Dérivation efficace des cellules d'épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

Résumé

Les cellules d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules souches peuvent être utilisées pour de multiples applications, notamment des thérapies cellulaires pour la dégénérescence rétinienne, la modélisation de maladies et des études de médicaments. Nous présentons ici un protocole simple pour dériver de manière reproductible l’EPR à partir de cellules souches.

Résumé

Aucun remède n’a été découvert pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de perte de vision chez les personnes de plus de 55 ans. La DMLA est une maladie multifactorielle complexe dont l’étiologie est inconnue, bien que l’on pense généralement qu’elle survient en raison de la mort ou d’un dysfonctionnement de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une monocouche de cellules qui sous-tend la rétine et fournit un soutien essentiel aux photorécepteurs. Les stratégies de remplacement des cellules EPR peuvent être très prometteuses pour apporter un soulagement thérapeutique à un large sous-ensemble de patients atteints de DMLA, et des cellules EPR qui ressemblent fortement aux cellules humaines primaires (hRPE) ont été générées dans plusieurs laboratoires indépendants, y compris le nôtre. De plus, les utilisations de l’iPS-RPE ne se limitent pas aux thérapies cellulaires, mais ont également été utilisées pour modéliser les maladies de l’EPR. Ces types d’études peuvent non seulement élucider les bases moléculaires des maladies, mais aussi servir d’outils inestimables pour le développement et l’essai de nouveaux médicaments. Nous présentons ici un protocole optimisé pour la différenciation dirigée de l’EPR à partir de cellules souches. L’ajout de nicotinamide et d’Activin A ou d’IDE-1, une petite molécule qui imite ses effets, à des moments précis, améliore considérablement le rendement des cellules EPR. En utilisant cette technique, nous pouvons dériver un grand nombre d’EPR à faible passage en aussi peu que trois mois.

Introduction

Les différents types de cellules qui occupent la rétine sont organisés dans une architecture fonctionnelle. Les photorécepteurs à l’arrière de la rétine sont responsables de la conversion de la lumière en impulsions électriques par phototransduction. Cependant, la phototransduction ne peut se produire sans les efforts coordonnés d’autres types de cellules voisines, notamment la glie de Mueller et les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Une monocouche de cellules EPR sépare la rétine sensorielle du choriocapillaire, la principale source d’approvisionnement en sang des photorécepteurs, et est idéalement située pour contrôler plusieurs fonctions importantes pour l’homéostasie des photorécepteurs. En fait, l’EPR et les photorécepteurs sont si codépendants qu’ils sont largement considérés comme une seule unité fonctionnelle. (Pour un examen de toutes les diverses fonctions de l’EPR, voir Strauss, 2005¹.) La mort ou le dysfonctionnement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien peut induire la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de perte de vision permanente dans les pays industrialisés^2-4.

DMLA est une maladie multifactorielle de l’EPR, des photorécepteurs et de la vascularisation choroïdienne ; les facteurs de risque sont divers et comprennent des combinaisons d’influences environnementales et génétiques^5,6. Les traitements de la DMLA sont très limités, mais une thérapie potentielle prometteuse est le remplacement des cellules EPR^7,8. Bien que les résultats aient été mitigés, la transplantation de cellules EPR chez les patients atteints de DMLA (et chez d’autres patients atteints de dégénérescence rétinienne) ainsi que dans des modèles de dégénérescence rétinienne chez les rongeurs, a le potentiel de prévenir transitoirement une atrophie significative des photorécepteurs^9-23. (Le modèle animal couramment utilisé pour ces études sont des rats du Royal College of Surgeons (RCS), qui hébergent une mutation du gène MerTK. Cette mutation rend les cellules EPR incapables de phagocytoser les segments externes des photorécepteurs et favorise la dégénérescence rétinienne²⁴.) Bien que les taux de survie rapportés des EPR implantés dans l’espace sous-rétinien des rats et des souris RCS varient considérablement, il est possible qu’ils survivent pendant plusieurs mois ou années^9,10,12,20.

