Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour In Vitro Les dosages de la myélinisation

Résumé

Nous présentons ici des protocoles qui offrent une base flexible et stratégique pour manipuler viralement les cellules précurseurs d’oligodendrocytes afin de surexprimer des protéines d’intérêt afin d’interroger spécifiquement leur rôle dans les oligodendrocytes via le modèle in vitro de myélinisation du système nerveux central.

Résumé

La myélinisation est un processus complexe qui implique à la fois les neurones et la myéline formant des cellules gliales, les oligodendrocytes dans le système nerveux central (SNC) et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (SNP). Nous utilisons un test in vitro de la myélinisation, un modèle établi pour étudier myélinisation du SNC in vitro. Pour ce faire, les cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) sont ajoutés aux primaires rongeurs ganglion de racine dorsale (DRG) neurones purifiés pour former des co-cultures myélinisantes. Pour interroger spécifiquement les rôles que les protéines exprimées par les oligodendrocytes particuliers exercent sur la myélinisation nous avons développé des protocoles qui transduction sélective OPC à l'aide du lentivirus surexprimant type sauvage, les protéines négatives dominantes ou constitutivement active avant d'être ensemencées sur les neurones DRG. Cela nous permet d'interroger spécifiquement les rôles de ces protéines dans la régulation oligodendrogliales myélinisation. Les protocoles peuvent également être appliqués dans l'étude des OTses types cellulaires, offrant ainsi une approche qui permet la manipulation sélective des protéines exprimées par un type cellulaire souhaité, tels que les oligodendrocytes ciblée pour l'étude de la signalisation et des mécanismes de compensation. En conclusion, combinant le dosage de la myélinisation in vitro avec lentiviraux infectés OPC fournit un outil stratégique pour l'analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans la myélinisation.

Introduction

La myélinisation des axones est crucial pour la transmission rapide et efficace des potentiels d'action dans les deux les systèmes nerveux central et périphérique. Des cellules spécialisées, les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique et les oligodendrocytes dans le système nerveux central, se enroulent autour des axones et ensheathe dans la myéline, efficace isolantes du nerf et de faciliter la conduction saltatoire ^1. Le procédé de la myélinisation peut être étudiée in vitro en utilisant des neurones ganglionnaires de la rétine, ² nanofibres par génie ^3, ou neurones ganglionnaires de la racine dorsale co-cultivées avec des cellules de Schwann ou des oligodendrocytes ^{4 7.5.} Le dosage in vitro de la myélinisation est un modèle établi pour l'étude du système nerveux myélinisation et il reproduit la plupart des processus fondamentaux qui se produisent pendant la myélinisation in vivo ^5-8. Le test implique la co-culture des populations purifiées de ganglions de racine dorsale (DRG) neurones, avec OPC (CNS myélinisation) ou des cellules de Schwann (PNS pour la myélinisation). Dans des conditions spécifiques de ces cellules myélinisantes ensheathe axones DRG dans l'ordre, structurellement vérifié, feuille multi-lamellaire ultra de la membrane plasmique qui expriment la même complément de protéines spécifiques de la myéline présents in vivo isolant.

Le modèle de cellule la plus couramment utilisée de l'étude de myélinisation du SNC in vitro est le co-cultures de neurones DRG et OPC, qui ont été utilisés avec succès pour étudier l'effet que des facteurs exogènes tels que les neurotrophines exercent sur ​​myélinisation du SNC in vitro ^5,6. Les facteurs exogènes tels que les facteurs de croissance ou de petites molécules inhibiteurs pharmacologiques ont été largement utilisés pour étudier le rôle des voies de signalisation dans la myélinisation utilisant le DRG-OPC modèle de co-culture ^7,9. Cependant, dans les paramètres de co-culture mixte contenant à la fois des neurones et des oligodendrocytes, il est resté formellement possible que soit les facteurs de croissance ou du pharinhibiteurs macologique auraient exercé des effets à la fois les neurones et les oligodendrocytes (OL) DRG. Cela offre la possibilité de disséquer spécifiquement les rôles que les protéines exprimées uniquement par DRG ou oligodendroglie exerce sur la myélinisation utilisant ce système cellulaire double. Pour confirmer sans équivoque que la voie de signalisation dans oligodendrogliale régule directement la myélinisation, transduction lentiviral des OPC, avant le semis sur les neurones de DRG pour le dosage in vitro de la myélinisation, se est avéré être une manière élégante de surexpression de type sauvage et les protéines mutantes, ainsi comme knockdown expression des protéines exprimées de manière constitutive par les oligodendrocytes. Ainsi, cette approche offre une avenue pour interroger et manipuler spécifiquement les voies de signalisation au sein oligodendrocytes pour étudier la myélinisation ^9,10.

