Article de méthode

Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de l'association PeakForce quantitative nanomécanique propriété

DOI :

10.3791/52164

⸱

24 octobre 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une méthode d’étude de la structure d’un photorécepteur protéique à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM) est décrite dans cet article. La cartographie quantitative des propriétés nanomécaniques PeakForce (PF-QNM) révèle des dimères de protéines intacts à la surface d’un mica.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie à force atomique (AFM) utilise une pointe pyramidale fixée à un porte à faux à sonder la réaction d'une surface de force. Les déviations de la pointe peut être mesurée à ~ 10 pN par un laser et d'un détecteur à secteurs, qui peut être converti à l'image de la topographie. Modulation d'amplitude ou "tapping mode" AFM implique la sonde en contact intermittent avec la surface en oscillant à sa fréquence de résonance pour produire une image. Utilisé en association avec une cellule de fluide, en mode taraudage AFM permet l'imagerie des macromolécules biologiques telles que les protéines dans des conditions physiologiquement pertinentes. Mode Tapping AFM nécessite un réglage manuel de la sonde et de fréquents ajustements d'une multitude de paramètres d'analyse qui peut être difficile pour les utilisateurs inexpérimentés. Pour obtenir des images de haute qualité, ces ajustements sont les plus coûteux en temps.

PeakForce quantitative nanomécanique Property Mapping (PF-QNM) produit une image en mesurant une respon forcecourbe soi pour chaque point de contact avec l'échantillon. Avec le logiciel de ScanAsyst, PF-QNM peut être automatisé. Ce logiciel permet de régler le point de consigne, la fréquence d'entraînement, vitesse de balayage, les gains, et d'autres paramètres de numérisation importants automatiquement pour un échantillon donné. Non seulement ce processus à protéger les deux sondes et les échantillons fragiles, il réduit considérablement le temps nécessaire pour obtenir des images à haute résolution. PF-QNM est compatible pour l'imagerie AFM dans le liquide; par conséquent, il a une large application pour l'imagerie de matériaux biologiquement pertinents.

La méthode présentée dans ce document décrit l'application de PF-QNM d'obtenir des images d'un photorécepteur de lumière rouge bactérienne, RpBphP3 (P3), de la photosynthèse R. palustris dans son état ​​adapté à la lumière. En utilisant cette méthode, les dimères de protéines individuelles de P3 et des agrégats de dimères ont été observées sur une surface de mica en présence d'un tampon d'image. Avec les ajustements appropriés à la surface et / ou de la concentration de la solution, cette méthodepeuvent généralement être appliquées à d'autres macromolécules d'intérêt biologique et de matériaux souples.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microscopie à force atomique (AFM) est devenu un outil très important pour l'étude des propriétés structurales et mécaniques des surfaces, couches minces, et des molécules simples depuis son invention en 1986 (Figure 1). 1-3 Utilisation d'une cellule de liquide, la méthode a devenir particulièrement utile dans les études des macromolécules biologiques et même de cellules vivantes dans un environnement physiologiquement pertinents. 4-10 Tapping mode AFM a traditionnellement été utilisé pour l'imagerie des tissus mous ou des molécules faiblement liées à la surface, car le contact en mode AFM est généralement inadaptés en raison de pour les dommages causés par les forces latérales exercées sur l'échantillon par la console. 11 Tapping mode AFM permet de réduire considérablement ces forces en ayant la pointe intermittence toucher la surface plutôt que d'être en contact permanent. Dans ce mode, le cantilever est amené à osciller à ou près de sa fréquence de résonance normale à la surface. De même pour communiquer avec mode AFM, la topographie est analyzed en traçant le mouvement de la piézo-z comme une fonction de xy (distance).

