Article de méthode

Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

DOI :

10.3791/52155

⸱

8 janvier 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Leicester, 2Center for Fisheries, Environment and Aquaculture Sciences, 3ES Cell Facility, Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Les méthodologies de ciblage génique peuvent être utilisées pour générer des souris transgéniques avec des allèles knockout, knock-in et marqués. Ici, nous décrivons une méthode améliorée de recombinaison chez E. coli, que nous appelons « sous-clonage plus insertion », qui peut être utilisée pour générer rapidement des vecteurs de ciblage génique personnalisés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le ciblage génique fait référence à la modification précise d’un locus génétique par recombinaison homologue. La génération de nouvelles lignées cellulaires et de modèles de souris transgéniques à l’aide de cette méthode nécessite la construction d’un vecteur « de ciblage », qui contient des séquences d’ADN homologues au gène cible, et a été pendant de nombreuses années une étape limitante dans le processus. La construction de vecteurs peut être réalisée in vivo dans des cellules d’Escherichia coli en utilisant la recombinaison homologue médiée par des recombinases de phages à l’aide d’une technique appelée recombinaison. La recombinaison est la technique privilégiée pour sous-cloner les longues séquences d’homologie (>4kb) et divers éléments de ciblage, y compris les marqueurs de sélection qui sont nécessaires pour médier un échange allélique efficace entre un vecteur de ciblage et son locus génomique apparenté. Les protocoles de recombinaison typiques suivent un schéma itératif d’intégration par étapes des éléments de ciblage et nécessitent des étapes intermédiaires de purification et de transformation. Ici, nous présentons une nouvelle méthodologie de recombinaison de l’assemblage vectoriel à l’aide d’une approche multiplexe. La réparation des lacunes plasmidiques est réalisée par la capture simultanée de séquences génomiques à partir de banques de chromosomes artificiels bactériens de souris et l’insertion de marqueurs de sélection bactériens et mammifères doubles. Cette méthode de sous-clonage et d’insertion est très efficace et produit une majorité de recombinants corrects. Nous présentons des données pour la construction de différents types de vecteurs conditionnels d’inactivation de gènes, ou knock-in, et de vecteurs rapporteurs BAC qui ont été construits à l’aide de cette méthode. La construction vectorielle SPI élargit considérablement le répertoire de la boîte à outils de recombinaison et fournit une méthode simple, rapide et rentable de construction de ces vecteurs très complexes.

Introduction

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Le développement de technologies géniques ciblant a permis la construction de lignées cellulaires et des modèles de souris pour étudier différents systèmes biologiques 1-3. Une première étape clé dans la modification d'une séquence génomique est la conception et la construction d'un gène vecteur de ciblage 4. Des vecteurs de ciblage sont des constructions plasmidiques qui portent l'allèle d'intérêt contenant les modifications désirées (s) flanqué par un marqueur de sélection (par exemple, la néomycine), et de longues régions génomiques nécessaires pour une recombinaison homologue efficace dans des cellules de mammifères 5. Modification génétique précise est obtenue par l'introduction du vecteur de ciblage dans souches embryonnaires (ES) des cellules 6 ou des cellules somatiques 7, dans lequel la recombinaison homologue entre les tronçons identiques de la séquence d'ADN sur le vecteur de ciblage et les résultats de locus génomiques dans le transfert de la modification envisagée au génome par conversion génique 8. Cette modified cellules ES peuvent être injectées dans des blastocystes de souris pour produire une descendance (chimères) qui peut ensuite transmettre ces allèles modifiés via la lignée germinale 9. Une voie alternative pour produire des souris transgéniques implique la micro-injection d'un vecteur d'expression de gènes dans des zygotes unicellulaires de souris, ce qui conduit à l'intégration aléatoire du vecteur dans le génome de la souris 10. Les méthodes traditionnelles de construction du vecteur sont appuyés sur conventionnelle "couper-coller" clonage en utilisant des enzymes de restriction et les ligases d'ADN à cloner les différents marqueur de sélection et des fragments génomiques dans un squelette du vecteur. Cependant, un facteur limitant inhérente de clonage traditionnel est le positionnement et le choix des sites de restriction, en particulier avec de plus longues séquences d'ADN. Ceci nécessite souvent plusieurs étapes de sous-clonage et introduit également des séquences d'ADN étranger dans le vecteur, ce qui conduit souvent à une efficacité inférieure de ciblage de gène.

Recombineering (eng recombinogèneineering) est une technologie d'ingénierie d'ADN qui surmonte ces limitations en utilisant une recombinaison homologue (HR) à médiation par des protéines de recombinaison phage dans E. cellules de E. coli 11,12. Etant donné que ne importe quelle région d'une séquence homologue peut servir de substrat de recombineering, les contraintes de disponibilité de sites de restriction sont enlevés. De grandes séquences d'ADN peuvent être modifiés de façon transparente directement in vivo, préservant ainsi aussi leur intégrité structurelle 13. Recombineering est très efficace avec des homologies courtes (50 pb) 14 et donc bras d'homologie (HA) peuvent être facilement incorporés dans des séquences d'oligo synthétiques. Dans une expérience de recombineering typique, un oligo ou un fragment d'ADN double brin (ADNdb) contenant HA est électroporation dans E. recombineering compétente cellules de E. coli contenant la cible située soit sur ​​le chromosome ou sur un plasmide 15. Le potentiel de recombinaison est conféré par l'expression inductible de la rec-Rougeombinaison protéines de phage 16,17 ou les protéines RecET du prophage rac 18. Le exonucléase Rouge / RecE convertit ADNdb linéaires à un ADN simple brin (ADNsb) intermédiaire, qui est ensuite lié par son partenaire, Rouge / RecT, un seul brin protéines de recuit (SSAP) 19. Le recuit d'un long ou un court ADNsb oligo à sa séquence cible complémentaire se produit sur la mèche de ralentissement de la fourche de réplication et conduit à l'incorporation de la séquence au niveau du site cible. Retard brin ssADN recombinaison est la base de la grande efficacité de recombineering et peut être décrit par la 'beta' modèle de recombinaison 20,21.

