Abstract
Şartlı korku Extinction yaygın erkek kemirgenlerde çalışılmıştır. Son zamanlarda, bazı davranışsal görevleri ve tepki davranışları için nöral mekanizmalar kadın ve erkeklerde farklı olduğunu belirten çalışmaların giderek artan sayıda olmuştur. Araştırma çalışmalarında kadın kullanma nedeniyle östrus döngüsü sırasında gonadal hormonların değişimi bir meydan okuma temsil edebilir. Bu protokol, dişi sıçanlarda korku söndürme bellek konsolidasyon östrojen rolünü araştıran yararlıdır köklü prosedürleri açıklar. Östrus döngüsü ve eksojen östrojen verilmesi öncesinde söndürme eğitimi Faz 24 saat sonra yok olma hatırlama etkileyebilir. Burada anlatılan östrus faz tanımlanması için vajinal alma, temizleme tekniği muayene ve doğal gonadal hormonlar bisiklet manipülasyonu yardımcı olur. ayrıca östrojen korku söndürme bellek modüle hangi mekanizmalar tasvir edebilir bu temel kemirgen modelinin kullanılmasıkadın.
Introduction
İçsel cinsiyet farklılıkları insanlarda ve kemirgenler hem de çeşitli bilişsel davranışları ve öğrenme paradigmaları arasında görülmektedir. Örneğin, erkekler daha iyi mekansal yetenekleri 1-3 sahipken kadınlar genellikle, güçlü sözel ve detay odaklı yeteneklere sahip olduğu bildirilmiştir. Bu cinsiyet farklılıkları gonadal hormonların etkisiyle kısmen olabilir. Yüksek östradiol seviyesi kadınların daha iyi olduğu görevler performansını artırmak, ama erkekler genelde kuyu 4-6 yaptığınız görevler performansı kötüleşir. Bu kanıt zorlayıcı olsa da, tamamen insan çalışmalarında deneysel ortamlarda kontrol sınırlı yeteneği davranışı bu etkilerin hormonlar özellikle isnat edilebilir, eğer zor belirlemek için yapar. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar, bunun aksine, tam olarak kontrol edilen durumlar için izin verir.
Korku yok temel nöral mekanizmaları tespit edilmiştir ve iyi erkeklerde okudu rağmen, o belirsizdirBu sistemler kadın ya da nasıl östrus döngüsü boyunca değişiklik aynıdır. Korku klima ve sönme yaygın anksiyete bozukluğu ile ilgili çalışmalar yapmak üzere kemirgenlerde ve insanlarda davranış paradigmalar kullanılmaktadır. Kadınlar anksiyete bozuklukları için yüksek risk yanı sıra yüksek semptom süresi ve şiddetini 7-13 sahip olduğu göz önüne alındığında, bu çalışmalarda kadın dahil etmek önemlidir. Bu araştırmada kadınların underrepresentation seks hormonlarının davranışsal etkileri için estrojen faz izleme ve muhasebe zorlukları bağlı olabilir. Genellikle geçmiyor veya kendi çalışmaları için yöntemler açıklanmayan Bu bağlamda karşılaşma konularında kadın incelemek yapmak Laboratuvarlar.
Kemirgenlerde delil Yükselen korku yok seks farklılıkları gonadal hormonların 14-18 tarafından modüle olduğunu göstermektedir. Korku klima, hayvanlar, belirli bir uyaran korku için eğitilmiştir. Bir Katkısız sunumlar bir sayıdan sonrauyarıcı, hayvanlar işaret, yok denilen bir süreç korku değil öğrenirler. Ne kadar iyi hayvan öğrenir ve söndürme eğitimi bir süre sonra verilen bir nesli geri çağırma testi sırasında görülebilir bu görevi öğrenme bellek birleştirir. Tükenme hatırlama sırasında daha az korku ifadesi iyi söndürme bellek konsolidasyonu gösterir. Laboratuvarımızda elde edilen son bulgular östrojen korku söndürme bellek konsolidasyonu modüle ve söndürme hatırlama artırabilir öneririz. Özellikle, Proestrus içinde söndürülür dişi sıçanlar, östrus döngüsü faz sırasında östrojen düzeyleri zirve, tükenme bellek sergi gelişmiş tutma dolaşan. Buna karşılık, önce veya hemen söndürme eğitimi 15,16 sonra eksojen östradiol yönetimi ile geliştirilebilir düşük östrojen ostrus faz ekran nispeten zayıf nesli hatırlama olarak söndürülür kadın,. tükenme bellek konsolidasyon nöral mekanizmaları (KDVKadınlarda gonadal hormonların rolü) uding net değil.
