Article de méthode

Préparation et caractérisation d'un libre-Transgene humain souches pluripotentes induites lignée cellulaire et la conversion en des conditions définies de qualité clinique

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DOI :

10.3791/52158

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26 novembre 2014

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole pour la dérivation de cellules souches pluripotentes humaines induites par des facteurs lentiviraux, reprogrammées et caractérisées et leur conversion dans des conditions de qualité clinique présumées.

Résumé

Anthropiques cellules souches pluripotentes (de hiPSCs) peuvent être générés avec des méthodologies de reprogrammation base lentivirus. Toutefois, des traces de gènes potentiellement oncogènes restants dans les régions activement transcrits du génome, limitent leur potentiel pour une utilisation dans des applications thérapeutiques humaines 1. En outre, les antigènes non-humains issus de la reprogrammation de cellules souches ou la différenciation en dérivés thérapeutiques pertinentes empêchent ces hiPSCs d'être utilisé dans un contexte clinique humain 2. Dans cette vidéo, nous vous présentons une procédure pour reprogrammer et analyser hiPSCs gratuitement facteur-libres de transgènes exogènes. Ces hiPSCs peuvent ensuite être analysés pour des anomalies d'expression génique spécifique dans l'intron contenant le lentivirus. Cette analyse peut être effectuée en utilisant sensible réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR), qui a un avantage sur les techniques moins sensibles précédemment utilisé pour détecter l'expression du gène 3 différences. La conversion totale ende qualité clinique bonnes pratiques de fabrication (BPF) des conditions, permet pertinence clinique humaine. Notre protocole offre une autre méthode-à condition que les critères actuels exemptées seront étendre et inclure caractérisés dérivés de libre-facteur-base-hiPSC pour des applications à des fins thérapeutiques humains découlant hiPSCs de qualité GMP, ce qui devrait éliminer tout risque d'immunogénicité due à des antigènes non-humains. Ce protocole est largement applicable aux cellules reprogrammées lentiviraux de tout type et fournit une méthode reproductible pour convertir cellules reprogrammées dans des conditions de qualité GMP.

Introduction

Les cellules humaines adultes se sont révélées capables de subir un remodelage et une reprogrammation épigénétiques, à la suite de l’expression lentivirale de quatre facteurs de transcription clés4,5. Une avancée importante dans le domaine de la reprogrammation a été l’utilisation d’une seule cassette de cellules souches lentivirales excisables (STEMCCA), qui abritait les quatre facteurs de transcription de reprogrammation permettant un rapport stœchiométrique précis de l’expression de la protéine6. De plus, lorsqu’il est transduit dans une multiplicité spécifique de plages d’infection, STEMCCA peut conduire à des événements d’intégration génomique principalement uniques au cours du processus de reprogrammation7. L’introduction d’une version excisable de STEMCCA, qui utilise la technologie Cre/loxP suivie de l’excision du vecteur de reprogrammation après dérivation de la lignée de cellules souches, a permis de dériver des lignées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sans facteur8. De plus, afin d’améliorer les applications thérapeutiques des hiPSC, une méthodologie nouvelle, rapide et facilement applicable pour la conversion de lignées cellulaires de niveau conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), de conditions contenant des xénogrammes à des conditions exemptes de xénogrammes, devait être mise en œuvre. Ici, nous discutons d’une méthodologie pertinente qui évalue plus précisément les différences d’expression génique intégrées, en particulier lorsqu’elles sont intégrées dans un intron, et la conversion cellulaire de qualité clinique en conditions GMP présumées.