Un workflow de recombineering typique pour construire un vecteur de ciblage de gène implique l'une des deux voies suivantes. Une voie consiste à sous-clonage de la région génomique désirée à partir d'un clone BAC de la souris dans un plasmide, suivie par l'insertion séquentielle des sites de recombinaison LoxP, un marqueur de sélection 22 etc., ou la voie alternative consiste à cibler le locus génomique de BAC avec les différents éléments de vecteur de ciblage par plusieurs tours de recombineering 10,23 puis sous-clonage du locus modifié dans un plasmide par écart de réparation clonage 24,25. Variations sur ce thème ont été utilisés dans différents pipelines à haut débit recombineering dans le cadre de programmes de production à grande de souris 26,27. Toutefois, ces procédures impliquent les étapes longues et complexes, nécessitent l'utilisation de vecteurs spécialisés et E. coli souches (par exemple, des cellules exprimant Cre) et d'utiliser une ou plusieurs étapes intermédiaires de purification de l'ADN vecteur et re-transformation (tableau 1). Sous-clonage insertion plus (SPI) est une nouvelle technique de recombineering qui combine beta recombinaison et la réparation écart clonage dans un processus unique (Figure 1). SPI assemblage de vecteur est simple, rapide et flexible et offre une amélioration significative sur recombi normeingé- approches (tableau 1). Ici, nous démontrons la facilité et l'utilité de l'aide SPI pour différentes applications de construction du vecteur avec un accent particulier sur la construction de conceptions de vecteur non-standard et difficiles. Les cas de tests comprenaient la construction d'un vecteur reporter de Knockin fluorescent, une expression de protéine marquée vecteur Knockin double, un vecteur rapporteur fluorescent de BAC et un vecteur de knock-out conditionnel. Ceux-ci ont examiné diverses à l'exigence de localiser un récepteur de surface cellulaire, la purification d'un complexe de protéine nucléaire ou ablatent conditionnelle l'expression d'un gène.

Protocole

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1. Gene Targeting Conception

  1. Commander un clone BAC appropriée couvrant la région génomique d'intérêt. Assurez-vous que ce est isogène du type de cellules ES être modifié par exemple, des clones RPCI-23 et RPCI-24 BAC pour le ciblage de gènes avec C57BL / 6 cellules ES.
  2. Appliquer les critères de ciblage génique classique lors de la conception du vecteur de ciblage. Les paramètres clés comprennent si la modification est nécessaire pour être constitutive ou conditionnelle, définissant exons critiques (CE) pour la suppression dans une stratégie de gène KO et l'espacement et l'emplacement des cassettes introniques.
    NOTE: Chacun de ces a été discuté en détail par ailleurs 10.
  3. Choisir chacune des régions génomiques 5-6 kb flanquant le site de modification cible.
    NOTE: La taille de l'insert sous-cloné est donc typiquement 10-12 kb, bien que la limite supérieure peut être aussi élevée que 80 kb avec un faible nombre de copies sous-clonage plasmide comme p15A, pBR322, etc., et jusqu'à 200 kb avec un taux d'alcoolémievecteur.

2. Multiplex Recombineering Oligos

  1. oligos de conception pour le squelette plasmidique (sous-clonage de plasmide) et le marqueur de sélection (cassette d'insertion). Concevoir chaque oligo telle qu 'elle contient 180 pb flanquant le HA de site cible génomique et 20 pb de la séquence d'amorçage spécifique de la cassette d'insertion ou de sous-clonage du plasmide (Figure 2).
    REMARQUE: bras homologie ne doivent pas contenir d'éléments répétitifs, la présence d'éléments répétitifs se traduira par ciblage incorrect et sous-clonage. Éléments répétitifs peuvent être détectés en utilisant des outils basés sur le Web tels que le '' Répéter Masker ''.
  2. Inclure un site unique d'enzyme de restriction (RE) sur l'un des oligos de vecteur pour linéariser le vecteur de ciblage de gène de cellules ES ciblé (figure 2).
  3. Contrôler les paramètres de oligo aide d'un programme oligo de l'analyseur. Prenez soin d'éviter des structures secondaires dans la région d'amorçages.
  4. Shorter HA (50 pb) de la cassette d'insertion est tolérée et donne plus faible nombre de recombinants mais faire en sorte que le sous-clonage du plasmide HA est toujours plus long (180 pb).
  5. Déterminer l'orientation de l'insert d'ADN génomique du clone BAC notamment en utilisant des outils basés sur le Web tels que '' cloneDB ''. Établir la direction de réplication à partir de Oris en cochant la carte du plasmide squelette BAC utilisé dans la construction de la bibliothèque BAC.
    REMARQUE: ORIS est généralement opposée à la direction de transcription du marqueur Chloramphenicol (Chl) pour tous les plasmides BAC couramment utilisés.
  6. Ajouter deux phosphorothioate (PTO) liaisons terminales à l'extrémité 5 'de l'oligonucléotide qui est opposée à la direction de réplication sur le clone BAC. Ajouter une modification phosphate en 5 'de l'oligo inverse (figure 2).
    NOTE: La cassette PCR phosphorothioate asymétrique en digestion Rouge génère un ADN simple brin intermédiaire qui peut amorcer le brin retardéde la fourche de réplication.
    REMARQUE: Maximal multiplex fréquence de recombinaison est observée avec les brin retardé cassettes protégées. Brin précoce protégée ou cassettes double protégées peut ne pas produire l'efficacité de recombinaison équivalents à une loci.
  7. Commandez oligos avec PAGE ou la purification HPLC.