Laboratuvar hayvanlarında, hormonların, kastrasyon ve ovariektomi invazif cerrahi olarak çıkarılması prosedürler kullanılarak araştırılabilir. Ameliyat sonrası iyileşme müteakiben, gonadal hormonlar genellikle dışsal olarak bir davranış görev 19 performansı sırasında manipüle edilmektedir. Bu yaklaşım, seks hormonları hakkında önemli bilgiler sağladı ve 20-23 (zamanlama ve doz açısından) gonadal hormonların iyi kontrollü manipülasyon için izin verir, çünkü yararlıdır olmuştur. Bu yaklaşım, ancak, östrüs döngüsü boyunca ortaya ne de böylece insan çalışmalara translasyonel potansiyelini sınırlayan, "normal" hayvanları temsil ediyor doğal olarak meydana gelen dalgalanmaların etkisini değerlendirmek değildir. Bu iyi belgelenmiş oldu belirli östrus döngüsü aşamalarında, ve döngüsü içinde östrojen reseptör ifade değişiklikleri de kadın cinsiyet hormonu seviyeleri zirve ve düşüş,ve ovariektomiye 24 sonrası. Böylece, sağlam gonadlar kadınlarda üzerinde çalışmalar yapmak ve güvenilir yüksek ve düşük östrojen devletler kendi ömrü boyunca kadın üzerinde olan etkilerini incelemek için deneysel tasarımlar geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Bu protokol korku yok katılan nörobiyolojik sistemler üzerinde östrojenin etkisi üzerinde duruluyor. 1) dikkatli, östrus döngüsü izlemek 2) Sistemik uygulama için östradiol etkili dozlarda hazırlamak, ve 3) korku klima, nesli içeren bir davranış paradigma takip ve doğal bisiklet dişi sıçanlar içinde hatırlamak: Bu nasıl açıklanır. Bu protokol, daha tükenme davranışını korku şartlandırılmış gözlenen cinsiyet farklılıkları anlamak için çalışmalar yardım için diğer farmakolojik manipülasyonlar ve hücresel ve moleküler araçlar ile modifiye edilebilir. Aşağıda açıklanan prosedürleri laboratuvar içinde kullanılan olanlar olduğunu unutmayın, ve bu işlemlerin varyasyonları bir dizi var in edebiyat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol tüm işlemler Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) olarak hizmet vermektedir Araştırma Hayvan Bakım Alt Komitesi tarafından onaylanmış, ve Sağlık kılavuzların National Institutes uygundur edilmiştir.
1. Hayvan Konut ve Taşıma Prosedürü
- Girişte, ev erişkin Sprague Dawley dişi sıçanlar yaş yaklaşık 8-10 hafta woodchip yatak ile 3-4 inçlik plastik bidon gruplar halinde (200-225 gr ağırlığında). Bir tanesi çorbaya ad libitum erişim diyet ve su ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde bunları muhafaza edin. 1 hafta en az konut koşulları ve hayvan tesis gelmesini fareler bırakın.
NOT: Bu yazının tüm işlemler ışık döngüsü sırasında yapılmaktadır. - Bu alışma süresinden sonra, 5 dakika 2-3 gün her biri için tüm hayvanları idare. Düzgün, (gövde tarafından değil kuyruk tarafından desteklenen) bir seferde sıçan bir pick upgüvenli onları tutun ve bu süre içinde onları pet. Ürkek, ya da daha uzun süre için endişeli, stresli daha görünür hayvanları taşıyınız. Bu protokolde aşağıdaki adımları etkileyebilecek stres en aza indirmek için bunu yapın.
NOT: gün sayısı ve zaman farklı laboratuvarlarında arasında değişebilir hayvanların taşıma miktarı; Ancak, bu aynı laboratuvarda içindeki deneyler arasında tutarlı olmalıdır.