La dynamique en porte à faux peuvent être très instable à ou près de résonance; par conséquent, ils sont très difficiles à automatiser l'extérieur d'une situation dite de «stabilisation». Plus précisément, ces dynamiques dépendent à la fois les propriétés de l'échantillon et de l'environnement de la numérisation. Pour une molécule doux adsorbé à un (re) surface dure, une boucle de rétroaction bien réglé pour la molécule peut engendrer un retour oscillation de la surface. Fonctionnement en fluide complique encore la mise au point de la poutre. Changements dans les niveaux de température ou fluides exigent un réajustement constant de point de consigne, les gains, et d'autres paramètres d'imagerie. Ces ajustements ont tendance à prendre beaucoup de temps et très difficile pour les utilisateurs.

Property Mapping pic de travail quantitative nanomécanique (PF-QNM), comme le mode de percussion AFM, d'éviter les interactions latérales en contactant par intermittence l'échantillon (Figure 2). 12-15 </ Sup> Toutefois, PF-QNM fonctionne en mode et fréquences beaucoup plus basses que-tapping mode AFM non-résonance. Ceci élimine les problèmes de réglage de mode taraudage AFM, en particulier ceux exacerbé par la présence de fluide. Avec PF-QNM, les images sont recueillies en prenant une courbe de réponse de la force à chaque point de contact. Avec l'ajout de logiciels de ScanAsyst, 15 réglage des paramètres de numérisation peut être automatisée et une image à haute résolution obtenue dans une affaire de minutes, même par des utilisateurs inexpérimentés. Une fois que l'utilisateur se familiarise avec l'AFM, tout ou partie des paramètres automatiques peuvent être désactivées à tout moment qui permet à l'expérimentateur d'affiner la qualité de l'image manuellement. Depuis sa création, le PF-QNM a été appliquée à la carte bactériorhodopsine, une protéine de la membrane, et d'autres protéines natives au niveau submoléculaire. 16-18 Pour bactériorhodopsine, il existe une corrélation directe entre la flexibilité des protéines et X-ray structures cristallographiques. PF 12 -qnM a été utilisée pour étudier des cellules vivantes avec une résolution élevée. 19,20 liens importants outre, les données PF-QNM a élucidés entre la structure et la mécanique dans la membrane des érythrocytes qui sont critiques pour l'intégrité et la fonction des cellules. 21

Nous avons utilisé la microscopie à sonde à balayage (SPM) méthodes, 22 y compris AFM, 23 pour étudier la structure des photorécepteurs aux feux rouges appelé bactériophytochromes (BphPs). 24,25 Ils se composent d'un module de détection de lumière lié de façon covalente à un module de signalisation effecteur tel comme l'histidine kinase (HK) 26. Le module de détection de lumière comprend généralement un chromophore bilin qui subit une transformation structurelle lors de l'absorption d'un photon, avec une série de modifications structurelles qui atteignent le module de signalisation de l'effecteur et conduisant à une transformation globale de la protéine entière . 24,27-29 base de cette transformation, il ya deux lumière distincte absorbant stats de BphPs, un état absorbant la lumière rouge et rouge lointain, désignés comme Pr et Pfr. Pr est thermiquement stable, état ​​adapté à l'obscurité pour la plupart des BphPs. 28 La base moléculaire de Pr / Pfr photoconversion n'est pas entièrement comprise en raison de la connaissance structurelle limitée de ces protéines. A l'exception d'une structure de D. radiodurans, tous les 30 rayons X publiée structures cristallographiques de ces protéines sont dans l'état adapté à l'obscurité et manquent de domaine effecteur. Les BphPs intacts sont trop gros pour être étudié de manière efficace par résonance magnétique nucléaire (RMN) et sont notoirement difficiles à cristalliser dans leur forme intacte (en particulier dans l'Etat de lumière adapté) pour la cristallographie aux rayons X. BphPs ont récemment été conçu en tant que marqueurs de protéines fluorescentes infrarouge (IFP). 31 Caractérisation structurale de ces protéines peut favoriser l'aide à la conception IFP efficace. 32-36