3. BAC Clone transformation avec pSC101 BADgbaA Recombineering plasmide.

  1. Pour rendre le E. souche de E. coli portant le recombineering BAC compétents, transformée avec le plasmide pSC101 BADgbaA contenant les gènes rouges 16.
    NOTE: Le plasmide pSC101 BADgbaA contient les Rouge et RecA gènes sous le contrôle de la Arabinose inductible araC-P BAD promoteur, un marqueur de sélection de la tétracycline et la température sensibles pSC101 réplicon.
    1. Poignarder une pointe de pipette stérile dans la culture d'agar BAC et inoculer 5,0 ml de bouillon de lysogénie (LB) pH 8,0 contenant 12,556; g ml -1 Chl. Croître à 37 ° C pendant 5 heures sous agitation à 200 rpm.
    2. Réfrigérer 10% (v / v) solution de glycérol, microtubes et cuvettes d'électroporation sur la glace. Refroidir une grande centrifugeuse réfrigérée et microcentrifugeuse à 4 ° C.
    3. Déterminer la densité optique (DO) de la culture en utilisant un spectrophotomètre et mesurer l'absorbance à 600 nm. Préparer des cellules électrocompétentes (comme décrit ci-dessous) quand une DO 600 de lecture de 0,3 à 0,8 est atteint.
    4. Centrifuger les cellules dans un tube de centrifugation de 50 ml dans une centrifugeuse à grande 1216 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    5. Laver les cellules avec 1 ml de réfrigérés 10% de glycérol et centrifuger les cellules à 17 949 g pendant 20 secondes à 4 ° C. Effectuer l'étape de lavage un total de 3 fois.
    6. Remettre en suspension les cellules dans un volume total de 50 ul de glycerol à 10% et ajouter de 10 à 200 ng du plasmide pSC101 recombineering BADgbaA. Obtenir une suspension cellulaire unique par pipetagede haut en bas plusieurs fois et ensuite transférer les cellules à un pré-réfrigérés 1 mm écart cuvette d'électroporation.
    7. Électroporation des cellules avec un réglage de 1,8 kv, 25 pF et 200 Ω.
      REMARQUE: Vérifiez les paramètres corrects pour chaque marque de électroporateur. Une constante de temps de l'électroporation moins de 4 indique la présence de sel et d'autres impuretés.
    8. Récupérer immédiatement les cellules dans 1 ml de LB et transférer les cellules dans un tube de centrifugation de 50 ml.
    9. Cultiver la culture BAC gbaa à 30 ° C pendant 2 heures sous agitation à 200 rpm.
      NOTE: Le plasmide pSC101 BADgbaA est perdue lorsque les cellules sont cultivées à 37 ° C en raison de l'inactivation du facteur de réplication sensible à la température de repe. Cultiver les cellules gbaa à 30 ° C afin de maintenir les fonctions de recombineering.
    10. Ajouter 9 ml de LB contenant 12,5 pg ml -1 Chl et 4 pg ml -1 tétracycline (Tet) à la culture de BAC gbaa récupéré. Cultivez laBAC gbaa culture O / N à 30   ° C sous agitation à 200 rpm.
      NOTE: L'efficacité de transformation de l'électroporation gbaa plasmidique surenroulé est suffisamment élevée pour permettre la croissance de saturation O / N dans des milieux liquides.

4. Préparation d'insertion Cassettes et Sous-clonage plasmides

  1. Pour incorporer HA dans la cassette (s) d'insertion et le plasmide de sous-clonage, effectuer la réaction en chaîne par polymerase (PCR) en utilisant les oligos modifiés de temps comme décrit ci-dessous.
    1. Facultatif: Pour éviter plasmide report dans la réaction de recombineering, utilisez une origine R6K ou un modèle étroite gamme d'hôtes de plasmide similaire pour amplifier la cassette d'insertion.
    2. Alternativement, linéariser le modèle de plasmide en utilisant une digestion RE (tableau 2). Choisir un RE qui coupe à l'extérieur de la région d'amplification par PCR et est inactivé à la chaleur. Chaleur inactiver les RE tel que recommandé par le fabracturer.
    3. Mettre en place la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant un système d'ADN hotstart polymerase haute fidélité. Préparer un mélange maître PCR comme détaillé (tableau 3). Effectuer cyclage thermique comme indiqué (tableau 3).
  2. Analyser les produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose. Charge 1-5 pi de chaque PCR sur un 1% (p / v) contenant du gel d'agarose à 0,5 mg ml-1 de bromure d'éthidium (EtBr).
    REMARQUE: La présence de produits d'amplification non spécifiques ne interfère pas dans la réaction de recombineering. Dans certains cas cependant, des dimères d'amorces peuvent diminuer l'efficacité de recombineering.
  3. Purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification PCR.
    1. En option: supprimer le modèle de plasmide de PCR par traitement avec Dpnl suivie par PCR clean-up. ADN Elute dans un volume minimal d'eau déminéralisée stérile (tel que recommandé par le fabricant).
      REMARQUE: Ajout de Dpnl au PCR non purifié réactions des résultats en réduction de l'efficacité du clivage de ee matrice d'ADN plasmidique méthylé.
  4. Quantifier PCR ADN amplifié par analyse de gel d'agarose contre un ensemble connu de normes d'ADN par exemple, λ HindIII digest ou en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop.