2. Kızgınlık Döngüsü İzleme: Vajinal Çubuğu bulaşması ve Boyama Prosedürü
- % 0.9 tuzlu su çözeltisi (sodyum klorür, distile su içinde çözündürülmüş) olun. Bu çözümde bir pamuk uçlu aplikatör nemlendirin. Yetersiz numune toplama veya hücre kaybına yol açabilecek doyma önlemek için kağıt havlu kullanarak ucu kurulayın. Yukarı doğru vajinal açıklıktan kuyruk Holding, yavaşça vajinal kanal içine pamuk ucu takın ve gevşek vajinal hücreler yakalamak için duvarların etrafında döndürün.
- Hayvan karyolası urinates iseidrar kirlenme faz tanımlanması için zor hale getirecek gibi tonluk ucu, bir yenisi ile değiştirin. Strese maruz östrus döngüsü bozabilir çünkü bu işlem sırasında hayvana sıkıntı neden değil son derece dikkatli olun. Sürüntü zaman sahte gebeliği uyarabilir serviks, ekstra stimülasyon en aza indirmek için çok derin olmayan bir hızlı ekleme ve geri çekilme sağlamayı hedefliyoruz.
Not: yalancı örneğin tipik olarak yaklaşık 12 gün süren bir asiklik östrus döngüsü, diöstrüste 25 ardışık gün olarak tespit edilebilir. - Dikkatle aplikatör ucu çıkarın ve bir ön-etiketli mikroskop lamı üzerine yuvarlayın. Faz kimlik kez zor kuru yapabilirsiniz slayt çok fazla sıvı gibi çok sert basmaya kaçının.
NOT: Bu bireysel tercihlerine göre yapılabilir, ancak bir slayt, her hayvan için birden fazla gün içerebilir. - Slayt üzerine numune transferler emin olun. Sever için örnekleri toplayınbir slaytta al gün üst üste iyi parça muktedir ve günlük östrus fazlar değişiklikleri tanımlamak için.
NOT: örneklerin toplanması insanlar hayvanlar için aynı kalırsa, o da ideal Mümkünse. - Slayt kuruduktan sonra, faz tespiti için boyama protokolü başlar. Boyama kiti (Malzeme Tablo) kullanarak, fiksatif (açık mavi) slaytlar 10 kez batırmayın, (pembe) leke çözeltisi içinde 10 kez ve counterstain çözeltisi içinde 5 kez (mor). Durulayın yavaşça akan suyun altında kayar. Mikroskop altında inceleyen önce tamamen kuru hava slaytlar edelim.
Not: 4-5 gün boyunca çevrimi (bu sırayla) oluşur: kızışma (E) ostrus (M) diöstrüste (D) ve proestrus (P) 26. Östrus mavi, boynuzsu hücreleri, lökositler tarafından ostrus ve kornifıye ve çekirdekli hücrelerinin bir kombinasyonu ile karakterize olduğu, diöstrüste çok seyrek dışında hücre tiplerinin mevcudiyetinde ostrus benzer ve proestrus mor lekeli agregatları ileve çekirdekli hücreleri (Şekil 1). Vajinal sitoloji yayma için eşit derecede etkin olan, yukarıda tarif edilenlere ek olarak çeşitli boyama işlemleri vardır. - Doğru deney öncesinde aşamalarını izlemek için en az iki tam döngüsü (~ 8-10 gün) örnekleri toplayın. Numuneler alınır günün saatine ile tutarlı olun. Boyunca ve deney sonuna kadar günlük vajinal smear örnekleri toplayın.
3. Ön pozlama
- Deneyin başlamasından önce, odalar hayvanlar herhangi bir davranış testi öncesi bağlamında (klima odaları) gelmesini bekleyin klima hayvanları önceden maruz.
- Herhangi bir deney öncesinde 3 gün boyunca günde 20-30 dakika süreyle ev ışıkları ile (ses azaltıcı kutularda bulunur) Klima odalarına kadın Öncesi maruz. Onlar önceden maruz kalan çalışma için kendi odasına olarak vardır kutuyu atayın. İyice temiz tonlar davranış ve östrus döngüsü etkileyebilir çünkü oturumları ve hayvanlar arasındaki o kutuları (duvarlar ve tepsiler) kokuları çıkarmak için.
4. Gün 1: Alışma / Korku Klima
- Hayvanlar östrüs siklusu ve östrus fazında olduğu doğrulandıktan sonra, 3 gün deney alışkanlık / Klima faz başlar.
