Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l'acide périodique Schiff coloration

Résumé

La coloration périodique à l’acide de Schiff est une technique qui permet de visualiser la teneur en polysaccharides des tissus. Cet article présente le protocole de coloration périodique à l’acide de Schiff adapté pour une utilisation sur des cellules mononucléées du sang périphérique purifiées à partir de sang veineux humain. Ces échantillons sont enrichis pour les lymphocytes et autres globules blancs du système immunitaire.

Résumé

La coloration périodique à l’acide de Schiff (PAS) est une technique immunohistochimique utilisée sur les biopsies musculaires et comme outil de diagnostic pour les échantillons de sang. Les polysaccharides tels que le glycogène, les glycoprotéines et les glycolipides colorent le magenta vif, ce qui facilite le dénombrement des cellules positives et négatives dans le tissu. Dans les cellules musculaires, la coloration PAS est utilisée pour déterminer la teneur en glycogène dans différents types de cellules musculaires, tandis que dans les échantillons de cellules sanguines, la coloration PAS a été explorée comme outil de diagnostic pour une variété de conditions. Le sang contient une proportion de globules blancs qui appartiennent au système immunitaire. L’idée que les cellules du système immunitaire possèdent du glycogène et l’utilisent comme source d’énergie n’a pas été largement explorée. Ici, nous décrivons une version adaptée du protocole de coloration PAS qui peut être appliquée sur des cellules immunitaires mononucléées du sang veineux humain. De petites cellules avec des granules positifs au PAS et des cellules plus grandes avec une coloration diffuse au PAS ont été observées. Le traitement des échantillons avec de l’amylase abroge ces motifs, confirmant la spécificité de la coloration. Une autre technique basée sur la digestion enzymatique a permis de confirmer la présence et la quantité de glycogène dans les échantillons. Ce protocole est utile pour les hématologues ou les immunologistes qui étudient la teneur en polysaccharides dans les lymphocytes dérivés du sang.

Introduction

L'acide périodique Schiff (PAS) est une technique de coloration immunohistochimique qui est largement utilisé dans la recherche et le diagnostic musculaire. Il est également utilisé comme outil de diagnostic dans des échantillons de sang. La technique fonctionne en appliquant une solution d'acide périodique à l'échantillon, qui se oxyde à l'intérieur des unités de polysaccharide créer des groupes aldéhyde qui réagissent avec le réactif de Schiff l'incolore pour produire ainsi un produit de magenta foncé. Les étapes de cette procédure sont représentées sur la figure 1. La tache tourne avec quoi que ce soit, y compris des polysaccharides magenta glycogène, les glycoprotéines, les glycolipides, les mucines, ou d'autres molécules ayant des groupements polysaccharidiques.

Coloration PAS est souvent utilisé pour mesurer les niveaux de glycogène dans les fibres musculaires. Muscles sections de tissus sont idéales pour la technique qu'ils attachent fermement à la diapositive et résister à de multiples étapes de lavage et de coloration. Le glycogène est plus présent dans contraction rapide de type II fibres musculaires, qui ont une forte demandepour la production d'ATP rapide nécessitant glycogène pour ^1,2 de performance maximale. Le glycogène est un polymère ramifié du glucose qui peut être divisé en glucose libre par l'action d'enzymes de la glycogène Phosphorylase. Dans les temps de repos et de suffisance nutritionnelle, le glycogène est reconstitué par le processus de glycogenèse, tandis qu'en temps de l'insuffisance ou de haute énergie nutritionnelle la demande; glycogène est décomposé en glucose par glycogénolyse. De dès les années 1950, les cliniciens-chercheurs ont exploré la coloration PAS sur des échantillons de sang pour analyser le contenu de glycogène dans diverses maladies ^3-7. Par exemple, dans la maladie de Pompe, une glycogénose de bonne foi globules blancs aux maladies accumulent de grandes quantités de glycogène qui diffère sensiblement de ⁸ témoins sains.

Cet article explique-vidéo d'une version adaptée de coloration PAS pour une utilisation sur des cellules périphériques mononucléaires de sang périphérique (PBMC) des échantillons de sang veineux de sujets humains en bonne santé. PBMCs contient essentiellement des lymphocytes du lymphocyte T et les familles de lymphocytes B, ainsi que d'autres cellules du système immunitaire telles que des cellules et des monocytes tueurs naturels. La première étape de purification élimine les erythrocytes, les neutrophiles, les granulocytes et d'autres. Cette technique fournit des données sur une partie de concentré pour la numération des lymphocytes permettant plus robuste de cellules de PAS-positif par rapport à l'aide de frottis de sang total.