Dans cet article, nous présentons les méthodes que nous avons développées pour surexprimer une protéine d'intérêt dans les oligodendrocytes sélective via un lentivirusapproche pour étudier la myélinisation in vitro. La technique commence avec la génération de vecteurs d'expression contenant le gène d'intérêt, que ce soit dans un type sauvage, forme négative constitutivement active ou dominant qui sont ensuite ensuite clone dans le vecteur pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Ce vecteur (contenant le gène d'intérêt), le donneur CMV promoteur (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) et le lentivecteur de 2K7 sont combinés dans une réaction enzymatique pour produire un vecteur de 2K7 contenant le promoteur CMV, le gène d'intérêt, un site interne d'entrée des ribosomes et la GFP (Figure 1). Cette passerelle clone construction d'2K7 combiné avec l'enveloppe du virus PMD2.G et le paquet de virus pBR8.91 peut être co-transfecté dans des cellules HEK293T pour générer lentivirus qui peut ensuite être utilisé pour transduire des OPC. Une fois infectés par le lentivirus les OPC expriment un niveau élevé de la protéine d'intérêt. Ces OPC peuvent ensuite être ensemencées sur les cultures de neurones DRG et l'effet que l'expressionles niveaux des élevés de la protéine désirée exerce sur la myélinisation peut être interrogé. Les co-cultures sont évaluées pour l'expression de la protéine de myéline par analyse Western blot et visualisés pour la formation de segments axonales myélinisées par immunocytochimie.

Protocole

REMARQUE: Tous les animaux utilisés pour cette étude étaient de sexe mixte et a grandi aux installations vétérinaires du Département d'anatomie et de pathologie et Le Florey Institute of Neuroscience et de la recherche en santé mentale à l'Université de Melbourne. Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par les comités d'éthique expérimentation animale à l'Université de Melbourne.

1. Clonage de 2K7 Lentivector

1. Avant de cloner le gène d'intérêt dans le vecteur lentiviral 2K7, sous-cloner le gène dans le vecteur pENTR (3637 pb, résistant à la kanamycine) en utilisant des techniques moléculaires classiques ^11. Utiliser les sites de restriction EcoRI et SacII pour le sous-clonage.
2. Amplification de l'2K7 Lentivector
   1. Transformer l'ADN lentivector 2K7 mélangeant doucement par 100 ng d'ADN plasmidique avec des cellules compétentes et on incube sur de la glace pendant 30 min.
   2. ADN choc thermique / cellules compétentes mélanger à 42 ° C pendant 90 secondes et la plaque sur des assiettes LB-agar contenant à la fois ampicillin (100 ug / ml) et du chloramphenicol (15 ug / ml) à 37 ° C pendant 16-18 h.
      REMARQUE: Chloramphenicol est utilisé pour empêcher une recombinaison entre les longues répétitions terminales.
   3. Le lendemain, grandir choisi clones bactériens dans un milieu LB contenant de l'ampicilline (100 ug / ml) et du chloramphenicol (15 ug / ml) à 37 ° C pendant 16-18 h. Extraire l'ADN en utilisant un plasmide commerciale kit ADN Maxiprep selon les instructions du fabricant.
3. Sous-clonage de pENTR vecteur 2K7 Lentivector (Figure 1)
   