cellules RPE peuvent être obtenues en nombre suffisant pour la transplantation en les dérivant de cellules souches pluripotentes^9-14,25-28. Plusieurs groupes indépendants ont démontré que ces cellules fonctionnent de manière similaire à leurs homologues somatiques, et des études à long terme suggèrent qu’elles sont sûres lors de leur implantation dans des modèles de maladies chez le rat et la souris^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites au lieu de cellules souches embryonnaires peut être avantageuse, car les problèmes éthiques et les défis immunologiques associés à l’EPR allogénique peuvent être évités^33,34. Une autre application passionnante de la technologie iPS est la modélisation des maladies³⁵. La capacité d’interroger un grand nombre de cellules EPR dérivées de patients atteints de maladies EPR pourrait être inestimable pour comprendre leurs bases moléculaires. Ce type d’étude a été réalisé récemment avec un patient atteint de la maladie de Best et pourrait ouvrir la voie à des études similaires sur les maculopathies héréditaires³⁶.

La dérivation de l’EPR à partir de cellules souches est un processus relativement simple et peut être réalisée entièrement dans des conditions exemptes de xéno. La stratégie la plus simple consiste à dériver spontanément des monocouches de cellules EPR, cependant, le rendement peut être considérablement amélioré en utilisant des techniques de différenciation dirigée. Mais ces techniques impliquent l’utilisation de facteurs protéiques exogènes qui peuvent être coûteux et souvent générés par des bactéries ou d’autres sources non humaines^10,12,37. Dans nos études, nous avons suivi un protocole^{établi 10} qui utilise le nicotinamide et l’activine A, un facteur de signalisation qui s’est avéré suffisant pour la spécification de l’EPR³⁸. Ici, nous démontrerons que la petite molécule IDE-1 peut remplacer adéquatement l’activine A, réduisant ainsi les coûts et atténuant les préoccupations associées à l’utilisation de protéines recombinantes³⁹. De plus, nous utilisons un remplacement de sérum sans xéno, et nous cultivons les cellules RPE différenciatrices sur un substrat synthétique sans xéno. Il a été démontré précédemment que les cellules EPR se différencient très efficacement en utilisant cette approche⁴⁰.

Lorsqu’elles sont différenciées en monocouche, nous visualisons des colonies pigmentées contenant des cellules EPR dès cinq semaines¹². Une fois qu’ils atteignent une taille suffisante, ils peuvent être excisés manuellement et transférés dans une autre parabole pour l’expansion. Les cellules EPR sont connues pour se dédifférencier à chaque passage, et l’utilisation de tout ce qui a plus de cinq passages doit être évitée (nous constatons qu’un nombre suffisant de cellules pour la caractérisation et la transplantation dans des modèles animaux peut facilement être généré après deux ou trois passages). Une fois complètement différenciées, nous employons plusieurs techniques pour caractériser les cellules anatomiquement et fonctionnellement afin de nous assurer qu’elles serviront de substituts adéquats pour l’EPR malade. La description de ces techniques, et le protocole d’implantation de l’iPS-RPE dans l’espace sous-rétinien des rongeurs, dépassent le cadre de cet article méthodologique et ont déjà été publiés^12,32,41.

Bien que l’élaboration de protocoles standardisés pour une dérivation efficace de l’iPS-RPE soit clairement importante pour les cliniques, il reste également d’importants travaux précliniques à effectuer sur des modèles animaux. L’immunogénicité des cellules dérivées d’iPS suscite des inquiétudes, et plusieurs techniques d’implantation différentes, y compris l’implantation de cellules sur des substrats artificiels, sont à l’étude^42,43. Pour ces raisons, nous pensons que la publication de protocoles standardisés est bénéfique pour faciliter les études cliniques et précliniques. Surtout si des comparaisons directes seront faites de cellules iPS-RPE dérivées dans différents laboratoires par différents groupes de recherche.

