Method Article

Modélisation des muqueuses candidose larves de poisson zèbre par injection vessie natatoire

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les interactions spatio-temporelles in vivo des défenses pathogènes et immunitaires au niveau de la muqueuse ne sont pas facilement imagées chez les hôtes vertébrés existants. La méthode présentée ici décrit une plate-forme polyvalente pour étudier la candidose muqueuse chez les vertébrés vivants en utilisant la vessie natatoire du poisson-zèbre juvénile comme site d’infection.

Abstract

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La défense précoce contre les agents pathogènes des muqueuses consiste à la fois une barrière épithéliale et les cellules immunitaires innées. Le immunocompétence des deux, et de leur intercommunication, sont primordiaux pour la protection contre les infections. Les interactions de cellules immunitaires innées et épithéliales avec un agent pathogène sont les mieux étudiés in vivo, où le comportement complexe se déroule dans le temps et l'espace. Cependant, les modèles existants ne permettent pas facile imagerie spatio-temporelle de la bataille avec des agents pathogènes au niveau de la muqueuse.

Le modèle développé ici crée une infection de la muqueuse par injection directe de l'agent pathogène fongique, Candida albicans, dans la vessie natatoire du poisson zèbre juvénile. L'infection résultant permet imagerie à haute résolution du comportement des cellules épithéliales et immunitaire innée à travers le développement de la maladie des muqueuses. La polyvalence de cette méthode permet pour interrogatoire de l'hôte à sonder la séquence détaillée des événements immunitaire conduisant à phagocyte recrutement et d'examiner les rôles de types cellulaires particuliers et voies moléculaires dans la protection. De plus, le comportement de l'agent pathogène en fonction de l'attaque immunitaire peut imager simultanément en utilisant la protéine fluorescente exprimant C. albicans. Résolution spatiale accrue de l'interaction hôte-pathogène est également possible en utilisant la technique de dissection vessie natatoire rapide décrite.

Le modèle d'infection de la muqueuse décrite ici est simple et hautement reproductible, ce qui en fait un outil précieux pour l'étude de la candidose buccale. Ce système peut également être largement traduisible à d'autres pathogènes des muqueuses comme les microbes mycobactériennes, bactériennes ou virales qui infectent normalement à travers des surfaces épithéliales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les infections des muqueuses peuvent entraîner des infections du sang potentiellement mortelles en raison des dommages à la barrière épithéliale, qui permettent aux agents pathogènes d’accéder à l’environnement systémique1,2. De plus, les infections des muqueuses peuvent également provoquer une immunopathologie importante, même lorsqu’elles sont contenues à l’extérieur3-5. Le champignon unicellulaire commensal, Candida albicans, est présent dans la majorité de la population dans la cavité buccale et d’autres sites muqueux6-9. Bien qu’elles soient normalement limitées par des réponses immunitaires innées et adaptatives, les anomalies immunitaires innées et les interventions médicales peuvent entraîner une candidose muqueuse grave. L’attaque de la barrière épithéliale entraîne un risque accru de maladie disséminée potentiellement mortelle ainsi qu’une immunopathologie, comme dans le cas de la candidose vulvo-vaginale, la colonisation de C. albicans a également été associée à l’homéostasie immunitaire pulmonaire10,11. La candidose disséminée est aujourd’hui la quatrième infection sanguine la plus fréquente dans les unités de soins intensifs12 et une mortalité atteignant 40 % en fait une préoccupation majeure. En raison de l’augmentation des traitements immunomodulateurs pour les patients atteints de maladies auto-immunes, de cancers ou de greffes d’organes, il est impératif de comprendre l’interaction entre cet agent pathogène et le compartiment immunitaire de la muqueuse.