Est l'objet de cet article de présenter une procédure pourde formation d'image à l'aide de l'AFM BphPs liquide-cellule par l'intermédiaire de PF-QNM. La méthode est démontrée par des études de l'état de lumière adaptée de la bactériophytochrome RpBphP3 (P3) de la bactérie photosynthétique R. palustris. La procédure de l'AFM approche présentée ici est simple et commode pour l'imagerie de protéines ainsi que d'autres macromolécules biologiques. Avec cette méthode, les détails de structure des molécules individuelles peuvent être collectées dans un court laps de temps, similaire à une session de cours de science de laboratoire de niveau supérieur. Grâce à la mesure de sections et de compléter d'autres analyses dimensionnelles, les données expérimentales peuvent être comparés à des modèles informatiques utiles. 37-42

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. informatique et Microscope mis en place

  1. Ouvrir la vanne de la bouteille de N 2 et d'ajuster les commandes pour assurer la table d'air est flottant et le niveau.
  2. Allumez l'ordinateur, le contrôleur et la fibre optique lumière dans cet ordre.
  3. Réglez le scanner en mode / LFM AFM et centrer la caméra sur la tête AFM.
  4. Ouvrez le logiciel. Sélectionnez la catégorie de l'expérience "Propriétés nanomécaniques", "Quantitative nanomécanique Mapping" dans le groupe expérimental, et "PeakForce QNM dans le liquide" en cours d'expérimentation. Cliquez sur l'expérience de charge et puis Configuration.
  5. Concentrer la caméra avec l'objectif de Z à voir la surface de la scène. Utilisation du grossier vers le haut / vers le bas piezos déplacer le stade d'environ 1 mm en dessous de la surface de l'ouverture de la tête AFM.

2 Préparation de Mica Surface

  1. Appuyez sur un autocollant sur la face d'un disque propre de support d'échantillon (de 15 mm de diamètre, 0,8 mm d'épaisseur). Poussez un mica V-4disque de qualité (25 x 25 x 26 mm) sur l'adhésif jusqu'à fermement attaché.
  2. Frotter un morceau de ruban adhésif transparent sur le mica s'assurant qu'elle est bien respectée sans bulles d'air. Tirez la bande de mica d'un côté à cliver de façon homogène. Répétez si nécessaire pour assurer le mica est plat.
  3. Saisir le disque de support, côté mica nettoyage, avec une paire de pinces circulaires (pinces de disques), et placer sur le scanner. Le mica doit être en dessous du niveau de l'ouverture de la tête AFM.