- Ön sinyal sesi deney her gün ilk sesi şartına uyarana önce (CS) sunumlar donma temel önlemleri alın. CS başlamasından önce ilk CS-alone davanın başında uyaran-devamsızlık zaman aralığında (100 ile çarpılır deneme süresi ile hareketsiz harcanan saniye bölünmesiyle hesaplanan) yüzde dondurma puanları alarak bu yapın.
NOT: Bu tedbirler değerlendirmek ve alışma, klima, nesli ve hatırlama sırasında olanlarla temel donma seviyelerini karşılaştırmak için kullanılır. - Ostrus aşamasında söndürme eğitimi yapmak için,kızışma onların son günü sıçan ko˛ullandırın. Sürüntü ve tanımlamak östrus faz (adım 2) deneysel protokol (Klima / sönme / hatırlama) başlamadan önce her gün. Kızışma faz bir gün daha uzun sürebilir gibi hayvanlar eğitime başlamak için hazır olduğunuzda, kullanım döngüsü geçmişi belirlemek için aşamadan uzunluğunu tahmin etmek.
- Ön sinyal sesi deney her gün ilk sesi şartına uyarana önce (CS) sunumlar donma temel önlemleri alın. CS başlamasından önce ilk CS-alone davanın başında uyaran-devamsızlık zaman aralığında (100 ile çarpılır deneme süresi ile hareketsiz harcanan saniye bölünmesiyle hesaplanan) yüzde dondurma puanları alarak bu yapın.
- Klima odalarında, bir elektrik stimülasyonu jeneratörüne ayak-şok ızgara zemin bağlayın. Koşulsuz uyarıcı (ABD) olarak 0.5-0.6 mA stimülasyon seviyesini kullanın. 4 kHz, şartlandırılmış uyaran (CS) olarak 80 dB sesi kullanın.
NOT: Bu parametreler laboratuarlar arasında değişebilir ve optimal klima modifiye edilebilir.- (Zamansal aksine) dondurma analiz programı görsel ipuçları gerektiriyorsa, sesi ile bir LED ışığı eş-etkinleştirin. Video çerçevesinde, edimsel odasının dışına ışık yerleştirin. Her denemenin başında, LED ışığı aktive ve th sonuna kadar ışıklı tutmakE deneme.
NOT: Bu ışık hayvan tarafından görünür değildir ve sadece başlatılması ve kaydedilen video dosyaları içinde deneme sonu için bir belirteç olarak hizmet vermektedir (donma davranışı ölçmek için kullanılacak).
- (Zamansal aksine) dondurma analiz programı görsel ipuçları gerektiriyorsa, sesi ile bir LED ışığı eş-etkinleştirin. Video çerçevesinde, edimsel odasının dışına ışık yerleştirin. Her denemenin başında, LED ışığı aktive ve th sonuna kadar ışıklı tutmakE deneme.
- Alışma 5 CS-alone denemeler için klima odalarına hayvanları yerleştirin. Hemen alışma oturumu izleyen, korku şartlandırma 7 eşleştirilmiş CS-ABD denemeler yapın. CS tonu 30 saniye sürer ve 0,5 sn ABD şok coterminates emin olun. 3 dakika ortalama değişken intertrial aralıklarla tüm oturumlara (alışma, klima, yok olma, ve hatırlama) çalıştırın çalışmalar.
- Klima oturumun sonunda, ertesi güne kadar hayvan tesis evlerinde kafeslerde ve hayvanların dönün.
5. Gün 2: Estradiol Hazırlık
- Sürüntü ve bu protokolün 1. Gün yapılan tüm hayvanlar için estrojen faz tespit. Estradiol hazırlanması (aynı zamanda E2, 17beta-östradiol, ya da bilinensusam yağı ya da taşıyıcı olarak% 0.9 tuzlu su kullanılarak, bir 15 ug / kg dozda deri altı enjeksiyonu olarak beta-estradiol).
- Enjeksiyonlar için hazırlamak bu protokolün Gün 1 şartına zaman ölçülmüş ve kaydedilmiş tüm hayvanların, vücut ağırlıkları kullanmak için östradiol miktarını hesaplamak için.