5. Sous-clonage plus insertion

  1. Diluer le O / N BAC gbaa culture 50 fois en ajoutant 200 ul dans 10 ml de LB + Chl + Tet. Croître à 30   ° C sous agitation à 200 tours par minute pendant 1 h 50 min. Inclure un échantillon à être utilisé comme contrôle négatif.
  2. Réfrigérer tous les matériaux et équipements recombineering à 4 ° C comme décrit dans l'étape 3.1.2.
  3. Verser LB agar pH 8 plaques contenant la concentration appropriée de l'antibiotique sélectif approprié (s) qui va permettre la sélection du fragment d'ADN qui est insérée ainsi que pour la sélection du vecteur de sous-clonage (tableau 4).
    NOTE: Certains antibiotiques sont sensibles au pH. Utiliser LBagar pH 8 en règle.
  4. Préparer un 10% (p / v) de solution de L-arabinose. Stériliser par filtration à travers un filtre à seringue de 0,2 um.
    REMARQUE: arabinose induit l'expression des protéines à partir du plasmide recombineering gbaa.
  5. Vérifiez la DO de la culture BAC gbaa aide d'un spectrophotomètre. Une fois une DO 600 de 0,25 à 0,3 est atteint, induire les protéines de recombineering comme décrit dans l'étape suivante.
  6. Ajouter 200 ul de la solution de 10% arabinose à 10 ml de la culture d'alcoolémie pour atteindre une concentration finale de 0,2% de l'arabinose. Inclure une culture non induite (sans Arabinose) pour être utilisé comme contrôle négatif.
  7. Transférer la culture de BAC à un 37   ° C incubateur agitateur et induire l'expression Rouge pendant 45 min en agitant à 230 rpm.
    NOTE: L'expression de protéines Red est inefficace à 30 ° C.
  8. Isoler les cellules et laver avec 10% de glycérol 3 fois comme décrit à l'étape 3.1.5.
  9. Ajouter 600-1,000 ng de chacun du plasmide et de sous-clonage de la cassette (s) d'insertion à la réaction de recombineering. Inclure un seul vecteur et le vecteur ainsi que les contrôles d'insertion unique de vérifier la compétence et l'intégrité de recombinaison du vecteur et les cassettes.
  10. Obtenir une suspension de cellules isolées par pipetage de haut en bas. Effectuer électroporation comme décrit dans l'étape 3.1.7 et reprise ultérieure de 1 ml LB à 37 ° C pendant 1 heure pour les plasmides à copies multiples ou dans 10 ml de LB à 37 ° C pendant 3 heures pour les vecteurs BAC.
  11. Plate différentes dilutions de la culture récupéré par exemple, 90%, 10%, 1% sur des plaques de gélose au double sélection et de croître à 37   ° C pendant 16 heures.

6. Analyse des recombinants

  1. Facultatif: Choisissez 6-12 colonies et effectuer colonie PCR en utilisant une amorce flanquant HA et une amorce spécifique d'insertion. Inclure le plasmide de sous-clonage et la SAE d'insertionsette plasmide ainsi que le clone BAC parent comme témoins négatifs.
    1. Effectuer une analyse de gel d'agarose des PCR de colonie. Identifier des clones positifs par la présence d'une bande brillante à la taille attendue.
      NOTE: Le rendement élevé du processus de clonage SPI génère recombinants essentiellement correctes.
  2. Prélever des colonies dans 5 ml LB pH 8 contenant l'antibiotique sélectif et développer O / N à 37 ° C.
  3. Préparer minipreps ADN en utilisant un kit de purification sur colonne selon les instructions du fabricant.
  4. Préparer BAC ADN miniprep en utilisant l'isolement phénol-chloroforme standard ou un protocole similaire.
  5. Effectuer digère RE sur l'ADN miniprep. ADN séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Analyser les modèles de RE pour identifier les clones contenant les fragments tailles attendues du vecteur de ciblage correct. Choisissez une RE qui discrimine clairement entre le vecteur dépourvu insert (s) et le vecteur contenant l'insert (s).
  6. Optional: pour obtenir des cellules qui sont dépourvues de la BAC, qui est toujours présent dans la E. coli après recombineering, utiliser l'ADN miniprep de plasmide pour transformer DH5alpha ou DH10B E. cellules de E. coli.
  7. Effectuer séquençage de l'ADN à travers le HA et la cassette d'insertion pour vérifier les erreurs de synthèse oligo.

Résultats

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Vecteurs Knockin

Vecteurs de ciblage Knockin reflètent la nécessité d'introduire une nouvelle caractéristique de séquence dans le génome dont seule substitution de paire de bases dans une région codante de la protéine, la fusion d'un marqueur fluorescent ou un marqueur d'affinité à une protéine ou l'intégration d'une cassette d'expression de gène. Pour tester l'application de SPI dans les stratégies de construction de vecteurs de knockin, deux scénarios de test différents ont été examinés. Dnttip1 code pour la désoxynucléotidyltransférase, terminale, l'interaction protéine 1A (TDIF1) qui, avec la classe I de l'histone désacétylase (HDAC) former un complexe désacétylase mitotique (MIDAC) 28. Pour étudier le rôle de Dnttip1 dans la division cellulaire, une approche de marquage tandem affinité a été prise pour isoler le TDIF1 protéines interagissant. Les précédentes tentatives de sous-cloner une partie du gène Dnttip1 utilisant un vecteur de p15A contenant régions d'homologie longues traduite par une faible écart efficacité de réparation d'une fréquentes produits de recombinaison aberrante (données non présentées). Ainsi, la construction d'un vecteur de knockin au locus Dnttip1 fourni un exercice de recombineering difficile. Une stratégie SPI a été conçu pour sous-cloner une section de 12 kb du gène Dnttip1 enjambant le dernier exon (exon 13) dans un vecteur faible nombre de copies de p15A et pour insérer simultanément un marqueur d'affinité sélection de cassette double dans l'exon 13, en remplaçant le codon d'arrêt (figure 3A ). La protéine de liaison 2X FLAG-calmoduline (CBP) liée FRT-PGK-EM7-néomycine (Neo) -BGhpA-FRT cassette (2,0 kb) a été amplifié à partir d'un RE linéarisé plasmide en utilisant la double PTO oligos modifiés qui contenait 120 pb HA flanquant le Dnttip1 codon stop. Un vecteur de sous-clonage Dnttip1 p15A zéolite (1,7 kb) a été construit qui contenait 200 pb de régions homologues aux extrémités de la séquence Dnttip1 à être sous-clonés. Le plasmide a été sous-clonage Dnttip1 RE linéarisé et amplifié par PCR avec 20 pb modifiée oligosqui a généré un brin protégé contre les vecteurs d'attaque. Les produits de PCR ont été traités Dpnl, purifié et co-électroporation dans recombineering compétente Dnttip1 BAC E. cellules de E. coli ainsi que des cellules de contrôle non induites. Les réactions ont été étalées sur SPI zéocine (Zeo) et de la kanamycine (Kan) contenant des plaques de gélose (figure 3B). SPI a produit le vecteur de Knockin Dnttip1 modifié correctement dans tous les 12 recombinants analysés (figure 3C). Le séquençage d'ADN a vérifié l'absence de toute erreur résultant de la synthèse d'oligo ou amplification par PCR.