3. fluide Assemblée cellulaire et l'imagerie de Mica Surface

  1. Rincer la cellule de fluide, un joint torique, l'adaptateur de seringue, l'adaptateur de tuyau flexible et le tuyau d'éjection dans 100% d'éthanol. Rincer la cellule fluide dans l'eau DI. Laissez toutes les pièces sécher à l'air complètement.
  2. Poussez l'adaptateur de tuyau dans le port de la cellule fluide propre. Appuyez doucement sur le joint torique dans l'encoche centre de la cellule fluide en utilisant des pinces à tête plate.
  3. Appuyez sur le ressort légèrement sur le clip sonde de retenue et le détourner de la Groove pour la pointe.
  4. Saisissez la sonde sur la partie longue de la pointe avec des pincettes à tête plate. Placer la sonde dans la rainure avec la pointe tournée vers le centre de la cellule. Poussez le ressort dans et ajuster le clip de retenue sur la sonde pour le fixer (figure 1B).
  5. Vérifiez la pince sur l'AFM afin de s'assurer qu'elle est complètement rétracté (figure 1C).
  6. Placer le tube de fluide, le joint torique et la sonde vers le bas, au-dessus de l'échantillon de mica. Permettre à la cellule fluide pour se reposer sur les goujons de l'AFM. Abaisser la pince à stabiliser la cellule fluide sur la scène. Appuyez sur le bouton vers le bas sur le microscope jusqu'à ce qu'une inspection visuelle indique que le joint torique comprimé fermement entre le disque de support et la cellule de fluide.
  7. Tout en regardant le moniteur, concentrer le bouton de réglage grossier de visualiser la partie supérieure de la cellule fluide sur l'écran.
  8. Déplacez le microscope jusqu'à ce qu'il y est une image claire de la pointe à l'aide des X / Y boutons de réglage et l'objectif de Z. La pointe sera apporeille comme un triangle d'or métallique. Déplacer l'extrémité proche de la surface de l'échantillon à l'aide du levier piézoélectrique sur le microscope. Focus sur la réflexion de la pointe. Gardez une trace de la console réelle par rapport à sa réflexion. A ce stade, ils doivent être étroitement alignés, mais pas complètement chevauchement.
  9. Fixez l'adaptateur de la seringue pour une seringue de 1 ml stérile. Attacher une extrémité du tuyau d'éjection de l'adaptateur de seringue et placer l'autre extrémité du tuyau dans le réservoir de solution tampon. Déployez complètement le piston de la seringue.
  10. Fixer le tuyau à l'adaptateur de tuyau sur la cellule fluide. Appuyez doucement sur le piston jusqu'à ce que le fluide remplit entièrement la chambre centrale. Vérifiez la cellule pour assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air. Vérifiez qu'il n'y a pas de liquide débordant de la cellule fluide sur le microscope. Placer la seringue sur un support solide en relief.
  11. Utilisez l'alimentation de l'appareil photo et les boutons X / Y de traduction pour localiser le laser sur l'écran (un point rouge diffuse). Utilisation du laser mouvemboutons de commande ent, déplacer le laser sur la pointe.
  12. Ajuster finement les commandes de laser et de miroir, jusqu'à ce que le signal de somme affichée sur le microscope est maximisée (value = 4-6).
  13. Ajustez l'angle de la diode quadrant en utilisant les boutons sur le côté arrière gauche et en haut à gauche de la tête de balayage pour réduire les déviations verticales et horizontales affichées sur le microscope le plus près possible de zéro (± 0,1).
  14. Dans le logiciel, sélectionnez les options d'acquisition. Au minimum, sélectionnez hauteur (trace et retrace), l'erreur de la force maximale et la déformation. Les autres options dépendent utilisateur et peuvent être adaptés en fonction de l'information spécifique désirée par l'expérimentateur.
  15. Sélectionnez "ligne" pour RT Avion Fit dans chaque fenêtre d'acquisition. Sélectionnez «aucun» pour l'OT plan Fit dans les fenêtres de hauteur. Réglez la décalages X et Y et l'angle de balayage à zéro, si ce n'est déjà fait.
  16. Réglez la vitesse de balayage de 1 Hz, l'échantillon par ligne 256, le contrôle automatique de ScanAsystà l'individu, et l'auto Z limite de ScanAsyst désactivé. Modifier la limite de Z à 500 nm. Régler la taille de balayage à 1 pm.
  17. Cliquez engager. A ce stade, la pointe se rapproche de la surface. Bien que la pointe est proche, observer Z changement de tension piézo-électrique dans le coin inférieur gauche de l'écran. Si la pointe sort de la plage, retirer la pointe et re-approche. En cas d'échec, la pointe peut-être besoin d'être changé afin d'avoir une approche réussie. Une fois que la pointe est engagée, les lignes vont commencer à apparaître sur chacune des fenêtres d'acquisition qui composeront une image.
  18. Prendre des images de mica à 1 x 1 um et agrandir lentement afin de s'assurer que la surface du mica est propre et plane. Cliquez sur la capture continue d'enregistrer des images telles qu'elles apparaissent. Zoomer et se déplacer autour de la surface comme vous le souhaitez.