Des recherches antérieures n’ont utilisé que l’analyse transcriptionnelle de microréseaux relativement insensible pour analyser les différences d’expression génique dans les gènes intégrés après la transduction STEMCCA3,9. Ici, nous présentons la méthodologie de l’analyse quantitative sensible de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), afin d’examiner plus en détail les différences d’expression génique intégrées. Il est important de noter que les critères actuels de la sphère de sécurité éliminent les hiPSC qui ont des gènes avec des intégrations virales, limitant ainsi l’applicabilité de ces cellules pour les thérapies cellulaires humaines en aval9. Nous proposons que le statu quo puisse changer avec l’utilisation de hiPSC entièrement caractérisés et sans transgène, reprogrammés de manière intronique. De plus, nous introduisons un protocole robuste de conversion de cellules de qualité GMP qui peut être facilement appliqué à une variété de types de cellules différents, qui ont été dérivées à l’origine dans des conditions contenant du xénogène10. Cela offre d’importantes opportunités pour le développement de futures expériences de reprogrammation cellulaire, qui nécessitent des conditions de qualité clinique pour maintenir la pertinence thérapeutique humaine.

Ces méthodologies fournissent une base sur laquelle les critères actuels de la sphère de sécurité peuvent être étendus pour inclure des lignées de hiPSC reprogrammées STEMCCA caractérisées qui maintiennent un profil d’expression génique normal après l’excision de STEMCCA de l’inton intégré. De plus, la conversion complète dans des conditions de qualité clinique, exemptes d’antigènes animaux non humains, aidera à incorporer beaucoup plus de types de cellules, qui ont précédemment été reprogrammés et caractérisés uniquement dans des conditions contenant des xéno. Ces méthodologies, combinées, constituent un motif convaincant pour que la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis envisage d’étendre leur approbation limitée des traitements à base de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) aux traitements à base d’hiPSC11.

Nous avons récemment détaillé la dérivation d’une lignée de cellules hiPSC sans facteur qui a été entièrement caractérisée et convertie en conditions présumées de grade clinique10. Ici, nous détaillons le protocole de dérivation des hiPSC en utilisant le lentivirus STEMCCA. Ces cellules souches subissent ensuite un processus d’excision suivi d’une caractérisation de l’expression génique. Enfin, les hiPSC sont convertis dans des conditions de qualité GMP par une méthodologie de conversion lente.

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Protocole

NOTE: Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans la crainte et al 10..

1. Reprogrammation adulte humain fibroblastes dermiques avec STEMCCA

  1. Fibroblastes dermiques adulte Thaw humaines (HUF), passage 4 ou inférieures, dans un bain d'eau à 37 ° pendant 2 min, en prenant soin de ne pas submerger le haut du flacon avec de l'eau.