- Sıçan başına estradiol (örneğin, 0.2 mi), aralannda, tatbik hacmi standardize etmek için hesaplamaları yapar. Östradiol dolayı suda çözünmezlik erimesi zor olan ve küçük bir doz için çözücünün büyük bir hacim gerektirdiği için, çözülene kadar ateşte susam yağı içinde estradiol karıştırılarak bir stok solüsyonu hazırlanır. Çözelti daha sonra kirlilikleri çıkarmak için bir 0.22 um filtre içinden geçirilebilir. Örneğin, hayvan başına 0.2 ml'lik bir enjeksiyon hacmi içinde 15 ug / kg bir doz elde etmek için, susam yağı, toplam gerekli hacme 3.000 ug estradiyol / 1 ml susam yağı stok çözeltisi hesaplanmış hacim ekleyin.
NOT: Alternatif olarak, östrojen tha diğer formları kullanmak t, suda çözünür ve çözünmesi için daha kolaydır.
6. Gün 2: Estradiol Yönetimi / Extinction Eğitimi
- Östradiol subkutan yönetme. Nazik bir tutam boynundan skapula arasında gevşek cilt kaldırın ve deri kıvrım oluşturduğu üçgenin içine şırınga iğnesi takın.
- Östradiol deri altı enjeksiyonu takiben 30 dakika, yine klima odalarında hayvanları yerleştirin ve söndürme eğitimi başlar. Bu yok oluş oturumunda, 3 dakika ortalama değişken intertrial aralıklarla sunulan 30 sn, 4 kHz, 80 dB sesi oluşan her deneme, ile, 20 CS-alone denemeler yapmak.
Not: östradiol önce söndürme eğitim veya hemen sönmesinden sonra tatbik edildiği zaman, geri çağırma estradiolün etkisi ortaya çıkar. etkisi 4 saat sonrası nesli görülmez, bu yüzden eğitim oturumu 15 başına veya sonuna zaman yakın enjekte tavsiye edilir.
- Tükenme eğitimden sonra 24 saat, Gün 1 ve bu protokolün 2 tamamlamış hayvanlar çubukla.
- (Gün 1 ve 2 ile aynı) kendi atanan klima odalarına hayvanları yerleştirin. Adım 6.2 anlatıldığı gibi yok olma eğitimi için uygulanan 20 çalışmaların benzer intertrial aralıklarla sadece 3.80 dB CS-alone çalışmaların oluşur 3 CS-alone denemeler (tükenme hatırlama üç deneme), sunarak nesli geri çağırma seansı başlayın.
- Geri çağırma seansının tamamlanmasının ardından, evlerinde kafeslerde hayvanların dönün.
8. Veri Analizi
- Video aracılığıyla davranışsal veri elde ve bilgisayar yazılımı kullanarak bunları analiz.
NOT: zaman yüzdesi sesi sırasında donma harcanan Donma puanları da elle her deneme CS sunumu sırasında donma nöbetleri zamanlama ilaç tedavisine kör bir deneyci tarafından sayılabilir, dile getirdi. Donma olduğunu30 sn CS-ABD çalışmalar sırasında nefes dışında hareket eksikliği tamamlamak tarafından tanımlanan. 100 ile çarpılır 30 saniye (deneme süresi) tarafından (taşınmazı,) dondurma harcanan saniye bölerek yüzde donmasını hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu korku söndürme hatırlama protokolde, yüzde donma korku göstergesi olarak ölçüldü. Iyi söndürdü ve söndürme eğitimi bellek muhafaza Hayvanlar tükenme hatırlama sırasında davranışsal test son gününde düşük korku sergiledi. Erkek ve dişi sıçanlar anlamlı klima, nesli sırasında şartlandırılmış korku ifadesi farklı, ve aşamaları (Şekil 2) hatırlamıyorum. Hayvanlar yüksek ve düşük östrojen östrus faz grupları olarak ayrı ayrı incelendiğinde Ancak, bir seks farkı belirginleşir. Östrus döngüsünün düşük östrojen ostrus aşamasında söndürme eğitimden dişi sıçan günde 3 de Proestrus eğitimli olanlar gibi (Şekil 3) üzerinde tükenme bellek