-1400  ;   ;