   Figure 1:. Représentation schématique du processus de recombinaison passerelle Le gène d'intérêt, ici représentée comme Flag-Erk1, est cloné dans le vecteur pENTR L1-L2. Ceci est ajouté au vecteur pENTR L4-R1 contenant le promoteur CMV et le vecteur squelette 2K7. Ces trois vecteurs sont recombinés par l'enzyme LR Clonase II Plus pourinsérer le gène d'intérêt et le promoteur dans le vecteur du virus 2K7 prêt.
   1. Ajoutez ce qui suit à un tube de 1,5 ml et mélanger doucement:
      L4-R1-pENTR pDNOR-CMV (promoteur) (60 bng) 1 à 2,5 pl
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP (avec le gène d'intérêt) (80 bng) 1 à 2,5 pl
      K7 lentivecteur (80 ng / ul) 1 pl
      TE-tampon, pH 82-5 ul
      Total 8 pi
   2. Retirer mélange d'enzymes clonase de -80 ° C et décongélation sur de la glace pendant 2 min. Assurez-vous que cette enzyme est une autre partie aliquote de -80 ° C, l'enzyme a considérablement réduit l'efficacité de clonage avec des cycles répétés de congélation-décongélation
   3. Ajouter 2 ul d'enzyme par réaction et bien mélanger par vortex et incuber le mélange réactionnel clonase au 23-25 ​​° C pendant 6 à 24 h.
   4. Ajouter 1 pi de solution de proteinase K (fourni avec le kit d'enzyme) au mélange réactionnel clonase et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
   5. Transformer mélange réactionnel clonase dans des cellules compétentes et faire croître l'sélectionnezcolonies dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (100 ug / ml) à 37 ° C pendant 16-18 h.
   6. Extraire et purifier l'ADN en utilisant un plasmide commercial kit ADN Miniprep selon les instructions du fabricant.
   7. Confirmez l'ADN par digestion en utilisant les enzymes de restriction Spe I et Sac II et un tampon approprié selon les instructions du fabricant pour éliminer le fragment contenant le promoteur et le gène d'intérêt.
      NOTE: Cette étape est essentielle pour vérifier si l'ADN sous-cloné le gène a correcte de l'insert d'intérêt avec le squelette du vecteur droite. La taille du vecteur lui-même sans fragment inséré est 6,7 kb. La taille du fragment inséré libéré comprend à la fois le promoteur et le gène d'insert d'intérêt. Calculer les tailles de fragments attendus de l'empreinte pour le gène spécifique via un programme d'édition de séquence d'ADN, par exemple, les APE - un plasmide Editor.
   8. Vérifiez la taille des deux squelette du vecteur d'ADN et le fragment libéré en exécutant un gel d'''
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Résultats

Le drapeau marqués kinase 1 (Flag-Erk1) liés signal construction utilisé pour la production lentivirus est vérifiée par l'enzyme de restriction digérer des constructions utilisées, y compris les constructions d'2K7 et les emballages et accessoires constructions nécessaires à la production de virus extracellulaire (figure 3) .

Figure 3: vérification de la c...