4. protéines dépôt et Préparation de l'échantillon pour l'imagerie

  1. Obtenir protéine purifiée échantillon 38 et garder sur la glace. Si elles sont stockées dans un congélateur, décongeler échantillon surde la glace pendant 5 min.
  2. Diluer la protéine de 0,0010 mg / solution tampon d'imagerie utilisant ml réfrigéré. Le tampon d'imagerie utilisée ici est 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM de NaCl et 15 mM de MgCl2.
  3. Remplir une chambre 4 (100 x 15 mm) de boîte de Pétri avec une solution tampon d'imagerie réfrigéré. Remplir chaque chambre avec au moins 5 ml de solution. Mélanger la solution de protéine diluée avec le bout attaché à micropipetteur doucement.
  4. Appliquer 200 ul de la solution de protéine diluée à la surface du mica déjà préparé. Après 30 secondes, ramasser la protéine de surface / mica avec les pinces circulaires (pinces de disque). Maintenez l'échantillon parallèle à la paillasse.
  5. Tout en maintenant l'échantillon, immédiatement immerger l'échantillon dans la solution tampon contenue dans le premier quadrant de la boîte de Pétri (étape 4.2), tout en veillant à ce que l'échantillon est parallèle à la cuvette de la boîte de Pétri. Après 1 sec, retirer l'échantillon.
  6. Continuer à maintenir l'échantillon parallèle au bassinde la boîte de Pétri, répétez l'étape 4.5 pour les trois autres quadrants.
  7. Placez le disque sur un chiffon à poussière sec pour absorber l'excès d'humidité et de transférer le disque sur la platine du microscope. Ne touchez pas la surface réelle avec le chiffon. Ne pas laisser l'échantillon à sécher.
  8. Répétez les étapes 3.6 à 3.16.