La majorité des avancées en biologie cellulaire concernant les interactions C. albicans-cellules au niveau de la muqueuse proviennent de modèles in vitro13-15 et murins16-18. Ces deux approches présentent des avantages distincts, mais la capacité d’imager des cellules vivantes à haute résolution dans un hôte intact a limité la caractérisation temporelle et spatiale de l’infection. Pour ces études, il est nécessaire de disposer d’un modèle in vivo où l’interaction des cellules pathogènes, immunitaires innées et épithéliales peut être visualisée chez un hôte vertébré intact.

Le poisson-zèbre est devenu un outil inestimable pour la compréhension des maladies humaines, principalement en raison de sa transparence et de sa facilité avec la manipulation génétique. Le développement des cellules et des organes a été imagé dans les moindres détails, ce qui a conduit à la description de nouveaux comportements des cellules immunitaires, tels que le comportement des lymphocytes T dans le thymus19 en développement ou la bataille entre les mycobactéries intracellulaires et les phagocytes20-22. Des travaux récents ont décrit les interactions intestinales entre les microbes et l’hôte chez le poisson-zèbre et ont montré que la colonisation microbienne du tractus intestinal affecte la physiologie intestinale de l’hôte et la résistance à d’autresinfections23,24. De plus, l’infection par l’épithélium intestinal a été décrite pour plusieurs agents pathogènes.

Contrairement au tractus intestinal, la vessie natatoire représente un modèle muqueux plus isolé et complémentaire. Cet organe est une extension du tube intestinal en développement et se forme antérieurement au foie et au pancréas25,26. Il produit des tensioactifs, du mucus et des peptides antimicrobiens27,28 et anatomiquement, ainsi qu’ontogénétiquement, cet organe est considéré comme un homologue du poumon de mammifère29,30. Étant donné que le conduit pneumatique reste connecté à l’intestin chez le poisson-zèbre, cela permet à l’infection par immersion de se produire naturellement. Remarquablement, les seules infections naturelles connues chez les poissons avec des espèces de Candida sont les infections à C. albicans dans la vessie natatoire31. Nous avons récemment décrit un modèle expérimental d’infection par immersion où C. albicans infecte la vessie natatoire, et nous avons constaté que cette infection récapitule certaines des caractéristiques de l’interaction C. albicans-épithélial in vitro32,33.

Dans la méthode présentée ici, le modèle original d’infection par immersion est amélioré en injectant directement C. albicans dans la vessie natatoire de poisson-zèbre 4 jours après la fécondation (dpf). Cela permet un contrôle temporel précis de l’infection ainsi qu’un inoculum hautement reproductible. Il permet une imagerie intravitale détaillée, associée à la polyvalence du modèle du poisson zèbre. À titre d’exemple de ce qui peut être fait avec cette méthode, nous présentons la dynamique spatio-temporelle de la croissance de C. albicans ainsi que le recrutement des neutrophiles sur le site de l’infection. Parce que le tissu de la vessie natatoire du poisson-zèbre est difficile à imager par voie intravitale, nous présentons également une technique de dissection rapide de la vessie natatoire qui améliore le signal de fluorescence et la résolution microscopique. Ces méthodes élargissent la boîte à outils de la recherche fongique, immunologique et aquacole et décrivent une nouvelle voie d’infection qui peut être traduite pour modéliser d’autres infections fongiques, bactériennes ou virales des surfaces muqueuses.

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Protocol

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REMARQUE: Tous les protocoles et les expériences de soins de poisson zèbre ont été effectuées conformément aux directives du NIH sous institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) A2012-11-03 protocole.

1. poisson zèbre élevage pour quatre jours après la fécondation

  1. Recueillir AB poisson zèbre, ou d'autres lignées transgéniques, dans le premier poste de fertilisation 3 heures, comme montré dans un autre 34 vidéo.
  2. Incuber 120 oeufs dans un 15 cm boîtes de Pétri contenant 150 ml de milieu E3 (mM de NaCl 5; KCl mM 0,17; 0,33 mM de CaCl2; 0,33 mM de MgCl2, 2 mM d'HEPES, pH 6,8) avec du bleu de méthylène (0,3 ug / ml final concentration) dans un incubateur à 33 ° avec la lumière 12/12 / photopériode sombre.
  3. Remplacez le support après 6 h avec E3 + PTU (1-phényl-2-thiourée, 10 pg / ml de concentration finale) et retirer les oeufs morts.
  4. Incuber pendant 4 jours à 33 ° C, l'échange avec les médias frais E3 + PTU après deux jours.