hatırlamıyorum. Bu ostrus kadın da erkeklere göre tükenme hatırlama (kötü söndürme bellek) sırasında önemli ölçüde daha fazla korku kurtarma gösterirler. Bununla birlikte, ostrus kadın deri altından injec zaman vardırTed söndürme öğrenme önce estradiol 15 ug / kg'lık bir doz ile, korku söndürme bellek birleştirme söndürme hatırlama (Şekil 4) boyunca, düşük donma ile gösterildiği gibi daha geliştirilmiş görünmektedir. Bu nedenle, bu veriler gonadal hormonlar korku söndürme hatırlama modüle ve aynı zamanda koşullandırılmış korku nesli davranışları cinsiyet farklılıkları aracılık olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: çevrimi aşamalarında hücre tiplerinin Temsilcisi görüntüleri (büyütme 20X) Proestrus yuvarlak, mor lekeli çekirdekli epitel hücrelerinin kitleler ile karakterizedir.. Östrus mavi boyalı, skuamöz kornifıye hücre agregatları ile tespit edilebilir. Ostrus ve diöstrüste hücre tipleri (lökositler, çekirdekli ve Boynuzsu hücreler) bir kombinasyonu ifade ama daha az hücreleri göstermektedir. Östrojen seviyeleri östrus aşamalarında dalgalanma, Proestrus sırasında zirve. (Met = ostrus;.. Diest = diöstrüste;. Proest = proestrus). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Deney üç aşamadan boyunca erkekler ve kadınlar arasında karşılaştırma alışkanlık (. Hab) gözlenen anlamlı cinsiyet farklılıkları vardır, klima (. Cond), sönme veya deney 15 aşamalarını hatırlar.
Şekil 3: Proestrus arasındaki farklar Davranış (yüksek östrojen) ve ostrus (düşük östrojen) kadın, yüksek östrojen proestrus faz o dişilerin.Düşük östrojen ostrus oranla daha çevrimi sergi daha az korku f. Bu veriler doğal olarak bisiklet kadınlarda östrojen düzeyleri sonra 15 Geri Çağırma 24 saat modüle, korku söndürme bellek konsolidasyonu etkileyebilir öneririz.
Şekil 4: ostrus kadınlarda östrojen tedavisi. Tükenme eğitimi (ok) önce östradiol 30 dakika İdaresi araca 16 oranla tükenme hatırlama kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korku söndürme çeşitli manipülasyonlar kapsamında tanımlanan ve değerlendirilen koşullandırılmış korku nesli aracılık nöral mekanizmalarla erkek sıçanlarda yoğun çalışılmıştır. Nispeten az sayıda çalışma dişi sıçanlar veya korku yok gonadal hormonların rolünü inceledik. Özellikle korku yok östrojenin etkilerini incelemek için, doğal olarak bisiklet dişi sıçanlar üç günlük davranış paradigmaya tabi tutulmaktadır. Bu prosedür alışma / Klima, tükenme ve yok oluş hatırlama aşamadan oluşur. Bu protokolü kullanarak, bu dişi sıçanlar, yüksek östrojen Proestrus 15 söndürülür kadınlara oranla düşük östrojen ostrus faz sergi yüksek donma (veya bozulmuş tükenme hatırlama) sırasında nesli ile eğitimli olduğu gösterilmiştir. Ostrus aşamasında söndürme eğitimi öncesinde estradiol İdaresi söndürme belleğine 16 konsolidasyonu modüle. Bu freezin bir azalma ile ortaya konmuşturtükenme hatırlama sırasında gr. Birlikte, bu sonuçlar yumurtalık hormonlarının etkisi ve davranışları üzerine östrus döngüsü dikkat kadın çalışmaları yürüten önemini vurgulamak. Kontrol deneyleri burada tarif olmasına rağmen, hiçbir söndürme grupları, yani daha nesli bellek konsolidasyon süreçleri üzerindeki östrojen etkisini değerlendirmek için, uygun kontroller için gerekli olacaktır.
