Limb distance ischémique préconditionnement: Une technique neuroprotecteur chez les rongeurs

Summary

Préconditionnement ischémique à distance (RIP) est une méthode de tissus de conditionnement contre le stress dommageable. Nous avons établi une méthode d'ischémie à distance à la patte postérieure, en gonflant un brassard de tensiomètre pendant 5-10 min. Les capacités neuroprotecteurs de RIP a été démontré dans un modèle de dégénérescence rétinienne chez les rongeurs.

Abstract

Ischémie sublétale protège les tissus contre l'ischémie ultérieure, plus sévère par la régulation positive des mécanismes endogènes dans le tissu affecté. Ischémie sublétale a également été montré pour réguler à la hausse dans les tissus des mécanismes de protection distants. Une brève période d'ischémie (5-10 min) dans la patte arrière des mammifères induit des réponses d'auto-protection dans le cerveau, les poumons, le cœur et la rétine. L'effet est connu sous le préconditionnement ischémique à distance (RIP). Il est un moyen thérapeutique prometteuse de protéger les organes vitaux, et est déjà en essais cliniques pour lésions cardiaques et cérébrales. Cette publication démontre, une méthode minimalement invasive contrôlée de faire une branche - spécifiquement la patte postérieure d'un rat - ischémique. Un brassard de pression artérielle conçu pour être utilisé dans les nouveaux-nés humains est connecté à un sphygmomanomètre manuel et utilisé pour appliquer une pression de 160 mmHg autour de la partie supérieure de la patte postérieure. Une sonde conçue pour détecter la température de la peau est utilisée pour vérifier la ischemia, par enregistrement de la baisse de la température de la peau causée par l'occlusion des artères de la jambe induite par la pression et l'élévation de température qui en résulte la libération de la manchette. Cette méthode de RIP offre une protection à la rétine de rat contre les dommages et la dégénérescence induite par la lumière brillante.

Introduction

La survie de la plupart, sinon tous, les tissus de la face de stress métabolique peut être améliorée par un conditionnement préalable avec une période d'ischémie sublétale ^1,2. Préconditionnement ischémique (IP) en termes pratiques est l'exposition des tissus à l'ischémie sublétale, avant les expériences de tissus facteurs de stress les plus graves, comme un accident ischémique ultérieure. Dans les modèles animaux, IP assure la protection frappant vers le cerveau, la rétine, du cœur et des poumons ^3-6. En conséquence, les observations chez les patients victimes d'AVC ont montré un lien entre les attaques ischémiques transitoires précédents et de meilleurs résultats cliniques ^7,8. IP protège également les photorécepteurs rétiniens de blessures non ischémiques ^9.

L'efficacité de la propriété intellectuelle dans divers tissus et de blessures suggère qu'il est l'activation d'un mécanisme inné de la survie des cellules présentes dans tous les tissus. Préconditionnement ischémique du myocarde a été proposé d'avoir des effets protecteurs à travers la régulation à la haussede l'hypoxie inducible factor (HIF), connu pour réguler de nombreuses voies métaboliques par la libération d'adénosine ou à travers l'ouverture de canaux potassiques mitochondriales ATP ^10,11. La libération d'adénosine et de l'ATP potassium canaux sont impliqués dans l'ischémie cérébrale, mais, les enquêtes sur les mécanismes neuroprotecteurs de conditionnement ischémique à ce jour ont porté sur des modifications aux anti-excitotoxicité, les voies anti-apoptotiques et anti-inflammatoires ^12,13. Dans l'ensemble, la compréhension du processus moléculaire de conditionnement ischémique pour la protection des neurones est limité.

Distant tente de préconditionnement ischémique pour conditionner des organes éloignés importance critique (coeur, cerveau, du poumon) en générant une ischémie dans les tissus moins critiques. Préconditionnement ischémique à distance (RIP) en utilisant la patte arrière a été démontré pour être neuroprotecteur dans des modèles rongeurs d'AVC ^14-17. La méthode décrite par nous fournit une prot simple, fiable et non-invasiveocol pour induire RIP.