Figure 1:. Étape par la méthodologie de l'étape de la coloration PAS sur CMSP (A) d'abord, l'isolement des PBMC est réalisé par gradient de ficoll, le panneau de gauche montre la préparation avant la centrifugation, le panneau de droite montre après centrifugation où la couche leucocytaire contenant les PBMC On observe dans le centre du tube. (B) PBMC isolées sont fixées sur la lame à l'aide de formol-éthanol solu fixantstion. La lame est doucement rincé avec de l'eau distillée dans une bouteille de lavage en matière plastique. (C) La lame est ensuite placé dans un bécher de 100 ml rempli à mi-chemin avec une solution d'amylase, qui dissoudra glycogène. La lame est rincée doucement. (D) La lame est traité avec une solution d'acide périodique, où l'oxydation des saccharides a lieu. Les lames sont rincés doucement; cela va enlever l'excès de l'acide périodique et arrêter l'étape d'oxydation. (E) Lorsque le réactif de Schiff est ajouté aux lames, il va réagir avec des aldéhydes créés au cours de l'étape d'oxydation. Ce réactif incolore va alors donner un produit magenta rouge profond. Les lames sont doucement rincées pour éliminer le réactif Schiff excès.

Protocole

Recherche avec des échantillons de sang humain a été approuvé par le Conseil d'examen éthique de l'Université Concordia, le numéro de certificat 10000618. Le travail sur les muscles de la souris a été approuvé par le Conseil d'examen éthique de l'Université Concordia, numéro de certificat 2010BERG.

1. Isolement PBMC à partir de sang

REMARQUE: Effectuer cette procédure dans une enceinte de biosécurité utilisant une technique stérile et de l'équipement du fabricant stérilisé.

1. Verser soigneusement 10 à 15 ml de sang complet à partir des tubes héparinés (anti-coagulant) collecte de sang dans un tube conique de 50 ml stérile. Pour les déversements de sang mineurs, essuyer avec ddH ₂ O et 70% EtOH en utilisant des tissus de nettoyage.
2. On dilue le sang dans le tube conique à un rapport 1: 1 avec le tampon phosphate salin (PBS 1X) pH 7,4. Assurez-vous que le volume total maximum ne dépasse pas 30 ml.
3. Mélanger doucement à l'aide d'une pipette sérologique pistolet en évitant les bulles.
   NOTE: Ne pas mélanger en inversant le tube pour éviter un sangccumulation dans le bouchon et l'infiltration subséquente pendant la centrifugation.
4. Ajouter 13 ml de Ficoll-Paque (voir Matériels et table Équipement), à un nouveau tube conique de 50 ml de capacité. Gardez le tube vertical dans le rack.
5. Aide d'une pipette de transfert, une prise de sang dilué, toucher la pointe de pipette de transfert à la paroi intérieure du tube près du sommet. Avec une pression lente et régulière, transférer le sang le long de la paroi intérieure du tube formant une couche de sang au-dessus de la couche de saccharose. Effectuez cette opération plusieurs fois jusqu'à ce que tout le sang a été transféré.
6. Boucher le tube hermétiquement et centrifuger le tube à la température ambiante pendant 30 min à 700 xg dans un rotor swing avec l'ensemble de l'accélération moyenne à 5, et la décélération mis à zéro.
7. Sortez lentement le tube et sans déranger les couches, le ramener à l'enceinte de sécurité biologique.
8. Recueillir soigneusement la couche leucocytaire (mince couche blanche trouble), où se trouvent les CMSP, placé entre le PBS / plasma une couches de Ficoll en utilisant une pipette de transfert. Éviter de recueillir couche de saccharose et de ne pas déranger la couche de globules rouges.
9. Transférer la couche leucocytaire dans un nouveau tube de 50 ml conique stérile. Il peut prendre plusieurs fois de répéter l'étape 1.8 de recueillir toutes les CMSP.
10. Ajouter PBS pH 7,4 au tube avec le CMSP et remplir jusqu'à la marque 45 ml. Bien agiter tube. Ne pas vortex.
11. Lavez 1: Centrifugeuse pendant 15 min à 480 xg à la fois avec une accélération maximale et la décélération réglé à 9. Observez formation d'un culot de PBMC au fond du tube conique.
12. Rejeter le PBS (surnageant) dans un bécher en plastique avec 10 ml d'eau de Javel.
13. Desserrer culot cellulaire par doucement "rayonnage" contre une surface ondulée (c.-à-rack vide). Ne pas vortex.
14. Ajouter 25 ml de PBS frais pH 7,4 au tube. Si plus d'un tube est en cours, en commun les pellets ensemble dans cette étape.
15. Lavez 2: Centrifugeuse le tube pendant 12 min à 480 xg with la fois l'accélération et la décélération maximale fixé à 9.
16. Rejeter le PBS (surnageant) dans le bécher en plastique avec un peu d'eau de Javel.
17. Doucement "rack" contre une surface ondulée (c.-à-rack vide). Ne pas vortex.
18. Ajouter 25 ml de PBS frais dans le tube.
    1. Sortez 50 pi des cellules et transférer dans un tube à centrifuger pour le nombre de viabilité.
    2. Ajouter une quantité égale (50 pi) de bleu trypan (une tache de viabilité) et pipette de haut en bas pour mélanger doucement.
19. Sortez 10 pi et le transférer sur un hémocytomètre pour vérifier la viabilité des cellules par ml. Notez le nombre de cellules / ml.
20. Sortez la quantité désirée de cellules et centrifuger le tube pendant 12 min à 480 xg à la fois avec une accélération maximale et la décélération réglé sur neuf.
21. Rejeter le PBS (surnageant) dans le bécher avec l'eau de Javel.
22. Doucement "rack" contre une surface ondulée (c.-à-rack vide). Ajouter 80 pi de PBS dans le tube.