Discussion

La myélinisation des axones est un processus crucial pour le fonctionnement optimal des deux systèmes nerveux central et périphérique de vertébrés. La génération et la maintenance des axones myélinisés est un processus complexe et coordonnée impliquant des interactions moléculaires entre neuronale, gliale (à partir de cellules de Schwann ou oligodendrocytes) et protéines de la matrice extra-cellulaire. L'importance et l'applicabilité de ce protocole est qu'il permet la manipulation des protéines dans un type...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2K7 lentivecteur  ;			Aimable cadeau du Dr Suter9
5-Fluoro-2&prime ;-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100mg
Alexa Fluor 488 Chèvre anti-souris IgG	Jackson Immunoresearch	115545205
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H+L)	Life Technologies	A11008
Alexa Fluor 594 chèvre anti-souris IgG (H+L)	Life Technologies	A11005
Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin IgG (H+L)	Life Technologies	A11012
Ampicilline	Sigma-Aldrich	A9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement	Stem Cell Technologies  ;	5711
BDNF (Humain)	Peprotech	PT450021000
Biotine (d-Biotine)	Sigma Aldrich	B4639
Bradford Réactif	Sigma Aldrich	B6916-500ML  ;   ;
BSA	Sigma Aldrich	A4161
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	C0378-100G
CNTF	Peprotech	450-13020
DAKO Média de montage en fluorescence	DAKO	S302380-2
DMEM, haute teneur en glucose, pyruvate, sans glutamine	Life Technologies	10313039
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-375KU
DPBS	Life Technologies	14190250
DPBS, calcium, magnésium	Life Technologies	14040182
EBSS	Life Technologies	14155063
EcoRI-HF	NEB	R3101
Vecteurs d’entrée pour promoteur et gène d’intérêt			Générer selon les protocoles 1-2
Sérum fœtal bovin	Sigma-Aldrich	12003C
Forskoline  ;	Sigma Aldrich	F6886-50MG
Glucose (D-glucose)	Sigma-Aldrich	G7528
Glycerol	Chem Supply	GL010-500M	Voir les solutions mères
Chèvre Anti-Souris IgG Jackson	ImmunoResearch	115005003
Chèvre Anti-Souris IgM  ;	Jackson ImmunoResearch	115005020
IgG anti-rat de	chèvre Jackson ImmunoResearch	112005167
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Igepal	Sigma Aldrich	I3021-100ML  ;
Insuline  ;	Sigma Aldrich	I6634° ;
Kanamycine	Sigma-Aldrich	60615
Laminine  ;	Life Technologies	23017015
LB Medium			Voir les solutions mères
LB-Agar			Voir les solutions mères
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-7477
Leibovitz’s L-15 Medium	Life Technologies	11415064
L-Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
L-Glutamine- 200 mM (100x) liquide	Life Technologies	25030081
LR Clonase II Plus enzyme	Life Technologies	12538-120
MEM, NEAA, sans Glutamine	Life Technologies	10370088
; &beta ; III Tubuline  ;	Promega	G7121
Souris & alpha ; MBP (monoclonal)	Millipore	MAB381
Na pyruvate  ;	Life Technologies	11360-070
NAC	Sigma Aldrich	A8199
NcoI-HF	NEB	R3193S
NEBuffer 4	NEB	B7004S
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
NGF (souris)	Alomone Labs	N-100
NT-3	Peprotech	450-03
Anticorps O1 - Souris anti-O1	Millipore	MAB344	Alternative si les cellules d’hybridome O1 ne sont pas disponibles
Cellules			d’hybridome O1 Milieu conditionné contenant un anticorps anti-O1 à utiliser pour l’immunopanning
Anticorps O4 - Souris anti-O4	Millipore	MAB345	Alternative si les cellules d’hybridome O4 ne sont pas disponibles
Cellules		d’hybridome O4	Milieu conditionné contenant un anticorps anti-O4 à utiliser pour l’immunopannage
Cellules compétentes	Life Technologies	A10460
One Shot Stbl cellules compétentes	Life Technologies	C7373-03
Suspension de papaïne	Worthington/Cooper	LS003126
pBR8.91			Cadeau aimable du Dr Denham10
PDGF-AA (Humain)	Peprotech	PT10013A500  ;   ;
Pénicilline-streptomycine 100x solution	Life Technologies	15140122
pENTRY4IRES2GFP	Invitrogen	11818-010  ;
pMD2.G	Addgene	12259
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5MG
Polyéthylénimine (PEI)  ;	Sigma-Aldrich	408727-100ML
Poly-L-ornithine  ;	Sigma Aldrich  ;	P3655
Progestérone  ;	Sigma Aldrich	P8783
Inhibiteur de protéase comprimé (Mini complet)	Roche	11836153001
Proteinase K			Fourni avec l’enzyme Clonase
Putrescine	Sigma Aldrich	P-5780
Lapin &alpha ; neurofilament	Millipore	AB1987  ;   ;
Lapin & alpha ; MBP (polyclonal)	Millipore	AB980
Cellules d’hybridome Ran2	ATCC	TIB-119	Milieu conditionné contenant l’anticorps anti-Ran2 à utiliser pour l’immunopanning
Anticorps anti CD140A/PDGFRa chez le rat	BD Pharmingen	558774
SacII	NEB	R0157
Milieu			Fourni avec des bactéries compétentes
Sélénite de sodium  ;	Sigma Aldrich	S5261
Spe I	NEB	R0133S
T4 ADN Ligase	NEB	M0202S
T4 DNA Ligase Buffer	NEB	B0202S
TE buffer pH8			Voir solutions mères
TNE Tampon
Oligo-éléments B	Cellgro  ;	99-175-CI
Transferrin (apo-Transferrin humain)	Sigma-Aldrich	T1147
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284  ;
Trypsine	Sigma-Aldrich	T9201-1G
Inhibiteur de la trypsine à partir du blanc d’œuf de poule	Roche	10109878001
Trypsine-EDTA (1x), rouge de phénol (0,05 %)	Life Technologies	25300-054
Lectine non conjuguée de Griffonia Simplicifolia BSL-1	Vector laboratories  ;	L-1100
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G

Souris &alpha SOC de lyse