La grande majorité des protocoles RIP implique la patte postérieure, sans doute parce que l'artère fémorale situé dans la patte arrière supérieure peut être facilement identifiable et accessible pour le serrage chirurgicale et l'application garrot. Dans les membres ischémiques invasive études pour l'étude du cerveau et de la protection de la peau, de l'ischémie est induite par la séparation de l'artère fémorale à partir des ligaments de l'aine et de serrage de l'artère fémorale ^2,15,18.

L'ischémie résultant soit menottage de membre ou de l'artère fémorale serrage a été confirmée par des changements à la branche, y compris une perte de pouls, diminution de l'oxygénation et une baisse de la température de la peau. Ischémie à distance peut être confirmée par la perte de l'impulsion à l'aide de Doppler au laser ou ultrasons Doppler ^17-19. la température de la peau peut être utilisé comme alternative à Doppler bien que la relation est non linéaire ^20,21. Enregistrements précis de la température sont monnaie courante dans les laboratoires et peutêtre facilement intégré dans les études ischémiques distants.

Une alternative à la chirurgie de serrage fémorale est l'induction de l'ischémie en utilisant un tourniquet. Demande Tourniquet produit ischémie comparable à celle obtenue avec un vase serrage; Kutchner et al. rapport artère fémorale invasive de serrage à un garrot non-invasive et a trouvé deux méthodes arrêtées le flux sanguin vers le membre et réduit les dommages de la peau dans un modèle de chirurgie plastique du lambeau de peau ischémie ^18. Menotter soit la jambe ou le bras et en augmentant la pression du brassard au-dessus de la pression artérielle systolique a été trouvé pour avoir un effet protecteur contre les lésions ischémiques chez les porcs et les humains ^17,19,22.

Différentes approches pour induire tourniquet à distance comprennent ischémique l'utilisation d'un brassard de pression sanguine ou une bande élastique ^17,22,23. Cependant, l'utilisation d'une bande élastique pour induire une ischémie est une méthode dangereuse, pouvant donner lieu à une quantité non régulée de la pression dans lamembre, avec des hausses de pression supérieures à 500 mmHg enregistrée chez l'homme ^24. En outre, l'ischémie des membres inférieurs à l'aide d'une bande élastique conduit à une lésion musculaire chez le rat suite à l'enlèvement de la bande ^23, telle qu'évaluée par colorant bleu d'Evans, un marqueur in vivo de myofibres ²⁵ perméabilité. En revanche, la délivrance d'une pression contrôlée à la tourniquet peut être réalisé à l'aide d'un brassard de pression sanguine relié à un ^17,19,22,26 de sphygmomanomètre.

Dans cette étude, un modèle de blessure de la lumière dégénérescence des photorécepteurs a été utilisé pour démontrer l'efficacité neuroprotectrice de préconditionnement ischémique distant. L'ischémie a été induite à distance immédiatement avant qu'une blessure légère, et a empêché la dégénérescence des photorécepteurs ultérieure comme l'a confirmé par des tests de la fonction rétinienne. La vidéo qui accompagne va démontrer l'application de l'ischémie à distance non-invasive.

Protocol

Déclaration éthique: Le protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université de Sydney, AEC # 5657. L'anesthésie a été approuvé par le comité de l'éthique animale (Université de Sydney, AEC # 5657).

1. Préparation Equipement

1. Utilisez suivi en temps réel de la température de la peau. Allumez l'ordinateur et le matériel d'acquisition de données.
2. Logiciel d'enregistrement de température ouvert et ajuster le réglage de température entre 30-35 ° C et la fréquence d'échantillonnage de 100 ms.
3. Facultatif: Insérez thermomètre rectal pour assurer une température centrale reste stable à 37,5 ° C.