2. Faire le diaporama PBMC

1. Placer 80 ul des cellules sur une lame de microscope. Enduire la goutte à l'aide d'une autre lame ou placer deux gouttes de 40 ul de chacune des deux extrémités de la glissière.
2. Laissez diapositive dans l'enceinte de sécurité biologique à sécher. Étiqueter la lame avec un crayon sur le côté givré.

3. Fixation des échantillons sur les lames

1. Préparer la solution de fixation en mélangeant 0,5 ml de formaldehyde à 37% 4,5 ml d'éthanol à 99%.
2. Une fois que les lames sont séchées, sortir 2 ml de la solution de fixation fraîchement préparé et le verser sur le coulisseau de sorte que toute la surface de la glissière est couverte.
3. Laissez la solution sur la lame pendant 1 min. Rincer la lame pendant 1 min avec de l'eau du robinet et laisser sécher à l'air.

4. Faire la solution amylase pour le contrôle négatif

1. Prendre 0,25 g de poudre d'amylase et dissoudre dans 50 ml de dil'eau calmé. Verser la solution dans un endroit propre bécher de 100 ml.
2. Immerger la lame dans le bécher de sorte que la moitié de la glissière reçoit le traitement et l'autre moitié ne est pas traitée et ensuite incuber pendant 15 min à température ambiante (figure 1C).
3. Faire une note sur le côté de la glissière reçoit le traitement de l'amylase. Tracez une ligne sur le dos de la lame indiquant la frontière entre le traitement et le contrôle.
4. Laver les lames avec ddH ₂ O pour éliminer la solution d'amylase et de laisser la lame sécher à l'air.

5. Effectuez l'acide périodique Schiff (PAS) Coloration et imagerie

NOTE: PAS réactifs sont toxiques par inhalation et sont corrosifs, de sorte que les mesures doivent être fait dans une hotte chimique et les déchets doivent être correctement éliminés conformément aux directives institutionnelles.

1. Placer la lame sur une surface plane et versez 1,50 à 2,00 ml de solution d'acide périodique sur l'échantillon. Incubate pendant 5 min à température ambiante.
2. Rincer les lames dans plusieurs charges d'eau distillée.
3. Verser 1,50 à 2,00 ml de réactif de Schiff sur la lame et incuber à température ambiante pendant 15 min.
4. Laver la lame avec de l'eau distillée pendant 5 minutes et laisser sécher à l'air.
5. Appliquer 10 pi milieu de montage sur la lame et couvrir avec deux petites lamelles, ou d'appliquer 50 pi et utiliser une grande lamelle.
6. Appliquer vernis à ongles transparent sur les bords de la lamelle, laisser sécher pendant la nuit.

6. obtenir des images au microscope optique binoculaire à l'aide de l'objectif 100X

Résultats

Pour valider les réactifs et la technique de base, PAS coloration a été effectuée selon les instructions du fabricant sur des sections du muscle soléaire de souris. La coloration a été réalisée le même jour que le sacrifice et dans la dernière étape de la coloration, les coupes ont été fixées par du xylène. Le muscle soléaire est connu pour contenir ~ 35% de cellules de glycogène positif ^9. Les cellules musculaires colorées affichent deux granulés ponctuées Caractéristiques- PAS-positifs distincts au sein de ...

Discussion

Les étapes essentielles du présent article vidéo étaient au cours du lavage et de l'amylase traitement des cellules. Alors que le lavage des lames, l'étape clé utilisait une bouteille de lavage compressible plastique et laisser couler l'eau doucement à travers l'échantillon sur la lame et ne visant pas directement sur les échantillons. Même la pression d'eau directe moindre causerait les cellules à venir de la lame. Une autre étape clé était d'utiliser la même diapositive pendant ± conditions d&#...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kits de réactif acide périodique-Schiff	Sigma-Aldrich	395B	Porter à température ambiante avant utilisation. Les composants de ce kit sont toxiques et nocifs. Manipuler avec précaution.
α-Amylase provenant du pancréas porcin	Sigma-Aldrich	A3176
Microscope binoculaire	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Kits de dosage du glycogène	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Polymère synthétique non ionique de saccharose.
Centrifugeuse			Pour l'isolement des PBMC, des godets oscillants ont été utilisés.