Bu protokolün amacı iki yönlüdür: 1) sağlam hayvanlarda östrus döngüsünün belirli aşamalarında klimalı korku yok östrojenin etkilerini araştırmak için, ve 2) normalde düşük östrojen devlet olabilir var nasıl akut östradiol değiştirme kadın sırasında incelemek için onun davranışını modüle. Burada tarif edilen vajinal swab yöntem aracılığıyla, östrus döngüsü dört aşaması tanımlanabilir: kızgınlık, ostrus, diöstrüste ve proestrus. Bu bize ne zaman yumurtalık hormonları su davranışını değerlendirmek için izin veriröstrojen gibi ch, düşük ve yüksek konsantrasyonlarda doğal olarak. Örneğin, östrojen düzeyleri östrus (20-40 ug / ml), ostrus (15-20 ug / ml) içinde düşüktür ve diöstrüste (25-40 ug / ml) aşamaları, ancak Proestrus sırasında yüksek (~ 75 pg / östrus döngüsü 27,28 ml) aşaması. Bu aşamalar, sadece hormonal durum farklı değil, aynı zamanda süresi değil. Değişken olmasına rağmen, proestrus genellikle 12 saat 14 için son görülmüştür; 25 27 saat kadar östrus; 6 8 saat için ostrus; ve 55-57 saat boyunca diöstrüste. Her dönemin süresi diöstrüste veya östrus ya 2 gün dahil 5 günlük döngü yol açan, bir günde (hayvan bağlı olarak) daha uzun ya da daha kısa olabilir. Belirtildiği gibi, proestrus ve ostrus kısa fazlar (sırasıyla 12-14 ve 6-8 saat) ve atlanabilir. Bu protokolde, bu yok oluş eğitimi hatırlamak yeteneği arası faz farklılıklarını incelemek için hayvanın doğal bisiklet hormonları kullanırken dikkatli östrus döngüsü izlemek nedenle kritikönceki gün. dişi sıçanlarda çevrimi, çok insan adet döngüsü gibi, aynı zamanda vb yaş, stres, günün saatine, barınma koşulları, sıcaklık, gibi çeşitli dış faktörler, duyarlı ve deneyler planlarken dikkate alınmalıdır. Bir hayvan boron (genişletilmiş kızgınlık / diöstrüste) olmak ya da daha önce veya çalışma esnasında düzensiz döngüsü (daha kısa 4 gün ya da daha uzun 5 gün) görüntüleyebilir. Bu durumda, bu hayvanların estrojen döngüsü belirli aşamaları sırasında test titiz olup, deneysel analiz dışında olacaktır. Unutulmaması gereken önemli örnekler biraz zor açıkça her aşamasını karakterize özel hücre tiplerini belirlemek için yapım, mukus ile karışık sırasında geçiş aşamaları vardır. Bu da sürüntü alınır günün saatine bağlı olabilir. Çeşitli kullanım günü sürme geçmek için izin günlük svapları sonucu yayma toplama sırasında mukus gibi akıntı aşırı miktarda varsaBu sorunu çözebilirsiniz.
Burada tarif edilen estrojen faz tanımlama yöntemine ek olarak, diğer yöntem araçları, serum Ovarian hormon dolaşan konsantrasyonlar önlem elde etmek için kullanılabilir. Örneğin, östrojen konsantrasyonunun bir enzim-bağlı imüno-tahlili (ELISA) kullanılarak kan örneklerinde belirlenebilir. Bu prosedür, numuneler, bir enzime bağlanmış olan bir belirli bir anti-estrojen antikoruna bağlanan serum / plazma içindeki östrojen. enzimin alt-tabaka gibi bir spektrofotometre kullanılarak ölçülebilen bir renk değişikliği gibi görünür bir sinyal ile sonuçlanan bir reaksiyon verir. Bu araç, absorbans hesaplar ve numune içinde östrojen seviyelerinin ölçümü sağlar. Bu yöntem, deney sırasında belirli zamanlarda, daha da önemlisi doğal değerlendiren östrus döngüsü boyunca östradiol düzeyleri dalgalanan ve yararlı olabilir. Ayrıca, norm değiştirebilir östrojen kadar dışsal verilmesini belirlemek için kullanılabilirarkadaşları fizyolojik konsantrasyonları. Smear sonucu örneklerde mukus okumak zor olduğunda kandan östrojen konsantrasyonlarının ölçümü geçiş aşamalarında faz tanımlama zorlukları önlemek, ya da. Ne yazık ki, bu yöntem oldukça masraflı olabilir ve teklifler vajinal smear toplama oranla sonuçları gecikmeli.