2. L'étalonnage du tensiomètre manuel

1. Connectez néonatale brassard à sphygmomanometer.Use un brassard de taille 2 pour un 250-550 g rat. Un adaptateur peut être nécessaire de connecter le tuyau de brassard au tensiomètre.
2. Dégonfler le brassard soit par desserrer la vanne de purge d'air ou de débrancher le tuyau du brassard de l'adapterou. Assurer l'absence de pression reste dans le tube et l'aiguille de manomètre repose à zéro à l'intérieur de l'ovale / rectangle.
3. Vérifiez la pression de la tubulure, manomètre et le brassard. Gonfler le brassard avec pompes douces de la poire de gonflage jusqu'à ce qu'il lit 100 mmHg sur le manomètre. Vérifiez que la pression reste constante. Dégonfler le brassard en ouvrant lentement la valeur de libération de l'air.

3. Préparation des animaux

Remarque: Les animaux qui doivent subir une blessure légère exiger adaptation à l'obscurité de la nuit avant l'ischémie distance. Animaux subissant des dégâts de lumière nécessitent sombre élevage (12 heures de lumière: cycle d'obscurité (5 lux))

1. Effectuer une ischémie à distance soit en rongeurs éveillés ou anesthésiés. Veiller à ce que les animaux ont une tonalité de muscle sain. Assurer en pinçant l'arrière du membre supérieur pour confirmer qu'il est adéquat musculaire présente. RIP protection induite par la lumière contre les blessures a été testé chez des rats sédentaires jusqu'à 6 mois d'âge.
2. Préparation anesthésié RIP
   1. Injecter les rats avec une injection intraperitoneale de 60 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine. Vérifier la profondeur de l'anesthésie par l'extension de la jambe et du pincement de la peau sur la face inférieure du pied. L'animal n'a pas de réflexe si elle est profondément anesthésié. Appliquer des larmes artificielles pour éviter la sécheresse de la cornée tout sous anesthésie.
   2. Placez rats soit sur un pad thermique ou circulant tube de chauffe-eau pour maintenir une température corporelle constante de 37,5 ° C. Placez le rat dans la position couchée avec les coussinets plantaires des membres inférieurs vers le haut. Droite ou la branche gauche peuvent subir une ischémie distance.
3. Awake préparation pour RIP
   Remarque: Awake expérimentation animale nécessite deux personnes. Une personne retient l'animal et la deuxième personne actionne le sphygmomanomètre manuel. Les expérimentateurs doivent être confiants pour effectuer la procédure de retenue augmente le risque de blessures pour le personnel. Les rats soumis à une ischémie à distance doivent être conditionnés to retenue manuel. Selon les lignes directrices intuitionnels retenue manuel devrait être les progrès de 30 secondes pour un maximum de 5 min sur un certain nombre de semaines. Animaux timides qui ne parviennent pas à acclimater à la retenue d'emploi devraient être exclus de l'expérimentation éveillé. Enfin, la retenue d'emploi est susceptible de causer un stress (et potentiellement introduire des facteurs de confusion à l'étude) pour les animaux et une cohorte fictive (placement du brassard sans inflammation) doit être utilisé pour interpréter correctement les résultats de l'étude de RIP.
   1. Couper une serviette dans un 15 cm x 30-50 cm pièce et placez le bord court perpendiculaire à la colonne vertébrale du rat, couvrant la tête vers le haut des pattes postérieures.
   2. Rentrez le bord court dans le torse du rat hermétiquement et commencer à envelopper le rat avec le bord à long restante de serviette. Fixez l'animal enveloppé sous le bras en position couchée. Si le rat est maintenu sous le bras gauche, libérer branche droite du rat de la serviette.

4. Application of température de la peau Probe

1. Elargir la jambe du rat qui doit subir une ischémie et placer la sonde de la peau sur le coussinet plantaire. Placez la sonde de la peau pour maximiser le contact entre la sonde de température et la peau. Poussez fermement la sonde dans le coussinet plantaire et apposer la sonde avec du ruban de papier.
2. Vérifiez la position de la sonde de la peau par le suivi de la température sur le logiciel d'enregistrement de la température. Assurez-vous que la température de la peau est entre 30-34 ° C et reste stable. Suivre la température de la peau pendant 1-2 min. Réglez la sonde de la peau si la température est instable ou inférieur à 30 ° C.