  2. Placez la pâte de 1 ml de fibroblastes humains dans une fiole conique de 15 ml et placer lentement 4 ml de milieu HUF standard, pré-chauffé à 37 ° C, dans un mode goutte à goutte, pour diluer sur le diméthylsulfoxyde (DMSO) et remettre en suspension les cellules.
  3. Centrifuger le flacon à 200 xg pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un volume adéquat de médias pour créer une suspension de 100 000 cellules / ml, puis ajouter 2 ml dans un puits d'une plaque à six puits, pré-revêtu pendant 20 minutes avec 0,2% de gélatine.
    REMARQUE: Une sœur bien avec un nombre égal de cellules par ligne et l'état doit être ensemencée for le comptage / de multiplicité d'infection (MOI) de calcul cellule.
  4. Rock the côté de la plaque à l'autre et d'avant en arrière pour répartir les cellules. Incuber pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
  5. Le jour de transduction, d'obtenir le nombre de cellules (s) de la sœur bien (s) environ 24 heures après l'étalement de HUF initiale.
  6. Dégeler 2 x 10 8 TU, ou équivalent, concentré lentiviral (STEMCCA) et diluer à 1 x 10 8 TU / ml en HUF médias.
  7. Transduction de cellules à un rapport 10-MOI en HUF médias supplémenté avec 8 pg / ml agent de transfection. Mélanger uniformément transduites puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
  8. Environ 24 heures après transduction lentivirale, basculer les médias HUF de cellules souches pluripotentes humaines (CFP) milieu standard.
  9. Le jour 2 à 6, changer de support quotidienne avec le milieu CFP humaine.
  10. Au jour 6, plaque deux 0,2% revêtues de gélatine plaques de 10 cm de1,5 à 1,75 x 10 6 MEF provenant de souris CF1 en HUF médias 12.
  11. Au jour 7, en faisant attention de ne pas centrifuger plus de 100 XG, l'utilisation la température ambiante de la trypsine pour décoller les jours 7 fibroblastes reprogrammés d'un puits de la plaque à six puits et le passage à un rapport 01:16, en étalant toutes les cellules de façon égale entre deux plaques de 10 cm, avec les médias CFP humain frais, qui ont été plaqué avec MEF la veille. Distribuer des agrégats de cellules dans un mouvement en spirale dans le sens horaire et le lieu dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur humidifié nuit.
  12. Environ 48 heures après l'ensemencement des cellules reprogrammées sur MEF et tous les jours par la suite, changer les médias CFP humains passés avec des milieux frais.
  13. Après 3 à 4 semaines, prélever des colonies individuelles avec typique ESC comme la morphologie avec une aiguille de calibre 21 et de sous-cloner les dans une plaque de 24 puits en plaçant environ 8 à 10 morceaux individuels de colonies spécifiques dans des puits individuels dans un 0,2% de gélatine-couché plaque de 24 puits de pré-amorçageed avec FAE provenant de souris CF1 en milieu CFP humaine.
    NOTE: Après l'expansion des colonies cueillies, les colonies doivent être caractérisée comme pluripotentes par la formation de corps embryoïdes et l'analyse de l'expression des marqueurs de pluripotence au niveau de la protéine.