Un autre exemple de SPI impliqué l'insertion dans le cadre d'une protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) liée cassette de sélection au niveau du gène P2rx1. Le gène code pour un récepteur P2rx1 G couplé à la protéine qui fonctionne comme un canal ionique ATP-dépendant 29. Attelage de fluorescence YFP permet le suivi du récepteur P2X1 sur la surface cellulaire en vaessais fonctionnels Rious. P2rx1 est un autre locus difficile qui a présenté des problèmes importants avec des méthodologies de recombineering classiques (données non présentées). Utilisation SPI, un segment de 12 kb du gène P2rx1 englobant l'exon terminal (exon 12) a été sous-cloné dans un vecteur p15A zéolite et modifié par l'insertion concertée d'une cassette néo EYFP -LoxP flanqué remplaçant le codon stop dans l'exon 12 de construire le P2rx1-EYFP vecteur Knockin (Figure 3D). Dans cet exemple, le brin vecteur p15A protégée retard (1,7 kb) contenait 230 pb HA et la cassette EYFP contenait 50 pb HA et a également été laissée inchangée. La cassette d'insertion de EYFP (2,7 kb) a été assemblé par collage chevauchement par PCR du gène de l'EYFP, la PCR amplifié à partir pEYFP-C1, et la cassette LoxP- PGK-EM7-Neo-bGHpA-LoxP, amplifié par PCR à partir de pL452 (NCI, Frederick) . La réaction produit des centaines de SPI colonies (données non présentées). Analyse de l'ADN REminipreps préparés à partir de 11 clones ont montré que la majorité contenait le P2rx1-EYFP vecteur Knockin correctement assemblé (figure 3E). Une validation supplémentaire par séquençage de l'ADN a montré sans erreur insertion de la cassette EYFP. Cependant, certains des clones ont montré des profils de l'écart non balisé réparé et l'écart réparé plasmides marqués dans la même cellule (voies 6-9). Quelques échantillons contenaient également incorrectement réparé écart (piste 2) ou un mauvais ciblage des plasmides (pistes 4 et 5). L'échec de sous-clonage simultané et le ciblage dans certains recombinants SPI met en évidence les limites de l'efficacité du clonage SPI lors de l'utilisation de grandes cassettes (> 3 ko), qui se posent des contraintes sur processivité Rouge de fragments 30 d'ADN longues, ou si vous utilisez HA courte. En effet, l'augmentation de la HA de la cassette EYFP à 200 pb augmenté l'efficacité SPI et le ciblage correct de la cassette (données non présentées). Le ciblage de gènes avec le P2rx1 - vecteur de Knockin EYFP dans JM8.N4cellules ES de souris (C57BL / 6 de contrainte) ont généré six clones positifs sur 96, qui contenaient la séquence P2rx1-EYFP correctement ciblée (figure 3F).

BAC Reporter Vecteurs

Un clone BAC du gène cible contient souvent tous les éléments nécessaires en amont et en aval de réglementation, par exemple, des amplificateurs, etc., ainsi UTR du promoteur endogène pour diriger l'expression de gènes à des niveaux naturels 31. Un vecteur BAC rapporteur est donc le vecteur privilégié de récapituler le profil d'expression d'un gène endogène 32. Cependant, la grande taille d'un plasmide de BAC (jusqu'à 200 kb) présente des problèmes pratiques importants avec la transfection d'un BAC intacte dans les cellules 33. Réduire la taille de l'insert génomique BAC travers BAC coupe 34,35, tout en conservant les éléments réglementaires nécessaires d'un gène, permet une manipulation plus facile de la BAC et les résultats dans un transfecti plus efficacesur. La technologie actuelle de l'ingénierie de BAC implique de multiples tours de recombineering pour atteindre cet objectif 35. Pour démontrer l'utilité de SPI dans BAC rognage, un vecteur pBeloBAC11 BAC a été utilisé pour sous-cloner une séquence génomique de 30 kb comprenant le gène de pleine longueur de P2rx1 du 168 kb P2rx1 BAC avec l'insertion simultanée d'une cassette d'EYFP dans le gène P2rx1 (Figure 4A). Le vecteur de zeo épine dorsale pBeloBAC11 (6,5 kb) contenant 180 pb HA a été amplifié par PCR avec les oligos modifiés qui ont généré un vecteur protégé brin tardif. La même cassette EYFP Neo (3 kb), utilisé dans la construction précédente P2rx1 vecteur knockin, est amplifié par PCR en utilisant les oligos protégées brin retardé contenant 180 bp HA et la cible de l'exon 12 P2rx1 remplaçant le codon d'arrêt. Après l'électroporation combiné de la cassette de EYFP et le vecteur pBeloBAC11 zéolite dans P2rx1 BAC cellules expresseur les protéines de recombineering gbaa, la culture a été récupéré dans 10 ml de LB pH 8 pendant 3 heures à 37 ° C pour séparer les plasmides BAC. Recombinants purs ont été sélectionnés sur Zeo Kan et des plaques de gélose et ont été observés à une fréquence de 2 x 10 -6. Colony analyse de génotypage par PCR a révélé BAC réussie coupe dans les clones 3 sur 6 qui ont été analysés (figure 4B). Longue portée amplification par PCR dans le site d'insertion EYFP confirmé l'incorporation de la cassette correcte dans les trois clones positifs (figure 4B). Les trois clones ne ayant pas l'insert d'EYFP sont également incorrectement écart réparé à l'extrémité 5 ', bien que la cause du mauvais ciblage de la cassette EYFP dans ces clones peut être séparé de la fermeture correcte de l'extrémité 5' de BAC. Les trois clones BAC EYFP positifs ont été analysés avec digère RE et ont montré le rythme attendu de l'EYFP recombinant BAC correctement garni (figure 4C </ Strong>). L'analyse de séquence a révélé l'absence d'erreurs dans la cassette EYFP dans une seule clone sur les trois positifs.