5. ischémie à distance

1. Dégonfler le brassard et d'assurer la soupape de pression d'air est fermée. Étendre la jambe et vaguement encercler le brassard sur la biche membre supérieur. Utilisez le pouce et l'index d'étendre la jambe et les chiffres inférieurs à garder le brassard desserré en position.
2. Augmenter la pression brassard de l'animal anesthésié à 160 mmHg, et chez les animaux éveillés Increase la pression du brassard à 180 mmHg.
   Remarque: La pression sanguine des rats anesthésiés varie de 120 à 140 mmHg et monte à 160 mmHg quand conscient. Commencer les enregistrements programmés et la température de pied une fois que la pression correcte est atteinte.
   Remarque: La température de pied doit chuter de 2 ° C après 5 min de la pression constante.
3. Maintenir la position de la manchette au-dessus "du genou" de l'animal tout au long de l'ischémie. La pression du brassard va commencer à baisser après quelques minutes, ou si le membre du rat est en mouvement.
4. Pomper plusieurs fois sur la poire de gonflage dans des éclats courts de maintenir la pression du brassard souhaitée répétitif courte rafale de pompage
5. Ischémie à distance peut être délivré en continu entre 5 et 15 min. Le protocole de reperfusion d'ischémie comprend deux périodes de 5 minutes d'ischémie avec un intervalle de 5 min de reperfusion.
6. Dégonfler la pression du manchon en dévissant la soupape de pression d'air. Vérifiez le changement de température au cours de la pro de l'ischémieProtocole. Relâchez le brassard.
7. Continuer avec les blessures expérimentation. Animaux sous l'effet de l'anesthésie devront être posés sur un socle de chaleur. Continuer à surveiller les animaux jusqu'à ambulatoire. Les animaux ne peuvent être retournés à un logement jusqu'à ce que la marche.

6. Lumière blessures - dégénérescence rétinienne Modèle

1. Sombre adapter les animaux pendant la nuit (12-15 h). Immédiatement après l'ischémie conditionné à distance ou d'ischémie distance simulacre (de retenue d'animal) place des animaux dans le logement en plexiglas avec de la nourriture et de l'eau.
2. Allumez l'éclairage fluorescent (1,000 lux) situé au-dessus logements plexiglas à 9 h pour 24 h. Après exposition à la lumière, renvoyer les animaux à un faible éclairage cyclique pendant 7 jours.

Procédures d'ischémie 7. Post-distance

1. évaluation de la Vision avec Électrorétinogramme (ERG):
   Note: L'ERG set-up et le protocole flash suivies Brandli et Stone ^26.
   1. Sombre adapter animaux pendant la nuit (12-15 h). Sousdim éclairage rouge anesthésier les animaux par injection intraperitoneale de kétamine et de xylazine (60 mg / kg et 5 mg / kg, respectivement). Mydriatique (sulfate d'atropine 1,0%), anesthésie de la cornée (proximétacaïne 0,5%).
   2. Appliquer l'hydratation de la cornée (Carbomer polymère) collyre immédiatement à la cornée. Appliquer le gel de l'oeil à des intervalles de 20 min pour maintenir l'hydratation de la cornée.
   3. Dessinez un fil lâche noué autour du globe oculaire pour aider enregistrements ERG stables. Surveiller la température en utilisant une sonde rectale et maintenir la température du corps de l'animal à 37-37,5 ° C.
   4. Positionner la tête à l'intérieur d'une sphère d'intégration Ganzfeld.
      Remarque: Le Ganzfeld est un stimulus lumineux entièrement programmable qui délivre Pentecôte uniformes de LED clignote à l'œil.
   5. Enregistrez l'électrorétinogramme utilisant un 4 mm platine électrode positive sur-mesure touchant légèrement la cornée et d'un diamètre de 2 mm Ag / AgCl de culot inséré dans la bouche. Les deux électrodes de référence à une aiguille en acier inoxydableinséré sous-cutanée dans la croupe.
   6. signaux d'enregistrement avec réglage passe-bande de 0.3-1,000 Hz (-3 dB), avec un taux d'acquisition de 2 kHz (Instruments AD). Après un enregistrement ERG stable est établie sous réserve de l'animal à une adaptation à l'obscurité 10 min avant de commencer les enregistrements.
   7. Suivez le protocole flash comme décrit précédemment par Brandli et Stone ^26.
      1. Programmer la durée du flash (nous avons utilisé clignote 1-2 ms en durée), et mis son intensité à -4,4 à 2,0 log scot cd.sm ^-2. Utilisez flashes lumineux (2,0 log scot de cd.sm ^-2, 1 ms) pour mesurer la fonction rétinienne. Dans cette étude, il est la comparaison entre le contrôle, d'une blessure légère et une blessure légère avec RIP.