5. imagerie protéines sur Mica

  1. Cliquez sur les paramètres de contrôle boîte sur le côté gauche de l'écran. taille de printemps et le rayon de pointe devraient être fixés repose sur la pointe utilisée.
  2. Cliquez engager. De même pour le processus d'imagerie de mica (étape 3.17), observer la fenêtre z-piézo à l'approche de pointe.
  3. Autoriser le scanner à l'image de la même zone pendant au moins deux passes consécutives. Cliquez sur la capture continue à enregistrer chaque image recueillie.
  4. Déplacez le scanner à une nouvelle région et / ou changer la taille de l'image comme vous le souhaitez.
  5. Après que le logiciel automatisé a terminé le réglage de laparamètres de numérisation pour une taille d'image particulier, tournent le logiciel off.
  6. Ajuster manuellement la vitesse de balayage, limite z, le nombre de lignes, et de la tension afin de peaufiner la mise au point de l'image. Si l'image est trop loin de la mise au point, tourner logiciel de back sur pour retourner la position de départ. Pour augmenter la résolution d'une image lors d'un zoom sur une protéine, diminuer la vitesse de balayage et d'augmenter le nombre de lignes proportionnellement.
  7. Après l'expérience, nettoyer la cellule liquide avec 100% d'éthanol et rincer à DI H 2 O. Permettre à la cellule liquide pour sécher complètement.
  8. Ouvrez le logiciel de données pour traiter des images de données brutes. Tout d'abord, aplatir l'image en cliquant sur l'icône de l'aplatir. Sélectionnez zéro ème ordre et cliquez sur exécuter. En fonction de l'image, un plan de coupe peut être nécessaire pour obtenir une image appropriée à plat. Dans ce cas, sélectionnez l'ajustement avion icon et dessiner un plan d'une zone plate de l'image à l'aide du curseur. Cliquez sur exécuter. Répéter au besoin
  9. Select l'onglet de section à mesurer les dimensions de la protéine. Tracez une ligne avec le curseur déplacer sur la molécule ou de la zone à analyser. Répétez l'opération pour de multiples domaines et le logiciel va générer une superposition. Exporter l'image ou les données utilisées pour générer l'image dans un format compatible avec d'autres logiciels et dessin.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Images AFM représentatifs d'une protéine de photorécepteur, P3, dans l'état adapté à la lumière sont présentés sur les figures 3 et 4. Un substrat de mica fraîchement clivé (figure 3A) est une surface appropriée, plat pour l'adsorption des protéines. Collecte d'une image de mica propre en tant que témoin négatif est important pour plusieurs raisons. Tout d'abord, il assure la cellule liquide est propre et pas de matières résiduelles provenant d'expériences antérieures c...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'AFM est un procédé de microscopie à sonde de balayage tout à fait capable d'imager des protéines et d'autres macromolécules biologiques dans des conditions physiologiquement pertinentes. En comparaison à la cristallographie aux rayons X et RMN, une des limites de l'AFM est son incapacité à obtenir la même résolution, en particulier la résolution latérale. Lors de l'utilisation de l'AFM analyser une molécule sur une surface, l'impact de la surface et la sonde sur l'image de la molécule d...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents ou de conflits d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le programme NSF-IRM (CHE: 1229103) est reconnu pour financer l'achat de nouveaux appareils électroniques de contrôle, des logiciels, des cellules liquides, et d'autres équipements nécessaires à l'assemblage d'un double AFM / STM. Nous reconnaissons les équipements communs à l'Université de Chicago programme NSF-MRSEC (DMR-0820054) pour l'assistance avec l'AFM instrumentation, de la formation et de l'imagerie, et pour le temps de l'instrument mis à disposition par le Réseau Installations de recherche Matériaux (DMR-0820054). Nous remercions tout particulièrement le Dr Qiti Guo, le Dr Justin Jureller, et le professeur Ka Yee Lee pour accueillir nos étudiants avant que le financement de la proposition NSF-IRM qui a l'instrumentation nécessaire à notre campus. Nous reconnaissons le financement d'une subvention STEM titre III (ID: P031C110157) confiée à l'Université Northeastern Illinois qui a fourni des bourses de recherche d'été pour les étudiants et les professeurs ainsi que le soutien pour les consommables. Enfin, nous reconnaissons Bruker-Nano, Inc. pour le soutien instrumental continue et la permission de reproduce un graphique montrant le mécanisme de PeakForce QNM et d'utiliser le mot ScanAsyst pour décrire le logiciel automatisé.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tris-HClFisher ScientificO4997-100
NaClAcros Organics7647-14-5
MgCl2Acros Organics7791-18-6
Multimode 8 AFMBruker-Nano492-008-011équipé d’un contrôleur Nanoscope V et d’un scanner J
SondeBruker-NanoSNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Mode de tapotement Cellule fluideBruker-NanoMTFML
Mica V-4 GradeSPI fournit115050325 x 25 x .26 mm
Disque de support d’échantillonnanoSurfBT02236
boîte de PétriPlasta-Medic, Inc.100 mm x 15 mm  ;
micropipettesDenville ScientificXL 3000i
RpBphP3Préparé selon les références citées
Logiciel de nanoscopeBruker-Nano
Fiber Optic LightDigital Instruments Inc.F0-50
Pelco AFM DisquePince Ted Pella Inc1668Seringue 12 mm
1 mlMcKesson102-ST1C
Tubes EppendorfDenville ScientificC2171
Le système graphique moléculaire Pymol v.1.5.0.1Schrödinger, LLC

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
  2. Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
  3. Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
  4. Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
  5. Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
  6. Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
  7. Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
  8. Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
  9. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
  10. Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
  11. Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
  12. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
  13. Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
  14. Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
  15. Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
  16. Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  17. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
  18. Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
  19. Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
  20. Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
  21. Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
  22. Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
  23. Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
  24. Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
  25. Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
  26. Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
  27. Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
  28. Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
  29. Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
  30. Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
  31. Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
  32. Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
  33. Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
  34. Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
  35. Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
  36. Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
  37. The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
  38. Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
  39. Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
  40. Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928(2011).
  41. Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
  42. Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Atomic Force MicroscopyPeakForce QNMPhotoreceptor ProteinsRed Light PhotoreceptorsFluid Cell ImagingPeak Force Quantitative Nanomechanical Property MappingMica Surface PreparationProtein Sample ApplicationAutomated Scanning ParametersBiological Macromolecule Imaging

Articles connexes