2. Dansprojection Micro-aiguille Préparation

  1. Tirez borosilicate capillaire (OD 1,2 mm; ID 0,69 mm) dans un micro-aiguille à l'aide d'un extracteur de l'aiguille avec les paramètres suivants (550 chaleur; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time).
    REMARQUE: Les paramètres varient d'filament filament pour obtenir des micro-aiguilles de forme similaire (voir la figure 1) et devra être réajusté chaque fois qu'un nouveau filament est installé.
  2. Remplir une micro-aiguille avec 3 pi de 0,4 um filtré la solution saline de tampon phosphate (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4; pH 7,4) en utilisant un microloader pipette 20 ul pointe.
  3. Mettre en place la micro-aiguille sur un support de micropipette sur un micromanipulateur relié à un système d'injection sous pression. Régler la pression d'injection à 30 PSI et la durée d'impulsion à 30 ms.
  4. Utilisation d'une boîte de Pétri avec de l'eau distillée, abaisser la micro-aiguille jusqu'à 1/5 de l'aiguille est dans l'eau. Clip de la micro-aiguille with pinces fines juste en dessous du niveau de l'eau. Apportez la micro-aiguille hors de l'eau et pousser la pédale à plusieurs reprises jusqu'à ce qu'un bolus apparaît.
  5. Mesurer le diamètre du bol par l'abaissement de la micro-aiguille sur un hémocytomètre en couches avec une goutte de type A de l'huile d'immersion. Réglez la durée d'impulsion pour obtenir le volume souhaité (voir tableau 1).
  6. Régler la contre-pression pour le bolus de rester stable dans l'huile (abaisser la pression si le bolus augmente le volume et augmenter la contre-pression si le volume de bolus diminue). Enregistrer la durée d'impulsion pour chaque micro-aiguille.
  7. Retirez le PBS de la micro-aiguille en aspirant à l'aide d'une pipette de microloader et d'expulser les restes de PBS en la replaçant sur l'injecteur et appuyer sur l'interrupteur d'impulsion continue. Réservez chaque micro-aiguille.

3. Préparation Candida

  1. Streak Candida albicans transformées avec codon optimisé dTomato, GFP, BFP, EOS ou en Extrême-Rouge à partir d'un stock congelé (-80 ° C stock de 25% de glycérol) en utilisant une cheville en bois stérile sur un dextrose levure Peptine (YPD) plaque de gélose (10 g d'extrait / L de levure, 20 g / L peptone, 20 g / L de dextrose , / L agar 20 g; autoclave et versé 25 ml dans des boîtes de Pétri) et incuber une nuit à 30 ° C.
  2. Choisir une colonie en utilisant une cheville en bois stérile et inoculer à 5 ml de liquide YPD (10 g d'extrait / l de levure, 20 g / L de peptone, 20 g / l de dextrose, autoclavé et aseptique aliquoté dans 5 ml de culture en verre de 16 x 150 mm tubes).
  3. Incuber pendant une nuit à 30 ° C dans un rouleau tambour à 60 tours par minute.
  4. Prélever 1 ml de C. culture albicans et le transfert dans un tube à centrifuger stérile de 1,7 ml.
  5. Centrifuger à 5000 g pendant quelques secondes. Vider le surnageant et ajouter 1 ml de PBS stérile, vortex soigneusement. Répéter deux fois.
  6. Compter les colonies en utilisant un hémocytomètre en diluant le 1 ml stock 1: 1000 dans du PBS stérile.