Knock-out conditionnel (CKO) Vecteurs

Ablation conditionnelle de l'expression des gènes est un outil important pour étudier les processus de développement ou d'étudier les systèmes biologiques à un point de temps particulier. Une stratégie de KO génique conditionnelle implique généralement la mise en place de sites de recombinaison LoxP entourant un exon critique (CE). La suppression d'un CE lors de l'expression Cre ou activation produit un cadre de lecture et un codon stop prématuré, aboutissant à la dégradation de l'ARNm en raison de bêtises décroissance médiation (NMD). La construction d'un vecteur de ciblage de gène conditionnelle est une tâche complexe et implique plusieurs étapes de sous-clonage, le ciblage et la transformation 22. SPI offre une voie pratique pour simplifier ce processus. En cas de test, un allèle conditionnelle du gène a été construit Zrsr2en utilisant la méthodologie SPI (figure 5A). Le gène code pour un facteur Zrsr2 d'épissage et un seul exemplaire est situé sur le chromosome X. L'état conditionnel de deletion de gène est particulièrement important dans ce cas de contrôler la possibilité d'adapter les cellules à l'absence de Zrsr2 lors de la sélection de cellules ES dans une stratégie de ciblage de gène suppression constitutive. SPI a été réalisée pour sous-cloner une portion 10 kb du gène ZrSr2 avec insertion simultanée de deux cassettes de sélection flanqué de loxP différentes. Le FRT-PGK-EM7-néo-FRT-LoxP cassette (2 ko) a été amplifié par PCR à partir RE pL451 utilisant retard brin protégée oligos qui contenaient 180 pb HA ciblant le ZrSr2 intron 2. Une deuxième cassette contenant Rox-PGK-em7- digéré blasticidine (BSD) -Rox-LoxP (2 kb) a été amplifié par PCR à partir d'un plasmide R6K brin retardé avec oligos protégées contenant 180 pb HA identique à une région aval dans l'intron 3. Les deux sites LoxP flanquées d'exons 3, CE dont la deletion sur les résultats d'activation Cre conditionnelles dans un cadre de lecture et introduit un codon d'arrêt prématuré. Le sous-clonage de plasmide Zrsr2 (1,6 kb) a été amplifié par PCR à partir d'un plasmide p15A zéolite RE brin linéarisé en utilisant retard protégé oligos contenant 180 bp HA correspondant aux extrémités de la séquence Zrsr2 10 kb. SPI réactions ont été réalisées comme décrit précédemment et on les étale sur des plaques Zeo + Neo + BSD. Le ciblage conditionnelle vecteur ZrSr2 a été assemblé avec succès dans la plupart des 12 recombinants examinés (figure 5B). D'autres analyses de séquençage d'ADN a révélé une insertion correcte à la fois des marqueurs de sélection dans le vecteur ZrSr2 cko.

figure-results-1
Figure 1. SPI clonage. Vue d'ensemble du processus de clonage SPI combinant insertion de cassette et le sous-clonage en une seule étape. (A) Le clone BAC est transformed avec le plasmide pSC101 BADgbaA et cultivés à 30C. (B) Après l'induction arabinose pour exprimer les protéines rouges, la cassette d'insertion modifiée asymétrique et le plasmide de sous-clonage sont introduits dans le clone BAC et sélectionné avec deux d'insertion et de sous-clonage marqueurs pour générer le vecteur final. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.

figure-results-2
Figure 2. Représentation schématique illustrant la conception de SPI oligos recombineering. Le plasmide de sous-clonage et la cassette d'insertion sont tous deux générés par PCR en utilisant une combinaison de phosphate terminal et la prise de force oligos modifiés. Le fragment de PCR par digestion in vivo rouge, produit un ADN à un brin intermédiaire qui se apparie à la mèche de ralentissement de la fourche de réplication. Gene HA spécifique de 50 à 180 pb est incorporé dans chaque oligo, comme illustré. La flèche indique la direction de la replication d'ADN dans un gène candidat. La ligne pointillée représente la séquence de sous-clonage plasmidique pas incorporée dans le produit PCR. Site RE, le site d'enzyme de restriction de la linéarisation du vecteur final; F, séquence vers l'avant (20 pb) spécifique à la sous-clonage de plasmide ou d'une cassette d'insertion; R, séquence complémentaire inverse (20 pb) du plasmide ou d'une cassette; sm, marqueur de sélection. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 3. SPI permet la construction de vecteurs de knock difficiles. (A) Représentation schématique de la stratégie SPI utilisé dans la construction du vecteur Dnttip1 double étiqueté. Flèche indimission indique la direction de réplication sur le clone BAC. résultats (B) de placage des échantillons non induits et induits de l'expérience Dnttip1 SPI. (C) digestion par EcoRI de clones Dnttip1 SPI. M, 1 ko échelle (ONE); C, l'écart p15A Dnttip1 réparé plasmide manque l'étiquette de cassette double. Les tailles des fragments sont: balisé, 9,2 + 4,4 + 2,2 kb; le contrôle; 9,2 + 4,6 kb. (D) SPI base P2rx1-EYFP Knockin construction du vecteur. (E) digestion par EcoRI de clones P2rx1-EYFP SPI. M, 1 ko + échelle (Invitrogen); C, l'écart p15A P2rx1 réparé plasmide manque la cassette EYFP. Les tailles des fragments sont: balisé, 8,3 + 4,4 + 3,1 + 0,03 kb; le contrôle; 8,3 + 3,1 + 1,8 + 0,03 kb (F) l'analyse par transfert de Southern de P2rx1 -. Gène EYFP ciblage dans des cellules de cellules ES JM8.N4. Panneau supérieur, par transfert de Southern avec la sonde d'extrémité 3 'utilisant PshAI digest. Montré est le résultat de dépistage des cinq clones. Panneau inférieur, par transfert de Southern en utilisantla «sonde de fin et Spel condensé des positifs identifiés à partir de la 3 '5 dépistage final. Site PshAI RE; S, site Spel RE. La ligne pointillée représente la fin de l'HA des vecteurs. Boîte noire désigne sonde sud. Fragments de restriction attendus sont, PshAI: WT, 8,9 kb; EYFP-neo, 11,5 kb; Spel:. WT, 6,9 kb; EYFP-neo, 7,6 kb Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-4
Figure 4. BAC simplifié rognage à l'aide SPI. (A) Schéma illustrant le concept de BAC rognage à l'aide SPI. Explication des symboles est décrite sur la figure 1. Amplification (B) à travers la PCR 5 'et 3' de l'insert sous-cloné et à travers le insertio P2rx1-EYFPn place. La stratégie de dépistage est indiqué pour chaque type de PCR. M (panneau supérieur), Hyperladder 25 pb, (panneaux inférieurs), 1kb +; P, P2rx1 BAC; . S, plasmide pBeloBAC11 zeo sous-clonage (C) HindIII digérer des trois EYFP positifs clones BAC de SPI (B); E, prévu motif de restriction HindIII du EYFP BAC garni. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-5
Figure 5. conditionnelle génération de vecteur de clonage knockout en utilisant SPI. (A) Représentation schématique de l'insertion simultanée de deux flanqué de loxP cassettes de sélection au cours de différentes sous-clonage de l'allèle Zrsr2. Explication des symboles est décrite sur la figure 1 (B). </ Digère strong> EcoRI de clones Zrsr2 SPI. L, 1 ko échelle (ONE); C1, p15A ZrSr2 écart réparé plasmide, C2, l'écart p15A ZrSr2 plasmide contenant l'insert néo réparé; C3, l'écart p15A ZrSr2 plasmide contenant l'insert de bsd réparé. Les tailles des fragments sont: cko, 7,7 + 2,9 + 2,6 + 1,6 kb; C1 7,7 + 4,0 kb; C2, 7,7 + 4,3 + 1,6 kb; C3, 7,7 + 2,9 + 2,3 kb. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