2. vecteur d'intégration Analyse du site et STEMCCA Excision

  1. Analyser le site d'intégration STEMCCA par linéaire non restrictive amplification par PCR comme décrit 10.
  2. Après dosage pour assurer une intégration dans une zone souhaitée du génome, accise STEMCCA par aspiration hors l'ancien milieu ESC humaine. Ensuite, mélanger 45 pi de virus concentré adéno-Cre-PuroR avec 8 pg / ml agent de transfection dans 3 ml de médias CFP standards pendant 24 heures.
  3. Après la période d'incubation de 24 h, aspirer le surnageant virale mixte et laver les cellules deux fois avec les médias de la CFP humaines. Placez médias CFP humains frais le long avec 2 ug / ml de puromycine pour une période de cinq jours, en changeant les médias esprit quotidienneh médias et antibiotiques frais.
  4. Après 5 jours, les colonies restantes sous-clone avec une aiguille de calibre 21 sur 0,2% puits revêtues de gélatine, dans une plaque à 12 puits pré-enduits avec MEF dérivés de CF1mice et étendre comme indiqué ci-dessus.
    NOTE: Après une dilatation suffisante pour obtenir un stock congelé, conversion en conditions libre-alimentation est nécessaire. Attendez au moins 95% des colonies de cellules souches mort comme la plupart des cellules ne seront pas transduites avec succès et succomberont à l'antibiotique au cours de la période de 5 jours d'incubation. Bien adéno-Cre-PuroR intègre à un rendement de 0,001 à 1% dans les chromosomes de l'hôte de cellules infectées, reexposing un échantillon de colonies facteur libre à la puromycine pour assurer 100% de mort cellulaire confirmera pas d'intégration se est produite 13.
  5. Dégeler une fiole de pré-aliquoté matrice de membrane basale sur de la glace, sur une période d'environ 2 heures (les recommandations du fabricant) jusqu'à ce que la matrice est un liquide et diluer jusqu'à une concentration finale de 1:30 dans un milieu basal froid. Coau nombre désiré de puits dans une plaque à six puits avec 1 ml par puits. Laisser reposer à la température ambiante pendant 1 heure.
  6. Croix-Hatch (en utilisant une aiguille de calibre 18, ou un verre ou en plastique "pointe") au moins 20 à 30 colonies d'un puits préalablement revêtu d'MEF. Soyez prudent de réduire MEF édifiante et transférer de la plaque.
    1. Générer le dispositif hachures par un certain nombre d'approches différentes, provenant du chauffage plus compliqué, tirant, et la finition d'une pipette Pasteur en verre sur une flamme nue, à la simple utilisation d'une pointe de pipette en plastique stérile ou, comme dans notre cas, 21- et / ou de calibre 18 aiguilles.
  7. Aspirer la matrice de l'enduit bien après incubation.
  8. Retirer les morceaux de colonies par grattant délicatement la vieille plaque avec une pipette de 200 pi et placer soigneusement dans 3 ml de médias combinés frais 1 dans la plaque de matrice revêtu. Incuber pendant une nuit dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur humidifié. Changer les médias 48 heures après repiquage.
  9. Extraire l'ADN génomique de hiPSCs soumettre excisées et sans alimentation converties, à plus de 80% de confluence, en utilisant des kits d'extraction d'ADN commercial.
  10. Analyser pour l'excision correcte avec des amorces spécifiques pour les intégrations exogènes du lentivirus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-avant, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-inverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Reconstituer amorces lyophilisées avec de l'eau de qualité PCR à une solution stock de 10 uM.
  11. Exécuter une PCR avec le protocole en cinq étapes suivantes: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 min; 35 cycles de chacun de ce qui suit: dénaturation à 98 ° C pendant 20 s, annelage d'amorce à 62 ° C pendant 15 secondes, et extension à 72 ° C pendant 15 s; suivie d'une extension finale unique de cycle à 72 ° C pendant 3 min.
  12. Ajouter un gel d'agarose à 3% en pesant 1,5 g d'agarose et en le plaçant dans 50 ml de tampon 1 x Tris-acétate-EDTA. Micro-ondes jusqu'à agarose est dissoute et le lieu dans un gel d'ADN tache à la pRoper dilution, mélanger et distribuer volume correct dans la cassette de gel se solidifier pendant 1 heure à température ambiante.
  13. Charge 12 pi de produit de PCR a mélangé avec 3 ul de colorant de charge en un gel d'agarose à 3%. Exécutez le gel pendant 30 min à 80 V.
  14. Visualisez de la lumière ultraviolette pour l'absence d'une bande indiquant excision correcte.