4. Injection de poisson zèbre dansla vessie natatoire

  1. Réchauffer un plat d'injection (2% d'agarose) pendant 30 min dans un incubateur à 33 °.
  2. Au moment désiré, retirer 100 des 150 ml de l'E3 + PTU du plat 15 cm de Pétri contenant le poisson d'injecter en utilisant une pipette de 25 ml, sans aspirer toute poisson zèbre.
  3. Anesthésier 4 dpf poisson zèbre en ajoutant 2 ml d'un 4 mg / ml tamponnée tricaïne méthane sulfonate stock (TR) pour les 50 ml restants médias (concentration finale de 200 pg / ml) et attendre 15 min.
  4. Sous un microscope de dissection, choisir des poissons avec une vessie natatoire gonflée. Le poisson peut également être projeté à ce moment pour phénotype homogène, comme la distribution des neutrophiles dans mpo: ligne GFP en utilisant un microscope à dissection épifluorescence.
  5. Diluer le C. albicans stock à partir de sa concentration d'origine (étape 3.8) à 1,5 x 10 7 unités formatrices de colonies par ml (cfu / ml) dans du PBS formage.
  6. Transférer 30 poisson zèbre sur le plat d'injection à l'aide d'un tuyau de transfert en plastiqueTTE et retirez l'excès médias.
  7. En utilisant un outil de pêche fil (0,012 pouce la ligne de pêche de diamètre super-collés dans un capillaire de borosilicate), faire 3 lignes de 10 poissons, en tenant le plat d'injection verticale et orienter le poisson verticalement.
  8. Retirer l'excès médias.
  9. Bien agiter au vortex le tube avec 1,5 x 10 7 ufc / ml C. albicans.
  10. Remplir une micro-aiguille avec 3 pi de C. albicans en utilisant une nouvelle pointe de pipette microloader et définir la durée d'impulsion sur le réglage approprié (voir l'étape 2.9).
  11. Tourner le plat d'injection pour faire un angle de 20 ° entre la micro-aiguille et la tête du poisson, visant vers l'arrière de la vessie natatoire (figure 3A).
  12. Poussez la micro-aiguille dans la vessie natatoire, assurant que le trou de l'aiguille est dans la lumière, et appuyez sur la pédale fois.
  13. Répétez l'opération pour chaque poisson et de les transférer à un bac de récupération (25 ml E3 + PTU) en inondant le plat avec un E3d vider dans le bac de récupération.
  14. Transbordement, un autre 30 poissons à l'antenne d'injection.
  15. Répéter l'injection avec une nouvelle micro-aiguille remplie de fond au vortex C. albicans.
  16. Finition en injectant le contrôle PBS, si nécessaire, en utilisant une boîte d'injection différent pour éviter la contamination et les transférer à un plat de récupération séparée (étape 4.10).

5. Dépistage du poisson pour inoculum désiré

  1. Préparer 40 ml de 0,4% bas point de fusion solution d'agarose (LMA) en ajoutant 160 mg d'agarose à bas point de fusion 40 ml de E3, l'ébullition par micro-ondes jusqu'à dissolution et refroidissement à 37 ° C. Ajouter 400 ul de TR (concentration finale 200 ug / ml) une fois refroidi.
  2. Après 30 min de récupération, anesthésier le poisson comme décrit (étape 4.3 en utilisant seulement 1 ml de TR dans 25 ml E3 + PTU, concentration finale de 200 pg / ml).
  3. Transfert 30 poissons (avec aussi peu que possible les médias) à 2 ml de LMA dans un bateau de poids.
  4. Aspirer chaque poisson avec une pipette de transfert et plaque le poisson avec une gouttes de LMA dans une plaque d'imagerie 96 puits, en utilisant seulement les 10 x 6 puits central.
  5. Répétez jusqu'à ce que tous les poissons à l'écran sont chargés à la plaque d'imagerie.
  6. Que les médias se solidifient à la température ambiante pendant 5 min.
  7. Placez le poisson de leur côté, en se assurant qu'ils sont en contact avec le fond de verre.
  8. En utilisant l'objectif 20X sur une épifluorescence / microscope confocal inversé et le filtre approprié, enregistrer le nombre de C. des cellules de levure dans la vessie natatoire albicans de chaque poisson.
  9. Sélectionnez le poisson avec de 15 à 25 cellules de levure dans la vessie natatoire (ou inoculum désiré), euthanasier non sélectionnée poissons (800 ug / ml de TR en E3) et revenir poissons sélectionné pour une boîte de Petri profonde avec 50 ml de l'E3 + PTU par ajoutant 3 gouttes de E3 à la plaque de formation d'image sélectionnés puits et en aspirant le poisson avec une pipette de transfert en plastique.
  10. Incuber à 33 ° C pendant la durée souhaitée.