un programme "3" Knockout Mouse (KOMP) haut débit pipeline de construction du vecteur. Durée moyenne de 3 semaines à 26 clone vérifiée.
Aucune des étapes Recombineering conventionnel pipeline une Multiplex recombineering b
Etape 1 Transformation de recombineering plasmide dans BAC hôte Transformation de recombineering plasmide dans BAC hôte. Préparation des vecteurs de ciblage cassettes et de sous-clonage.
Étape2 Insertion de la cassette R1 / R2 passerelle Multiplex écart réparation clonage
Etape 3 L'insertion de la cassette Kan floxée O / N de la culture des colonies isolées
Étape 4 Gap réparation en R3 / R4 plasmide préparation de plasmide et la vérification
Etape 5 Transformation en Cre + E. coli
Etape 6 préparation de plasmide et la vérification
Etape 7 O / N à trois voies de réaction passerelle
Etape 8 Transformation de la trois voies réaction passerelle dans DH10B E. cellules de E. coli
Étape 9 Culture de la nuit à partir de colonies isolées
Etape 10 préparation de plasmide et de vérification de séquence
b Durée moyenne de 4 jours pour clone vérifié

Tableau 1: Comparaison des recombineering conventionnel avec SPI dans la construction de vecteurs knock-out conditionnel.

Tampon RE 5 ul
ADN 1 pg de plasmide ou de produits de PCR purifiés
RE 1 pi (5 unités ou plus)
TE jusqu'à 50 ul
Incuber à 37 ° C pendant au moins 1 heure. Chauffer inacitvate selon les instructions du fabricant

Tableau 2: RE digest.

Matériaux PCR La concentration finale
Un tampon de PCR 1x
dNTP 200 nM
MgSO 4 1,5 mM
Bétaïne 1,3 M
DMSO 1%
Amorce sens 200 nM
Amorce inverse 200 nM
ADN polymérase 1 U
Modèle 10 ng de plasmides multicopies ou 2,5 ul d'ADN miniprep pour PCR de génotypage
Eau jusqu'à 50 pl d'une
Pour une réaction de PCR de 50 ul standard avec plasmides multicopies. PCR longue portée de génotypage ont été mis en place dans 25 réactions PCR ul.
Les conditions de PCR
95 ° C 2 min
92 ° C 10 sec
55 ° C 30 sec
72 ° C 30 sec
30 cycles b
b cycle ne peut être étendue à 35 pour le génotypage BAC PCR

Tableau 3: PCR Set-up et Conditions.

Antibiotiques Concentration d'un (pg ml -1)
Ampicllin 50
Blasticidin b 40
Chloramphénicol 12,5
Gentamicine 2
Hygromycine c 30
B kanamycine 15
Tétracycline 4
Triméthoprime c 10
Zeocin 5
un recommandé pour une utilisation avec des taux d'alcoolémie et plasmides multicopies lorsqu'il est utilisé dans des combinaisons en recombineering multiplex
b Blasticidin (35 pg ml -1) et kanamycine (6 pg ml -1) lorsqu'ils sont utilisés ensemble en combinaison
c Hygromycine et triméthoprime ne sont pas recommandés pour la sélection avec des taux d'alcoolémie de copie unique.

Tableau 4. Recommandé concentrations d'antibiotiques pour utilisation dans des expériences SPI.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Construction de lignes de cellules souches embryonnaires et les modèles de souris a historiquement impliqués ciblage de gène en utilisant des constructions plasmidiques qui contenaient l'allèle modifié 4. Cependant, la construction de ces vecteurs de ciblage génique complexes se est avérée être un obstacle important à la production rapide de ces modèles. Le développement de stratégies de construction du vecteur de recombineering base a permis l'amélioration des dessins vectoriels et assemblage de vecteur plus efficace. Néanmoins, les protocoles de recombineering actuels impliquent toujours plusieurs étapes, exigent la purification de plasmide intermédiaire et utilisent différentes souches bactériennes. Sous-clonage insertion plus offre une nouvelle approche pour la construction du vecteur qui peut être effectuée dans une épreuve d'électroporation dans la souche BAC hôte de résident. L'utilité de SPI dans le ciblage génique a été testée ici dans une variété d'applications de construction de vecteur. Dans tous les cas examinés ici, SPI se est avérée efficace et le plasmide recombinant a été produit correcte.Dans la majorité des cas, les multiples cassettes différentes ont été correctement inséré dans le vecteur de ciblage. Les grandes cassettes et des vecteurs d'ADN sont facilement logés dans le protocole SPI et ont démontré la souplesse de ce système.