Prosedürler, yeterli kan örnekleri elde etmek için, örneğin., Kuyruk ven, orbital sinüs, kuyruklarından ve safen ven 29 üzerinden hayvana gereksiz strese neden olabilir. Bu yanlış veya çarpıtılmış ölçümlere açan, deneyde kritik zamanlarda hormon seviyelerini etkileyebilir. Östradiol seviyelerini ölçmek için gövde kan kullanma terminali ve bu nedenle aşamalarında içinde hormonal dalgalanmalar hakkında çok sınırlı bilgi sağlar. Vajinal hücre sitoloji değerlendirilmesi daha iyi bir alternatif sunmak için görünür. Bu yöntem yalnızca östrus aşamalarında yumurtalık hormon profilleri kaba bir tahmin sağlayabilir rağmen, canstresi en aza indirmek ve daha sonra daha az yıkıcı davranış deney etmektir.
Bu tür estriol, estradiol ve estron doğal olarak, insan ve insan-olmayan hayvanlarda dolaşan estrojenik steroidler farklı şekilleri vardır. Bu protokol, östradiol akut deri altı enjeksiyonu vasıtasıyla tatbik edilir. Bu, doğal olarak, gebe olmayan kadınlarda 30 östrojen oluşan en güçlü bir şekilde olduğu (E2, 17beta-östradiol veya beta-estradiol ile eş anlamlı), Östradiol, bu protokol kullanılır. Estradiol akut enjeksiyonu aksine, diğer laboratuar kronik östrojen tatbikat yöntemlerini kullanmışlardır. Örneğin, yavaş salimli peletler veya silastik kapsüller deri altından implant östrojen veya araç solüsyonu 19 sürekli, sürekli sevkedilmesi için izin verir. Bu prosedür tipik olarak, hayvanın doğal üreme durumunu ortadan kaldırmak ovariectomies ile bağlantılı olarak kullanılır.
manipuBurada tartışılan saplamalar laboratuvar bulgularının klinik uygulanmasını kolaylaştırmak için doğal hormonal devletler odaklanmak. Post-travmatik stres bozukluğu (TSSB) olan kişiler genellikle bunların travmatik bir deneyim ile ilgili bir uyaranın korku söndürmek ve bu nesli hatırlamak yeteneği bozulmaktadır. Bu durum genellikle olay geçti süre sonra devam. Uzun süreli maruz kalma terapisi gibi burada anlatılan biri olarak kemirgen modellerinde okudu nesli-tabanlı süreçlere dayanır TSSB için ortak bir tedavi seçeneğidir. İlginçtir, kadınlar erkeklerin stres ve anksiyete ile ilgili psikiyatrik bozukluklar 31 geliştirmek için kabaca iki kat muhtemeldir. Prevalans Bu seks farkı korku nesli süreçlerinde cinsiyet farklılıkları bağlantılı ve bu laboratuvar bulgularının potansiyel klinik önemini altında yatan olabilir. Kadınlarda TSSB yaygınlığı yüksek olmasına rağmen, nispeten az sayıda kemirgenlerde yok olma çalışmaları kadınlarda yapılmıştır korkuyorum. Kadın çalışmalar odakdavranış cinsiyet farklılıkları incelerken gonadal hormonların rolü ing ardı edilmemelidir. Doğal östrus döngüsü boyunca hormon düzeyleri dalgalanan davranışsal etkilerini Karakterizasyonu erkek ve kadın arasındaki davranış farklılıkları temel değerli bilgiler sağlar. Bu protokol, korku yok gibi bilişsel ve davranışsal süreçler, sınırlı gelecek yumurtalık hormonlarının çalışmaları ve üzerindeki etkisini değil, kolaylaştırmak için temel bir model sunar. Bu protokol, spesifik bir gonad hormon odaklanır, östrojen, bununla birlikte, progesteron ve testosteron ve diğer hormon etkileri de değerlendirilebilir. Diğer, farmakolojik hücresel ve moleküler tekniklerle birlikte burada sunulan davranış paradigma kullanarak (yani, lokalize ilaç infüzyon, immünohistokimya, Western blot), gelecekteki araştırmalar davranışçı terapi arttırsınlar beynin içindeki östrojen eylem belirli siteleri / hedefleri tespit edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yazının yazarları ifşa hiçbir rakip mali çıkarlarını veya diğer ilgi çatışmaları var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
