Nous décrivons une méthode de génération d’un modèle possible de poisson-zèbre de la maladie polykystique des reins. Nous avons utilisé des poissons Tg(wt1b :GFP) pour visualiser la structure rénale. L’inactivation de wnt5a s’est faite par injection de morpholino. La formation de kystes pronéphriques après l’inactivation de wnt5a a été observée chez ce poisson zèbre transgénique GFP.
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Article de méthode
Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de Wnt5a Causes kystes chez le poisson zèbre reins
Dans cet article
Résumé
Résumé
La polykystose rénale (PKD) est l’une des causes les plus fréquentes d’insuffisance rénale terminale, une maladie dévastatrice pour laquelle il n’existe aucun remède. Les mécanismes moléculaires conduisant à la formation de kystes dans la PKD restent quelque peu flous, mais on pense que de nombreux gènes sont impliqués. Wnt5a est une glycoprotéine non canonique qui régule un large éventail de processus de développement. Wnt5a agit par le biais de la voie de polarité cellulaire planaire (PCP) qui régule la division cellulaire orientée pendant l’élongation des cellules tubulaires rénales. Il a été constaté que des défauts de la voie PCP provoquent la formation de kystes rénaux. Notre article décrit une méthode de développement d’un modèle de maladie rénale kystique du poisson-zèbre par inactivation du gène wnt5a avec des oligonucléotides morpholino (MO) antisens wnt5a. Le poisson-zèbre transgénique Tg(wt1b :GFP) a été utilisé pour visualiser la structure rénale et les kystes rénaux après l’inactivation de wnt5a. Deux MO antisens distincts (AUG - et site d’épissage) ont été utilisés et les deux ont entraîné un phénotype de queue bouclée et la formation de kystes après l’inactivation de wnt5a. L’injection d’ARNm Wnt5a de souris, résistant aux MO en raison d’une différence dans la structure de la paire de bases primaires, a sauvé le phénotype anormal, démontrant que le phénotype n’était pas dû à des effets « hors cible » du morpholino. Ce travail soutient la validité de l’utilisation d’un modèle de poisson-zèbre pour étudier la fonction de wnt5a dans le rein.
Introduction
Poisson zèbre (Danio rerio) embryons ont été largement utilisé comme un modèle pour étudier le développement du rein et la polykystose rénale. Il existe de nombreux avantages à l'utilisation du poisson zèbre comme modèle animal: la faisabilité de l'étude des interactions génétiques, la capacité d'utiliser morpholinos antisens (MO) pour la protéine knockdown, la possibilité de doser rapidement un grand nombre d'embryons, et la facilité de visualisation des phénotypes d'organes en une larves vivantes. Les pronéphros est le premier rein à développer chez les vertébrés et est fonctionnel chez le poisson zèbre larves 2. L....
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Protocole
Déclaration de l'éthique: NOTE: Toutes les expériences de poisson zèbre ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Eastern Virginia Medical School.
1. Préparation Morpholino
- Conception et traduction synthétiser-blocage (août-) et épissage inhiber (jonction ou) anti-sens morpholino (MO) oligonucléotides pour le gène d'intérêt selon les instructions du fabricant (figure 1A). Se il vous plaît voir les informations du fabricant dans le tableau 1.
NOTE: OM sont expédiées comme les stocks lyophilisés dans des bouteilles en verre. - Ajouter de ....
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Résultats
Wnt5a abattre a été réalisé par l'introduction traduction bloquant MO (AUG-MO) ou de l'exon / intron jonction des frontières MO (épissage MO) pour embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule. L'AUG-MO cible le codon d'initiation et, par conséquent, inhibe à la fois un message de Wnt5a maternelle et zygotique. L'épissure-MO vise le troisième site donneur d'épissage et inhibe seulement la transcription zygotique de Wnt5a (figure 1A). Le août- et morphants jonction ou phenocopied l'a.......
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Discussion
Polykystose rénale (PKD) est l'une des principales causes de maladie rénale terminale chez l'homme et est caractérisée par la formation progressive d'un kyste, l'élargissement rénale, et le développement des tubules anormale 14. PKD autosomique dominante (ADPKD) est une maladie génétique dans laquelle une ou l'autre mutation de PKD1, codant pour la polycystine-1 (PC1) ou PKD2, codant pour la polycystine-2 (PC2), les résultats dans les reins polykystiques. Beaucoup d'autres gènes, en pa.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIH (DK093625 à la LH et DK069909 et DK047757 à JHL) et VA (Merit Award I01BX000820 à JHL). Nous tenons à remercier le Dr Michael Pack et le Dr Jie Il à l'Université de Pennsylvanie poisson zèbre de base pour fournir un soutien essentiel.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,5 % Phénol-Rouge | Sigma | P0290 | Indicateur de couleur pour l’injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC( | personnalisé) | Conçu sur mesure pour le gène d’intérêt |
| Aiguille pré-tirée | Tritech Research | MINJ-PP | Si une grande quantité d’aiguille est nécessaire, vous pouvez également acheter un extracteur d’aiguille et préparer l’aiguille en laboratoire |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | Pour la transcription in vitro afin de produire de l’ARNm coiffé pour l’expérience de sauvetage |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | Pour la prévention de la mélanisation |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Aussi appelé éthyl 3-aminobenzoate, pour l’anesthésie du poisson zèbre |
| Méthylcellulose | Sigma | M-0387 | Pour la position du poisson zèbre ; |
| Kit de purification QIAquick PCR ; | Qiagen | 28104 | Pour la purification du produit PCR pour la synthèse de l’ARN de la coiffe. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | Pour PCR |
| Tag ADN Polymérase | Invitrogen | 10342-053 | Pour PCR |
| Spectrophotomètre NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | Pour mesurer la concentration de morpholino et d’ARN |
| Compresseur d’air | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Source d’air pour l’injection |
| Pico Pompe de micro-injection | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | D’autres types de système de micro-injection peuvent être utilisés. |
| Micro-fabricant | World Precision Instruments Inc | MMJR | Droitier (MMJL pour gaucher)Porte-aiguille |
| World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | Pour tenir l’aiguille pour la micromanipulation | |
| Pince à épiler Dumont | Outils chirurgicaux fins | 11253-20 | Pour casser la pointe de l’aiguille |
| Microscope de dissection | Leica M205C ; | Pour l’observation et l’imagerie des embryons de poisson-zèbre | |
| Microscope à fluorescence | Zeiss Axio Obserer D1m | Pour l’imagerie du poisson-zèbre Pronéphros | |
| Tube capillaire (D.E. 0,15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | Pour mesurer le volume de chaque goutte injectée |
Références
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn
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