SPI repose sur l'utilisation de séquences longues d'homologie et phosphorothioate (PTO) protection des cassettes d'ADN linéaire. modification de force confère une protection contre exonucléases à l'ADN linéaire 20,21 et la longue HA augmente l'efficacité de recombinaison pour permettre le multiplexage. Cependant, la synthèse des séquences plus longues oligo augmente les chances d'accumulation des erreurs en particulier des suppressions. Des mutations dans le oligo peuvent être particulièrement préjudiciable si elles couvrent des régions codantes de protéines. séquençage de l'ADN à travers le HA et couvrant la pleine longueur de la cassette insérée est fortement recommandé d'éliminer clones avec des altérations de séquence. Utilisation d'un système d'ADN polymerase haute fidélité est également recommandé d'éviter l'introduction d'uny erreurs de PCR. La longueur et la composition de l'HA du plasmide de sous-clonage est plus critique par rapport à celle de la cassette d'introduction (données non présentées). Pour les applications particulièrement sensibles comme la construction de vecteurs Knockin, où des mutations dans les régions d'exon ne sont pas tolérés, l'HA de la cassette d'insertion peut être raccourcie (50-120 pb) pour éviter les problèmes associés aux longs oligos. La cassette d'insertion peut également être laissée non modifié ou sous forme de phosphorothioate double (où la connaissance de la direction de la replication ne est pas disponible). Mais multiplexage dans ces cas nécessite encore longtemps protégé HA plasmides sous-clonage. Une mise en garde de cette stratégie particulière est l'abaissement de l'efficacité multiplexage qui peuvent avoir une incidence sur le clonage à des loci SPI différente.

La longueur de la cassette d'insertion et le plasmide de sous-clonage est un autre paramètre important dans le clonage SPI. Molécules d'ADN plus grands électroporer moins efficace et l'effet est cumulatif, compte tenu de la reexigence voulant introduire toutes les cassettes dans la même cellule (données non présentées). Le multiplexage est plus efficace avec des petites cassettes d'insertion. Fragments d'ADN de plus de 3 kb placer aussi une limite sur le traitement des ssADN médiation Rouge, qui est la plus efficace jusqu'à 3 kb 30. cassettes d'insertion de plus de 3 kb sont à double résection et recombinent moins efficacement par une voie indépendante de 20 bêta. Par conséquent, le dépistage de colonies suffisante pour identifier le clone correct devient important dans ces cas. Une durée plus longue de la recombinaison après électroporation augmente également les chances de guérison du clone correct à des exercices difficiles SPI. Jusqu'à quatre petites cassettes (<1,5 kb) peuvent être insérés en même temps que le processus SPI, bien que l'efficacité de multiplexage diminue avec chaque cassette additionnelle (données non présentées). Toutefois, cela reflète le résultat d'une expérience SPI optimale et il est conseillé de considérer les limites de multiplexage lors de l'utilisation de nombreuses grandes cassettes.

Le développement d'outils d'édition du génome comme cluster répétitions palindromiques courts régulièrement espacées (CRISPR) système de endonucléase -cas9 a permis la création de nouvelles modifications du génome et a conduit à plus efficace l'ingénierie des génomes 36. Cependant, ces nouvelles technologies ont complété ciblage génique vecteurs plutôt que de les supplanter. Il est envisagé que le système CRISPR-cas pourrait remplacer sélection antibiotique et affiner le protocole recombineering multiplex.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.R.R est l’inventeur d’une demande de brevet britannique sur la technologie de recombinaison multiplexe.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.R.R a conçu le projet, conçu et réalisé des expériences et préparé le manuscrit. E.J.K et S.E.M ont réalisé des expériences. Tous les auteurs ont contribué intellectuellement au manuscrit final. Ce travail a été financé par une bourse d’innovation de l’Université de Leicester à SEM et par une bourse de recherche senior du Conseil de la recherche médicale (MRC) du Royaume-Uni à S.M.C (MR/J009202/1). Le séquençage de l’ADN a été effectué par les Laboratoires des protéines et des acides nucléiques (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, Université de Leicester. Nous tenons à remercier A. Francis Stewart d’avoir fourni les plasmides Rox et Dre. Les plasmides pL451 et pL452 ont été obtenus auprès du National Cancer Institute (NCI), à Frederick, aux États-Unis.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Antibiotiques sauf ZeocinSigma : http://www.sigmaaldrich.comAmpicilline, A9518-5G ;
Chloramphénicol , C1919-5G ; blasticidine, 15205-25MG ; gentamicine, G1264-50MG ; hygromycine, H3274-50MG ; Kanamycine, : K1876-1G ;
Chlorhydrate de tétracycline, T7660-5G ; Triméthoprime, 92131-1G
ZeocinInvivogen :  ;ant-zn-1Zeocin est également disponible chez Life technologies/Fisher
C57BL/6 BAC clonesCHORI : https://bacpac.chori.org/  ;Les banques de BAC RPCI-23 ou RPCI-24clones de 129/Sv BAC peuvent être obtenus à partir du système d’ADN polymérase à démarrage rapide Invivogen ou Life technologies/Fisher
KODMillipore : https://www.merckmillipore.com71086-3
L-ArabinoseSigma : http://www.sigmaaldrich.comA3256-25G
Oligos longsIDT : https://www.idtdna.com ; Lien génétique : https://www.genelink.comUltramères IDT ou Oligos longs Gene LinkPTO et Phosphosphate disponibles en tant que modifications personnalisées. La purification PAGE est fortement recommandée pour les oligos longs.
Kit de purification PCR MinEluteQiagen : http ://www.qiagen.com  ;28004Les kits de purification PCR à élution minimale sont préférés.
QIAPrep Spin Mini Kit de préparationQiagen : http ://www.qiagen.com  ;27104La colonne de silice ou les kits de matrice similaire sont préférés.
Enzymes de restrictionNEB : https://www.neb.comDpnI : R0176LVoir le site Web de NEB pour une liste d’ER.
Les

Références

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R paration des lacunes plasmidiquesChromosome artificiel bact rienMarqueurs de s lection doubleVecteurs de knockout conditionnelVecteurs rapporteurs BACTransformation par lectroporationAnalyse par amplification PCR

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