6. Imagerie du poisson post-dépistage

  1. Au moment désiré, retirer 25 des 50 ml de milieu E3 + PTU du plat profond Petri contenant le poisson à l'image.
  2. Anesthésier le poisson comme décrit (étape 4.3 en utilisant seulement 1 ml de TR dans 25 ml E3 + PTU reste, concentration finale de 200 pg / ml).
  3. Plate le poisson dans une plaque d'imagerie de 96 puits et la position appropriée (étapes 5.3 à 5.7).
  4. Image par microscopie confocale en utilisant les lasers appropriés et les filtres d'émission. Première accent sur le poisson en utilisant l'objectif 4X vertu contraste interférentiel différentiel (DIC) et acquérir des images de la région d'intérêt en utilisant l'objectif 20X avec les lasers confocale en mode de balayage avec 2 vitesses ps / pixel et 1024 x 600 ratio d'aspect de pixel. Acquérir Z-piles avec une taille de pas um, en appliquant le mode de filtre de Kalman de 3 images.
  5. Retour à une boîte de Petri profonde avec 50 ml E3 + PTU ou en individual puits (plat de 24 puits de culture, 3 ml E3 + PTU) et incuber à 33 ° C.

7. Dissection de la vessie natatoire

  1. Remplir une seringue de 10 ml avec de la graisse à vide élevé.
  2. Préparer un LMA 2% (étape 5.3 avec 160 mg de bas point de fusion agarose dans 8 ml de l'E3).
  3. À l'heure souhaitée, anesthésier le poisson (étape 5.2).
  4. 10 Transfert des poissons dans un tube de centrifugeuse de 1,7 ml avec 1 ml de E3 et euthanasie par addition de 200 ul de 4 mg / ml de tricaïne (concentration finale de 800 ug / ml) dans le tube de centrifugation et en incubant pendant 15 min à température ambiante.
  5. Préparer une lame de verre de formation d'image en plaçant quatre gouttes de graisse à vide dans un carré, 1 cm de distance sur une microlame (75 x 25 mm, figure 2).
  6. Placez deux gouttes de 2% LMA dans le milieu de la place.
  7. Placez un poisson sur une lame de verre séparée sous un microscope de dissection et vérifiez que le cœur a cessé de battre, retirez l'excès d'eau.
  8. en utilisant des pincettes fines disséquer la vessie natatoire en maintenant la tête dans une position fixe avec les pinces gauche et tirant vers le bas l'intestin antérieur avec les bonnes pincettes (figure 4A).
  9. Ramassez la vessie natatoire par le conduit pneumatique avec les pincettes gauche, le séparant du tube digestif, et le placer au centre de la LMA 2% avant qu'il se solidifie.
  10. Placez une lamelle (18 x 18 mm) sur le dessus de la lame de verre d'imagerie et poussez-le jusqu'à ce qu'il touche la graisse à vide ainsi que le LMA (Figure 2).
  11. Image à l'intérieur 10 min de la dissection comme décrit dans l'étape 6.4. Répétez l'étape 7.7 à 7.11 avec les autres poissons.

