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Article de méthode

Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de Wnt5a Causes kystes chez le poisson zèbre reins

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DOI :

10.3791/52156

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2 décembre 2014

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1Department of Medicine, Eastern Virginia Medical School, 2Department of Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Pediatrics, University of Michigan

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode de génération d’un modèle possible de poisson-zèbre de la maladie polykystique des reins. Nous avons utilisé des poissons Tg(wt1b :GFP) pour visualiser la structure rénale. L’inactivation de wnt5a s’est faite par injection de morpholino. La formation de kystes pronéphriques après l’inactivation de wnt5a a été observée chez ce poisson zèbre transgénique GFP.

Résumé

La polykystose rénale (PKD) est l’une des causes les plus fréquentes d’insuffisance rénale terminale, une maladie dévastatrice pour laquelle il n’existe aucun remède. Les mécanismes moléculaires conduisant à la formation de kystes dans la PKD restent quelque peu flous, mais on pense que de nombreux gènes sont impliqués. Wnt5a est une glycoprotéine non canonique qui régule un large éventail de processus de développement. Wnt5a agit par le biais de la voie de polarité cellulaire planaire (PCP) qui régule la division cellulaire orientée pendant l’élongation des cellules tubulaires rénales. Il a été constaté que des défauts de la voie PCP provoquent la formation de kystes rénaux. Notre article décrit une méthode de développement d’un modèle de maladie rénale kystique du poisson-zèbre par inactivation du gène wnt5a avec des oligonucléotides morpholino (MO) antisens wnt5a. Le poisson-zèbre transgénique Tg(wt1b :GFP) a été utilisé pour visualiser la structure rénale et les kystes rénaux après l’inactivation de wnt5a. Deux MO antisens distincts (AUG - et site d’épissage) ont été utilisés et les deux ont entraîné un phénotype de queue bouclée et la formation de kystes après l’inactivation de wnt5a. L’injection d’ARNm Wnt5a de souris, résistant aux MO en raison d’une différence dans la structure de la paire de bases primaires, a sauvé le phénotype anormal, démontrant que le phénotype n’était pas dû à des effets « hors cible » du morpholino. Ce travail soutient la validité de l’utilisation d’un modèle de poisson-zèbre pour étudier la fonction de wnt5a dans le rein.

Introduction

Poisson zèbre (Danio rerio) embryons ont été largement utilisé comme un modèle pour étudier le développement du rein et la polykystose rénale. Il existe de nombreux avantages à l'utilisation du poisson zèbre comme modèle animal: la faisabilité de l'étude des interactions génétiques, la capacité d'utiliser morpholinos antisens (MO) pour la protéine knockdown, la possibilité de doser rapidement un grand nombre d'embryons, et la facilité de visualisation des phénotypes d'organes en une larves vivantes. Les pronéphros est le premier rein à développer chez les vertébrés et est fonctionnel chez le poisson zèbre larves 2. La structure des pronéphros poisson zèbre est relativement simple par rapport à métanéphros mammifères, la troisième et dernière rein de développer chez les mammifères. Le néphron est l'unité de travail du rein, rein humain avec chacun contenant entre 3,4 et 500,000-1,000,000 néphrons chaque rein de souris ayant environ 13000 néphrons 5, il est difficile d'observer la structure de néphron unique in reins humains ou de souris. Le poisson zèbre n'a que deux néphrons, et chaque néphron poisson zèbre contient tous les composants majeurs trouvés dans le glomérule et les tubules de souris et les humains 6 et types similaires de cellules rénales spécialisés. Par rapport à d'autres modèles de vertébrés tels que Xenopus, le poisson zèbre néphron ressemble plus étroitement néphron de mammifère parce qu'il a un système fermé 7.