3. La quantification des différences d'expression génétique à l'aide de PCR quantitative de pré et post-hiPSCs excisées

  1. Extraire l'ARN total de hiPSCs soumettre excisées et sans alimentation converties en utilisant les kits d'extraction d'ARN commerciales.
  2. Reverse-transcrire jusqu'à 1 ug d'ARN total en utilisant des kits commerciaux en conformité avec les instructions du fabricant. Utilisez-oligo ancrée (dT) 18 et amorces hexamères aléatoires.
    REMARQUE: Assurez-vous que le protocole PCR est adapté pour les transcriptions de gènes de plus de ou moins de 4 ko. Amorces spécifiques devront être prises pour i selon gène STEMCCA origine intégrénto.
  3. Reconstituer l'amorce lyophilisée avec de l'eau de qualité PCR à une solution stock de 20 uM.
  4. Utilisation de 5 ng par échantillon 20 ul de la réaction qui se compose de sonde UPL 10 uM, 2x LightCycler 480 Probes Master, et 20 uM des amorces directe et inverse.

4. La conversion en conditions de qualité GMP

  1. Le premier jour de la transition les hiPSCs soumettre excisées plus aux conditions de qualité GMP, faire un mélange des médias composé de CFP humaine combinée médias 1 (médias combinée 1) et grade clinique bonnes pratiques de fabrication (BPF) médias conforme (médias combinés 2 ) dans un rapport 80:20.
  2. Aspirer les anciens médias combinés 1 et 3 ml placer des nouveaux médias combinés 1 et 2, préchauffé, le ratio 80:20. Changer de support jour pendant 3 jours avec ce rapport spécifique. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
  3. Le jour 4, assurez les médias combinée 1 et 2 à un ratio 50:50. Aspirer l'ancien milieu et REPLACe avec les médias préchauffé, combinés avec les médias 1 et 2 à la proportion 50:50. Changer de support pour 3 jours avec ce rapport spécifique. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
  4. Au jour 7, faire les médias combinée 1 et 2 à un ratio 20:80. Aspirer l'ancien milieu et remplacer avec les médias préchauffées, combinés avec les médias 1 et 2 au rapport 20:80. Changer de support pour 3 jours avec ce rapport spécifique. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
  5. Au jour 10, rendre les médias combinés 1 et 2 à un 0: rapport 100. Aspirer l'ancien milieu et remplacer avec les médias pré-chauffé, avec les médias combinés 1 et 2 au 0: rapport 100. Changer les médias tous les jours à ce rapport spécifique. Les cellules sont maintenant dans un milieu exempt de xéno-complètement défini. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
    REMARQUE: Pendant ce processus de conversion, des passages de routine avec une aiguille de calibre 18 est nécessaire pour maintenir la taille des colonies et la densité correcte. Plan sur la passaging cellules toutes les 4 à 5 jours, sur la base de la taille des colonies, la confluence, et la différenciation.
  6. Revêtez un puits dans une plaque à six puits avec un substrat sans xéno-défini comme recommandé par le fabricant.
  7. Passage mécaniquement une confluence ainsi, déjà converti aux conditions de médias Xeno-libre, d'une plaque à six puits avec une aiguille de calibre 18. Surtout, placer les nouveaux médias (médias combinés 2) sur les cellules avec un inhibiteur de ROCK 1x pendant 1 heure, avant repiquage d'effectuer une pré-état les médias.
  8. Aspirer la solution de substrat synthétique au large de la nouvelle plaque que les cellules sont transférés. Retirez tous les médias contenant les amas de cellules souches de la vieille plaque et transférer à la nouvelle plaque.
  9. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pour deux jours avec un minimum de perturbation physique (idéalement plaques, une fois dans l'incubateur, ne sont pas directement touchés en aucune façon) pour permettre la fixation maximale.
    Note: Les cellules nécessiteront des changements quotidiens des médias. Passagin continueg tous les 4 jours seront importants. En utilisant une aiguille de calibre 21, passage que les parties de colonies avec la morphologie optimale ESC-like (rapport nucléocytoplasmique élevé). Cela permettra d'assurer la sélection pour les colonies de hiPSC appropriées qui poussent bien et finalement donneront colonies homogènes. Temps global à la dérivation de l'ESC comme colonies se situe entre 15 à 20 jours après le changement initial combiné de médias.
  10. Geler les bas hiPSCs post-excisé de qualité GMP d'abord quadrillé toutes les colonies en utilisant une aiguille de calibre 18. Lever toutes les pièces en utilisant un large ul pipette 200 et transférer tous les médias contenant les cellules à un 15 ml flacon et centrifuger conique à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
  11. Bien que les cellules sont centrifugation, faire un support de gel consistant en des volumes égaux de deux supports combinés à froid et un milieu de congélation avec une concentration finale en DMSO de 7,5%.
  12. Après que les cellules sont culottées, Aspirer ancien milieu et goutte à goutte re-suspendre le culot avec les médias de congélation. Immédiatement transfert dans des flacons de gel et mis dans un congélateur à -80 ° C.