8. TUNEL Assay

1. Euthanasier animaux par injection intrapéritonéale d'une surdose de phénobarbital (100 mg / kg). Énucléer les yeux et fixer paraformaldéhyde 4%.
2. Laver les yeux dans PBS avant cyroprotectingles yeux pendant une nuit dans du saccharose 30% (p / v). Incluez les yeux dans du composé OCT et les couper en 20 sections um sagittal l'aide d'un cryostat.
3. Effectuer l'essai TUNEL sur des sections de la rétine avec la coloration DAPI suivant le protocole de Maslim et al. ²⁷
4. Utiliser la microscopie à fluorescence pour TUNEL chiffres de la rétine. Cellules TUNEL ont été enregistrées à partir de la couche nucléaire externe (ONL); la couche la plus externe de la rétine qui contient des noyaux de photorécepteurs. Dans cette étude, les chiffres TUNEL ont été effectuées en trois exemplaires pour chaque oeil, avec 5 les yeux pour chaque groupe de traitement.
5. Utilisez une ANOVA à groupe statistique comparer des moyens de contrôle, d'une blessure légère, et de blessures légères + RIP rats.

Results

Un brassard de pression sanguine élevée au-dessus de 160 mmHg arrête le flux sanguin vers la patte postérieure comme on le voit clairement sur ​​la figure 1B. L'absence de l'oxygénation des tissus a entraîné une réduction de la température du pied de l'animal à un protocole d'ischémie-reperfusion (figure 2). La température de pied (33 ° C) était inférieure à la température d'âme de façon fiable et réduit au cours de l'élévation de la pression du brassard (31 ° C) croissante lorsque la m...

Discussion

Rongeur patte postérieure ischémie a été induite avec succès avec un sphygmomanomètre manuel et le brassard pour fournir une neuroprotection des photorécepteurs de la rétine. Une conclusion compatible avec la protection de conditionnement ischémique induite des photorécepteurs de la blessure légère ^9,28.

Essentiellement, l'ischémie distance provoque la privation brève de l'oxygène aux tissus. Par conséquent, le préconditionnement ischémique à distance a de nombreuses simil...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Série Gold DuraShock Tensiomètre anéroïde manuel	Welch Allyn	DS56	Tensiomètre manuel
Néoné [taille 2] 1 tube, paquet de 10	Welch Allyn	5082-102-1	Brassard de tensiomètre des membres
Adaptateur Luer lock	Welch Allyn	5082-178	Adaptateur pour brassard néonatal
Thermistance pod	AD Instruments	ML 309	température de la peau
Sonde de température cutanée	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, matériel d’acquisition 4 canaux	AD Instruments	PL 35044
Système de couverture homéothermique avec sonde flexible	Harvard Appartus	507222F
Serviette			en option : ischémie à distance éveillée
Isoflo - 100 % Isoflurane (250 ml)	Abbot Animal Health	05260-05	facultatif : anesthésique par inhalation ischémie à distance
Ketamil - kétamine 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		facultatif : anesthésique injectable ischémie à distance
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		facultatif : anesthésique injectable ischémie à distance