Au cours des dernières années, le génome du poisson zèbre a été séquencé, ce qui permet la mise en place de l'ensemble des outils génétiques, de vastes ressources mutantes et des collections de lignées rapporteuses dans des modèles transgéniques de poisson zèbre. Les pronéphros de poisson zèbre formes entre 12-72 heures après la fécondation (HPF) et peuvent être visualisées facilement dans les embryons transparents. La protéine de tumeur du Wilm WT1 est un facteur essentiel pour le développement du rein. Lignes de poisson zèbre transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur de wt1b Tg (wt1b: GFP) montrer GFP EXPREssion spécifiquement situé dans les régions pronephrique dans embryons de poisson zèbre, à partir de 17 hpf 8. Néphronophtise (NPHP), une maladie du rein kystique autosomique récessive, est causée par des mutations de gènes NPHP neuf. NPHP4 knockdown morpholino causé par la formation de kystes dans la Tg (wt1b: GFP). Poisson 10 Par conséquent, ce poisson transgénique est un modèle approprié pour l'observation des structures de rein et la formation de kystes au cours du développement rénal. Fait important, l'influence des modulateurs de développement du rein peut être étudiée en utilisant cette souche dans un temps et du travail de manière efficace.

Notre article décrit l'utilisation de Tg (wt1b: GFP) poisson comme un modèle de visualiser la formation de kystes rénaux après modulation génique. Nous avons utilisé le site d'épissage de début et anti-sens OM pour abattre le gène Wnt5a chez le poisson zèbre. Wnt5a est une glycoprotéine sécrétée non-canonique de la famille Wnt qui joue un rôle important dans le développement de divers organes et postnatal cellulairefonction 11. Wnt5a fonctionne par des voies Wnt non canoniques, y compris la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP), qui se est révélé jouer un rôle dans la division cellulaire lors de l'allongement orienté tubulaire rénale. Wnt5a régule la voie / PCP Wnt en formant un complexe avec le récepteur, comme la tyrosine kinase (Ryk), qui transduit en outre signalisation Wnt5a en formant un complexe avec le VANGL protéine de la polarité cellulaire plane 2 (Vangl2), favorisant ainsi Vangl2 stabilité 12. Défauts dans la voie de PCP peuvent entraîner dans la division cellulaire aléatoire et provoquer la formation de kyste rénal. Nous avons utilisé le Tg (wt1b: GFP) ligne poisson zèbre pour observer la formation de kystes rénaux suivante Wnt5a knockdown. Le Tg (wt1b: GFP) modèle de poisson zèbre permet l'imagerie en direct et l'observation en temps opportun de la structure du rein. Après Wnt5a knockdown, la formation de kystes rénaux a été trouvée à partir de 24 hpf; à 72 HPF, les kystes peuvent être trouvés dans les glomérules et les tubules proximaux. Cette méthode peut également être utilisée pour sCreen autres gènes qui pourraient provoquer la formation de kystes rénaux.

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Protocole

Déclaration de l'éthique: NOTE: Toutes les expériences de poisson zèbre ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Eastern Virginia Medical School.

1. Préparation Morpholino

  1. Conception et traduction synthétiser-blocage (août-) et épissage inhiber (jonction ou) anti-sens morpholino (MO) oligonucléotides pour le gène d'intérêt selon les instructions du fabricant (figure 1A). Se il vous plaît voir les informations du fabricant dans le tableau 1.
    NOTE: OM sont expédiées comme les stocks lyophilisés dans des bouteilles en verre.
  2. Ajouter de l'eau stérile de haute qualité pour les bouteilles en verre pour remettre en suspension les OM à une concentration finale de 25 ug / ul. Assurez-vous que l'oligonucléotide est complètement dissous. Si quelques restes solides, chauffer le flacon contenant la solution stock oligonucléotide à 65 ° C pendant 5 à 10 min et le vortex brièvement.
  3. Rangez la solution stock de MO à température ambiante. Ne pas les stocker à 4 ° C ou -20 °; C car des températures plus basses peuvent provoquer l'oligonucléotide MO à se lier à la paroi du récipient. Mesurer la concentration de la solution d'achat d'actions à l'aide d'un spectrophotomètre (se il vous plaît se référer à Tableau 1) à chaque fois une nouvelle solution MO boursier est faite.
  4. Préparer la solution de travail MO sur le jour de l'injection par dilution de la solution mère avec de l'eau stérile de haute qualité pour la dose souhaitée. Ajouter 0,5% de phénol-rouge pour atteindre une concentration de 0,05%. Par exemple, pour rendre la solution de travail de 5 pi avec une concentration de 15 ng / nL, ajouter 3 pi MO solution stock et 0,5 ul de 0,5% de phénol-rouge pour 1,5 pi d'eau.
    NOTE: Avec cette concentration de travail, chaque goutte (500 pl) d'injection contient 7,5 ng de MO et de deux gouttes contient 15 ng de MO.