5. hiPSCs Caractérisation GMP grade post-excisées

  1. Pour assurer une bonne expression de marqueurs de pluripotence post-conversion, utilisez QPCR de quantifier l'expression des marqueurs de pluripotence clés (SOX2, OCT4 et NANOG) en utilisant les amorces énumérées dans le tableau 1 avec les mêmes étapes que mentionné dans l'étape 3. méthodologies de QPCR suivre la mêmes étapes énumérées à l'étape 3.
  2. Utilisation cytométrie en flux pour détecter l'acide sialique non humain Neu5Gc (l'acide -glycolylneuraminic N) conformément aux conditions standards listés dans la trousse comme précédemment publiée 10.
  3. Lavez délicatement les plaques de culture cellulaire avec des cellules en utilisant 1x phosphate salin (PBS).
  4. Dissocier colonies en utilisant 1x réactif de dissociation pendant 5 min à température ambiante.
  5. Pendant le temps d'incubation de 5 minutes de l'étape 5.4, de préparer la solution de blocage (fourni danskit) en faisant un 0,5% d'agent de blocage dans du PBS glacé.
  6. Étiqueter l'ensemble des tubes pour cytométrie en flux analyse suivante: Unstained; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) DAPI; anticorps de contrôle 1: 200; L'anticorps primaire 1: 200; Anticorps secondaire 1: 200 d'âne anti-Poulet IgG (H + L); MEF échantillon; Cellules post-excisée échantillon sur la matrice; et les cellules sur substrat synthétique échantillon post-excisée.
  7. Secouant doucement agrégats de cellules de l'étape 5.4 en ajoutant 2 ml de solution de blocage et transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger à 80 g pendant 5 min à 4 ° C.
  8. Laver les cellules deux fois avec une solution de blocage et centrifuger comme indiqué dans l'étape 5.7.
  9. Remettre en suspension doucement environ 1 x 10 6 cellules dans 100 ul de solution de blocage avec le volume de dilution correspondant de chaque anticorps. Incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 1 heure.
  10. Répétez lavages trois fois à l'étape 5.8.
  11. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 400 pi de diluant Buffer (dans le kit) avec 1: 100 de DAPI pour les tubes 2, 6, 7, et 8 comme indiqué dans l'étape 5.6.
  12. cellules souches à travers une passoire 40 uM et traversent cytomètre de flux.

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Résultats

Nous présentons un protocole pour dériver hiPSCs gratuitement facteur-qualité clinique en utilisant l'approche de reprogrammation base-lentiviral STEMCCA. Figure 1A montre une image représentative de trois lignes hiPSC pré-excisée différents, après la reprogrammation à l'approche STEMCCA sur une couche de MEF. Le principal avantage de l'approche de reprogrammation STEMCCA réside dans le succès de reprogrammation cohérente atteint par plusieurs scientifiques, dans les différents groupes de recherche et l...

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Discussion

Nous décrivons une méthode consistant à dériver hiPSCs libre-facteur et de les rendre cliniquement significative par la conversion de ces cellules dans des conditions de qualité GMP de différenciation cellulaire en aval dans les futurs thérapeutique humaine. Bien que ce protocole est largement applicable à une variété de types de cellules, nous avons choisi de reprogrammer les fibroblastes dermiques humains, en raison de la facilité d'extraction du patient et de leur applicabilité à la thérapeutique humaine personna...

