Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de quantification simultanée des cercles d’excision des récepteurs des lymphocytes T (TREC) et des cercles d’excision de recombinaison K-supprimant (KREC). Le test TREC/KREC peut être utilisé comme marqueur de la production thymique et de la moelle osseuse.

Résumé

cercles d’excision des récepteurs des lymphocytes T (TRECs) et les cercles d’excision de recombinaison K-supprimant (KRECs) sont des éléments d’ADN circularisés formés au cours du processus de recombinaison qui crée des récepteurs des lymphocytes T et B. Parce que les TREC et les KRECs sont incapables de se répliquer, ils sont dilués après chaque division cellulaire et persistent donc dans la cellule. Leur quantité dans le sang périphérique peut être considérée comme une estimation de la production thymique et médullaire. En combinant un test TREC bien établi et couramment utilisé avec une version modifiée du test KREC, nous avons développé une PCR quantitative duplex en temps réel qui permet de quantifier les lymphocytes T et B nouvellement produits en un seul test. Le nombre de TREC et de KRECs est obtenu à l’aide d’une courbe standard préparée en diluant en série des articulations de signal TREC et KREC clonées dans un plasmide bactérien, ainsi qu’un fragment du gène de la constante alpha du récepteur des lymphocytes T qui sert de gène de référence. Les résultats sont exprimés en nombre de TREC et de KREC/10⁶ cellules ou par ml de sang. La quantification de ces fragments d’ADN s’est avérée utile pour surveiller la reconstitution immunitaire après une greffe de moelle osseuse chez les enfants et les adultes, pour améliorer la caractérisation des déficiences immunitaires ou pour mieux comprendre l’activité de certains médicaments immunomodulateurs.

Introduction

Cercles d'excision du récepteur des cellules T (TREC) et des cercles recombinaison excision K-suppression (KRECs) sont de petits éléments d'ADN circularisées qui sont excisés dans une proportion de lymphocytes T et les cellules B, respectivement, au cours d'un processus de recombinaison d'ADN génomique, ce qui conduit à la formation d'un répertoire très diversifié de récepteurs T et cellules B. Ils ne ont aucune fonction, mais parce qu'ils sont stables et ne peuvent être reproduites, elles sont diluées après chaque division cellulaire, ainsi que la persistance dans l'une des deux cellules filles. Par conséquent, les niveaux dans le sang pé....

Protocole

déclaration d'éthique: NOTE: Ce protocole suit les lignes directrices de notre institution, le Spedali Civili di Brescia

1. Préparation d'un "Triple-Insertion" plasmide

1. Sélection et préparation du matériel de départ approprié:
   1. Obtenir un échantillon contenant des cellules très susceptibles d'avoir TREC et KRECs détectable par PCR, tel que le sang périphérique d'un sujet jeune en bonne santé recueillies dans des tubes EDTA.
      NOTE: A l'origine, nous avions développé la méthode utilisant thymocytes pour TREC et cellules mononucléaires à partir de fragments de l'amygdale pour KRECs, mais des sujets sains ont généraleme....

Résultats

L'analyse a été effectuée sur un échantillon représentatif de 87 témoins sains: 42 enfants âgés de 0 à 17 (mâles / femelles: 25/17) et 45 adultes âgés de 24 à 60 (hommes / femmes: 29/16). Les résultats ont été obtenus sous forme de TREC et KRECs 10 ⁶ par les PBMC, puis les TREC et KRECs par ml de sang ont été calculés.

Le nombre de TREC diminue avec l'âge en raison de l'involution thymique ^4, en particulier d'une manière très forte 0-3 - 4 years. Chez les adultes, le no.......

Discussion

La quantification du TREC et du KREC peut être considérée comme une bonne estimation de la production récente de thymus et de moelle osseuse, à condition que certaines mises en garde soient prises en compte. Même si une méthode de quantification absolue utilisant une courbe standard nécessite plus de réactifs et plus d’espace sur la plaque de réaction de PCR en temps réel, elle garantit des résultats quantitatifs très précis car des quantités d’échantillons inconnues sont interpolées à partir de courbes standard construi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	Méthode de séparation par gradient de densité
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)	QIAGEN	51106	Extraction d’ADN
Oligonucléotides d’ADN non modifiés HPSF 0,01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  ;		Remettre le produit lyophilisé en suspension à 100 pmol/µ ; l
ADN polymérase AmpliTaq : y compris 10x Buffer II et 25 mM MgCl2	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Cellules compétentes	Stratagene	200130
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
Tampon TE (1 mM TRIS et 0,1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Sondes à double marquage HPLC 0,01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  ;		Remettre le produit lyophilisé en suspension à 100 pmol/µ ; l
Spectrophotomètre NanoDrop 2000c	ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermocycler	Applied Biosystems/Life-Technologies	4359659
Fast 7500 Système de PCR en temps réel	Applied Biosystems/Life-Technologies
Logiciel de détection de séquences SDS 1.4	Applied Biosystems/Life-Technologies