2. Préparation de l'appareil d'injection

  1. Achat verre aiguilles pré-tiré (se il vous plaît voir le tableau 1 pour des informations détaillées). Sinon, tirez l'injection de verre aiguille with un extracteur de l'aiguille.
  2. Allumez le compresseur d'air et d'ajuster le réglage à 50 psi pression. Allumez la source de lumière du microscope de dissection et Pico pompe micro-injection et d'ajuster les paramètres comme suit: maintenir la pression de 20 psi, éjectez la pression de 10 psi, la valeur de période de 2,5 et 100 microsecondes gamme de déclenchement.
  3. Chargez le verre aiguille pré-tiré avec 5 pi de la solution d'injection et placer l'aiguille dans une position verticale avec la pointe vers le bas. Attendez jusqu'à ce que toute la solution atteint la pointe de l'aiguille sans bulles d'air visibles. Placer le support d'aiguille dans une position appropriée à côté du microscope et insérer l'aiguille de verre dans le support. Ajustez l'angle d'injection à 45 degrés.
  4. Apportez la pointe de l'aiguille dans la vue sous le microscope, haute hors de la scène, et se concentrer sur la région la plus mince de la pointe. Casser la pointe de l'aiguille avec de fines pinces ponctuelles.
  5. Placez une règle et un tube capillaire avec diamètre intérieur de 0,15 mm côte à côte sous le microscope;injecter la solution dans une extrémité du tube capillaire à faire une colonne de liquide. Réglez le temps d'éjection pour atteindre toutes les 17 gouttes par colonne de liquide de longueur de 1 mm, le volume de chaque goutte est une nl (volume de la goutte = π x rayon de 2 x de longueur (de la colonne de liquide) / nombre (de gouttes).
    REMARQUE: Une goutte d'un diamètre de 0,1 mm donne un volume d'injection de l'ordre de 500 pl (volume de goutte = 4/3 π x rayon x 3).

3. Préparation de fécondés embryons de poissons zèbres et injection avec Morpholinos

  1. Mettre en place Tg (wt1b: GFP) couples reproducteurs de poisson zèbre transgénique selon des protocoles publiés pour l'élevage du poisson zèbre standard et l'entretien. Recueillir des embryons après spawn naturel, et de les garder dans une boîte de Pétri 10 cm rempli d'eau E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO 4). Lancer injection MO immédiatement 13. Surveiller embryon morphologie sous le microscope et faire l'injection MO sûr, ce est à la de unstade de la cellule, ou au plus tard au stade de quatre cellules.
    1. Transfert des embryons dans une boîte de Pétri de 10 cm avec de la gélose en forme de coin creux. Aspirer l'eau E3 supplémentaire et appuyez doucement sur les embryons dans les creux.
    2. Manipuler les embryons avec la micropipette pour visualiser embryons au stade 1 cellule sous le microscope de dissection. Pénétrer le chorion puis le jaune d'injecter une ou deux gouttes de MO dans le jaune (1 goutte = 500 pl). Transférer les embryons injectés à une boîte de Pétri de 10 cm avec de l'eau E3 et incuber à 28,5 ° C.
  2. Après les injections, retirer les embryons morts et d'enregistrer le nombre d'embryons injectés. Remplacer l'eau E3 dans le plat tous les 24 à 48 heures.