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Déclarations de divulgation

James A. Byrne (JAB) et Agustin Vega-Crespo reçoivent un financement de recherche de Fibrocell Science, Inc. JAB est consultant scientifique pour Fibrocell Science, Inc. Aucun autre auteur n’a d’intérêts concurrents à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Patrick C. Lee, Cyril Ramathal et Saravanan Karumbayaram (SK) pour leur aide dans la réalisation des expériences de dérivation et de caractérisation des iPSC ; Aaron Cooper pour avoir réalisé les expériences d’analyse iPSC ; Vittorio Sebastiano et Renee A. Reijo Pera pour avoir dirigé les efforts initiaux de reprogrammation ; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack et Donald B. Kohn pour avoir dirigé l’établissement des installations GMP de l’UCLA permettant la conversion et la caractérisation des iPSC de qualité clinique ; Gustavo Mostoslavsky pour nous avoir fourni le vecteur de reprogrammation polycistronique STEMCCA. Ce travail est basé sur une collaboration de recherche avec Fibrocell Science et l’initiative CIDMOD (Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives) pour générer des thérapies cellulaires personnalisées sûres. Ce travail a été soutenu par le financement du Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research de l’UCLA, de la Phelps Family Foundation, de Fibrocell Science, Inc. et de l’UCLA CTSI Scholar’s Award à JAB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieux et réactifs
DMEM/F12 (milieu basal)Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)11330057
Sérum fœtal bovinInvitrogen16000044
Milieu essentiel minimum (MEM) acides aminés non essentiels (NEAA), 100xInvitrogen11140050
Glutamax, 100xInvitrogen35050-061
PenStrep, pénicilline-streptomycine, 100xInvitrogen15140-122Décongélation à 4 ° ; C, aliquote et stocker à &minus ; 20 ° ; C
Knockout sérum de remplacementInvitrogen10828028décongélation à 4 ° ; C, aliquote et stocker à &minus ; 20 ° ; C
Trypsine/EDTA, 0,5 %Invitrogen15400-054Diluer le stock à 0,05 % dans 1x PBS
Facteur de croissance des fibroblastes de baseGlobalStem (Rockville, MD, États-Unis)GSR-2001Reconstituer à 10 & micro ; g/ml de stock dans 0,1 % d’albumine sérique bovine dissoute dans 1x PBS et stockée à &minus ; 80 ° ; C
&beta ;-mercaptoethanolMillipore (Billerica, MA, USA)ES-007-E
Matrigel (matrice de membrane basale)BD Biosciences (San Jose, CA, USA)356231Flacon de Matrigel dilué avec 10 ml de DMEM/F12 sur glace pour une dilution de 1:2. Aliquote et stocker à &minus ; 20 &°C.
CELLstart (Substrat Synthétique)InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (Cambridge, MA, USA)04-0012-02
PuromycinInvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probes MasterRoche (Bâle, Suisse)4707494001
ProFreeze-CDM Medium/medium de congélationLonza (Bâle, Suisse)12-769E
DiméthylsulfoxydeSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)D8418
PBSInvitrogen14190-250
100 BP Échelle d’ADNInvitrogen15628019
SYBR Teinture de gel d’ADN sûre 10 000xInvitrogenS33102
AgaroseBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, États-Unis)161-3101
Gélatine, à partir de peau de porcSigma-AldrichG1890-100GFaire le stock à 0,2 % dans PBS, autoclave et conserver à température ambiante.
mTeSR1StemCell Technologies (Vancouver, Colombie-Britannique, Canada)5850Combinez le supplément 5x avec le milieu de base, aliquote et stockez-le à 4 ° ; C jusqu’à 2 semaines.
Stemedia NutriStem XF/FF Culture MediumStemgent05-100-1ADécongeler à 4 ° ; C O/N, aliquote et stockage à 4 ° ; C jusqu’à 2 semaines.
PrimocinInvivoGen (San Diego, CA, USA)ant-pm-1
Accutase (réactif de dissociation)InvitrogenA1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)703-546-155
Polybrène/agent de transfectionMilliporeTR-1003-G
Plasticware
Plaques à 12 puitsVWR (West Chester, PA, USA)29442-038
Plaques à 6 puitsVWR29442-042
Plaques de 10 cmSigma-AldrichZ688819
Aiguille de calibre 18Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)148265D
Aiguille de calibre 21Fisher Scientific14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow CytometerKSystem by Nikon (Tokyo, Japon)
BD FACSDiva Version 6.1.3 SoftwareBD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR KitKAPA Biosystems (Wilmington, MA, États-Unis)KK2601
Kit d’isolement d’ARN hautement purRoche11828665001
Transcriptor First Strand Kit de synthèse d’ADNcRoche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic PackSialix (Newton, MA, USA)Basic Pack
Media
Combined media 1StemCell Technologies et Stemgentse compose à parts égales de milieux combinés mTeSR1 et Nutristem
2StemCell Technologies et StemgentSe compose à parts égales de TeSR2 et de Nutristem
HUF MediaDulbecco' Eagle modifié' s medium/F12 [DMEM/F12] complété par 10 % de sérum de bovin fœtal, 1x acides aminés non essentiels, 1x Glutamax et 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell MediaDMEM/F12 complété par 20 % de remplacement sérique knockout, 1x Glutamax, 1x acides aminés non essentiels, 1x Primocin, 1x &beta ;-mercaptoéthanol et 10 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes basiques.
DMEM/F12, Dulbecco' Eagle modifié' s moyen/F12 ; PBS, solution saline tamponnée au phosphate.

Références

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Cellules souches pluripotentes induites humainesReprogrammation lentiviralehiPSC sans facteursExtraction d ADN g nomiqueExcision par virus Adeno CreConversion en grade GMPConditions sans x nog niqueAnalyse par cytom trie en fluxExpression des marqueurs de pluripotencehiPSC de grade clinique

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