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Results

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La micro-injection dans la vessie natatoire postérieure

La méthode expérimentale présentée ici décrit l'injection d'une dose constante de C. des cellules de levure albicans dans la vessie natatoire des 4 dpf poisson zèbre. Des travaux antérieurs avec le modèle d'immersion suggère que la réponse immunitaire de la vessie natatoire à C. albicans est similaire à mammifère candidose des muqueuses 32. Ici, nous démontrons une méthode d'infection modifié qui est p...

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Discussion

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Les progrès et les limites du modèle de la maladie de la micro-injection de vessie natatoire

Le modèle présenté ici est une extension du modèle d'immersion de la candidose des muqueuses décrit dans Gratacap et al (2013).; il ajoute les avantages d'un temps d'infection contrôlée, une dose d'infection hautement reproductibles, et donc une meilleure efficacité. Nous démontrons ici de nouvelles méthodes qui permettent la documentation temporelle non-invasive de la dynamique...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le Dr Le Trinh et le Dr Tobin pour fournir généreusement l'α-caténine: ligne de poissons de citrine et Bill Jackman pour nous permettre de faire le tournage dans son laboratoire. Les auteurs reconnaissent les sources de financement Instituts nationaux de la santé (subventions 5P20RR016463, 8P20GM103423 et R15AI094406) et l'USDA (Projet # ME0-H-1-00517-13). Ce manuscrit est publié en tant que principal Agriculture et foresterie Expérience publication station numéro 3371.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubes de 1,7 mlAxygenMCT-175-C
Boîtes de Pétri profondesFisher Scientific89107-632
Pipettes de transfertFisher Scientific13-711-7M
Extrait de levureVWR Scientific90000-726
PeptoneVWR Scientific90000-264
DextroseFisher ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
Pince à épiler fine (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
Chevilles en boisVWR Scientific10805-018
Agarose à bas point de fusionVWR Scientific12001-722
Extracteur de micropipettes brun flamboyantSutter InstrumentsP-97
Capillaire en borosilicateSutter InstrumentsBF120-69-10
Système d’injection MPPI-3Applied Scientific InstrumentationMPPI-3
Unité de contre-pressionApplied Scientific InstrumentationBPU
Kit de porte-micropipetteApplied Scientific InstrumentationMPIP
Pédale de commandeApplied Scientific InstrumentationMicromanipulateur FSW
Instrumentation scientifique appliquéeMM33
Base magnétiqueInstrumentation scientifique appliquéeBase
Tricaïne méthane sulfonateWestern Chemical Inc.MS-222
Microscope de dissectionOlympusSZ61 haut SZX-ILLB2-100 base
Microscope confocalOlympusIX-81 avec FV-1000 à balayage laser Système
20X microscope objectifOlympusUPlanSApo 20x/0.75
Tambour à rouleauxNew Brunswick ScientificTC-7
Microloader pointesde pipetteEppendorf930001007
Tubes de culture en verre (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Argile pour enfants (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Bleu de méthylèneVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
Boîtes de PétriFisher ScientificFB0875712
Hémocytomètre ( Hausser scientific)VWR Scientific15170-172
Huile d’immersion de type ABlue Marble Products51935
CentrifugeuseEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Fil de pêcheStren
96 plaque d’imagerie de puits (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
Graisse sous vide poussé (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Microslide (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
Lamelles (18 x 18 mm), n° 1.5VWR Scientific48366-045
15 cm Boîte de Pétri (Olympus plastics)Genesee Scientific32-106
Glycérol (EMD chemicals)VWR ScientificEMGX0185-5
Boîte de culture 24 puits (Olympus plastics)Genesee Scientific25-107
Poids bateaux (8,9 cm)VWR Scientific89106-766
magnétiqueconfocal

References

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