4. Les expériences phénotype sauvetage

  1. Sélectionnez un orthologue d'une autre espèce qui a une structure différente (habituellement 3-7 paires de bases de l'inadéquation) de paires de base primaire et est donc résistant à la MO, pour le sauvetage. Par exemple, dans cette expérience, nous avons choisisouris parce que la séquence d'ARNm de souris Wnt5a est différente de la séquence de poisson zèbre.
  2. Conception d'un jeu d'amorces avec l'amorce sens à partir de l'emplacement de translation et l'amorce inverse à proximité de l'extrémité de la région codante de l'ARNm. Ajouter une séquence de promoteur de T7 à l'extrémité 5 'de la séquence de l'amorce sens. Dans cette expérience, nous avons utilisé les séquences d'amorces suivantes; avant: 5'-taa tac GAC TCA GGA tag CTA CTA tga tgc tgc TGA TGA AGC a- 3 'et inverser: 5'TCA ctt gca GAC gta CTG gtc- 3'.
  3. Effectuer une réaction en chaîne par polymerase de 50 pi (PCR) avec le jeu d'amorces (0,5 uM de chaque amorce) conçu ci-dessus et 0,1 ug d'ADN matrice contenant la souris séquence Wnt5a ADNc avec le programme de PCR suivant: 1 cycle à 95 ° C pendant 5 min; 35 cycles de 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); et l'étape d'extension finale à 72 ° C pendant 7 min.
  4. A la fin de til vélo, de courir 2 pl du produit de PCR sur un gel d'agarose à 1% pour se assurer que la bande est la bonne taille. Purifier le produit de la PCR avec un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Vérifier la concentration de l'ADN avec un spectrophotomètre. Stocker le produit PCR purifié à -20 ° C ou utiliser directement dans plafonné transcription de l'ARN dans l'étape suivante.
  5. La synthèse in vitro d'ARNm coiffés avec un kit de synthèse d'ARN coiffée selon les instructions du fabricant. Diluer l'ARNm dans 20 ul d'eau libre de RNase et déterminer la concentration. Aliquoter l'ARN et conserver à -80 ° C.
  6. Le jour de l'injection, préparer une solution de travail de l'ARNm par la RNase de l'eau stérile libre. Notez que 40 pg dose est généralement de l'ARN de la plus élevée à laquelle des effets non spécifiques ou toxiques de l'ARN ne se produisent pas. Gardez la solution de travail sur la glace. Injecter l'embryon avec MO et l'ARNm de sauvetage, ou co-injecter les deux ensemble. Par exemple, si la concentration de l'ARNm de prépared à l'étape 4.5 est de 0,6 ug / ul, ajouter 0,67 ul d'ARNm (0,4 ug) à 4,33 pi de RNase eau libre pour obtenir une concentration finale de 0,08 ug / ul, puis une goutte (500 pl) de chaque injection contient 40 pg de l'ARNm. Préparer MO comme décrit à l'étape 3.

5. Préparation des embryons injectés pour l'imagerie de fluorescence

  1. Après incubation à 28,5 ° CO / N, ajouter 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) à l'eau pour empêcher la mélanisation E3, ce qui affecte l'observation de la structure de pronéphros en utilisant la microscopie de fluorescence. Cependant, ne ajoutez pas PTU avant gastrulation, car elle affecte le développement embryonnaire précoce.
  2. Au 48 HPF, dechorionate manuellement les embryons avec des pincettes fines. Prenez des photos de 48 et 72 embryons hpf sous un dissection microscope optique.
    NOTE: Ces photos peuvent être prises sans anesthésie.
  3. Environ 10 minutes avant l'imagerie au microscope à fluorescence, anesthésier les embryons en les plaçant dansune boîte de Pétri de 10 cm contenant 160 ug / ml tamponnée tricaïne. Attendre 5 à 10 min, puis appuyez légèrement sur le poisson zèbre pour confirmer qu'ils ne se déplacent pas et donc l'anesthésie travaille.
  4. Après les embryons sont anesthésiés, montez-les dans 3% de méthylcellulose et de les orienter dans une position couchée sous un microscope de dissection (se il vous plaît voir le tableau 1).
  5. Observer la structure de pronéphros sous un microscope à fluorescence (se il vous plaît se référer au tableau 1) et prendre des photos à différents grossissements (10x et 20x).

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Résultats

Wnt5a abattre a été réalisé par l'introduction traduction bloquant MO (AUG-MO) ou de l'exon / intron jonction des frontières MO (épissage MO) pour embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule. L'AUG-MO cible le codon d'initiation et, par conséquent, inhibe à la fois un message de Wnt5a maternelle et zygotique. L'épissure-MO vise le troisième site donneur d'épissage et inhibe seulement la transcription zygotique de Wnt5a (figure 1A). Le août- et morphants jonction ou phenocopied l'a...

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Discussion

Polykystose rénale (PKD) est l'une des principales causes de maladie rénale terminale chez l'homme et est caractérisée par la formation progressive d'un kyste, l'élargissement rénale, et le développement des tubules anormale 14. PKD autosomique dominante (ADPKD) est une maladie génétique dans laquelle une ou l'autre mutation de PKD1, codant pour la polycystine-1 (PC1) ou PKD2, codant pour la polycystine-2 (PC2), les résultats dans les reins polykystiques. Beaucoup d'autres gènes, en pa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le NIH (DK093625 à la LH et DK069909 et DK047757 à JHL) et VA (Merit Award I01BX000820 à JHL). Nous tenons à remercier le Dr Michael Pack et le Dr Jie Il à l'Université de Pennsylvanie poisson zèbre de base pour fournir un soutien essentiel.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 % Phénol-RougeSigmaP0290Indicateur de couleur pour l’injection
MorpholinoGenn Tools, LLC(personnalisé)Conçu sur mesure pour le gène d’intérêt
Aiguille pré-tiréeTritech ResearchMINJ-PPSi une grande quantité d’aiguille est nécessaire, vous pouvez également acheter un extracteur d’aiguille et préparer l’aiguille en laboratoire
T7 mMessage KitAmbion1344Pour la transcription in vitro afin de produire de l’ARNm coiffé pour l’expérience de sauvetage
N-PhenylthioureaSigmaP7629Pour la prévention de la mélanisation
TricaineSigmaA5040Aussi appelé éthyl 3-aminobenzoate, pour l’anesthésie du poisson zèbre
MéthylcelluloseSigmaM-0387Pour la position du poisson zèbre  ;
Kit de purification QIAquick PCR  ;Qiagen28104Pour la purification du produit PCR pour la synthèse de l’ARN de la coiffe.
dNTP mixPromegaU1511Pour PCR
Tag ADN PolyméraseInvitrogen10342-053Pour PCR
Spectrophotomètre NanoDropThermo ScientificND-1000Pour mesurer la concentration de morpholino et d’ARN
Compresseur d’airWerther International, Inc.Panther Compact 106Source d’air pour l’injection
Pico Pompe de micro-injectionWorld Precision Instruments IncPV830 Pnematic PicoPumpD’autres types de système de micro-injection peuvent être utilisés.
Micro-fabricantWorld Precision Instruments IncMMJRDroitier (MMJL pour gaucher)Porte-aiguille
World Precision Instruments Inc5430-ALLPour tenir l’aiguille pour la micromanipulation
Pince à épiler DumontOutils chirurgicaux fins11253-20Pour casser la pointe de l’aiguille
Microscope de dissectionLeica M205C  ;Pour l’observation et l’imagerie des embryons de poisson-zèbre
Microscope à fluorescenceZeiss Axio Obserer D1mPour l’imagerie du poisson-zèbre Pronéphros
Tube capillaire (D.E. 0,15 mm)VitroComCV1525Q-100Pour mesurer le volume de chaque goutte injectée

Références

  1. Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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