Protocole

1. différenciation dirigée des cellules souches dérivées RPE

Remarque: Toutes les étapes d'incubation sont effectuées à 37 ° C dans 5% de CO ₂

1. Maintenir les lignes ou les hanches (hES nourrir quotidienne) dans les médias de maintenance (MM; Tableau 1). Une fois que les lignes ont atteint les normes suffisantes de contrôle de la qualité, les maintenir sur une couche de cellules nourricières de souris embryonnaires (MEF) ensemencé à une densité de 250 000 / puits d'une plaque de six. Cultures sans Xeno-peuvent également être générés suivant le protocole établi par Tucker et al. ^40.
2. Autoriser les colonies de cellules souches pour atteindre la confluence.
3. Mettre aux médias de différenciation avec nicotinamide (DM / NIC; Tableau 1); nourrir tous les jours.
4. Après trois semaines de culture, passer aux médias de différenciation avec nicotinamide et soit activine-A ou IDE-1 (DM / NIC / AA ou DM / NIC / IDE1; Tableau 1) pour améliorer la différenciation des RPE.
5. Après cinq semaines de culture, revenir au DM / NIC. Tétées quotidiennes ne sont plus nécessaires une fois que les indicateurs de pH dans l'arrêt de médias jaunir le jour après le repas.
6. Attendez îlots de cellules pigmentées à comparaître qui sont assez grand pour être coupé et enlevé (voir les figures 2D-F et 3A).

2. Isolating pigmentées îlots

1. Enduire les puits d'une plaque de 24 puits avec une matrice qui imite l'environnement naturel des cellules (est préférable gratuitement xéno-).
   REMARQUE: lames de la cornée et tranchants, pinces à pointe fine sont très utiles pour la cueillette. La totalité de la feuille de cellules différenciées peut se détacher alors que la cueillette. Évitez cela en travaillant avec soin et initialement prélèvement de colonies dans le centre de l'assiette.
2. Remplissez autant de puits de la plaque de 24 puits avec les médias de différenciation (DM; Tableau 1) que nécessaire. Cette décision dépendra du nombre de colonies pigmentéesrecueillis.
3. Dans une hotte de culture cellulaire avec un microscope à dissection, couper manuellement îlots pigmentées. Hacher chaque îlot au bas de la plaque d'origine en utilisant un scalpel dans environ 6/2 pièces et saisir les parties pigmentées avec des pinces coupantes.
4. Transfert 1-2 pièces pigmentées dans chaque 24 puits.
5. Ne pas changer de support pendant 3-5 jours jusqu'à ce que les cellules adhèrent, puis commencer à changer de support trois fois par semaine. (Se ils ne adhèrent pas après cette heure, la probabilité est bon qu'ils ne le sera jamais).
6. Développer cellules pendant 3-4 semaines dans les médias de différenciation (DM; Tableau 1) - Une image d'une culture typique est montré à la figure 3B. Les cellules peuvent toujours pas remplir la totalité de bien, mais attendre plus longtemps ne semble pas aider. Nourrir les cellules trois fois par semaine.
7. Après environ trois semaines, supprimer manuellement des amas de cellules blanches en bouquets si nécessaire avec des pinces coupantes. Ne faites pas cette étape si cela est nécessaire - il est facile d'introduire des contaminants. Il est idéal pourtenter d'obtenir plus purs populations de RPE des colonies pigmentées d'origine à l'étape 1.6.

3. Le repiquage de cellules souches dérivées RPE

1. Détacher les cellules avec 200 ul d'une solution de dissociation cellulaire (de préférence pas trypsine un réactif qui peut être inactivée par dilution est préférable) pour 5-8 minutes à 37 ° C, et l'inactiver par dilution avec du DM. Utiliser une pipette de 200 pi pour laver toutes les cellules et de les remettre en suspension (Si le bien sélectionné ne contient que quelques cellules, envisager la mise en commun des cellules de deux 24-puits).
2. Centrifugeuse (800 g pendant 5 min), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 3 ml de milieu de DM.
3. Re-cellules d'une plaque (ou deux) 24-puits dans une matrice revêtue de 6 puits dans 3 ml de DM par puits (1: 5 expansion).
4. Développer pendant 1-2 semaines jusqu'à ce que les cellules sont ~ 90% de confluence; une image d'une culture pure entièrement différenciée est représenté sur la figure 3C.
5. Détacher les cellules avec 1 ml cellule dsolution issociation pendant environ 5-8 min à 37 ° C, l'inactiver par dilution avec DM, utilisez 1000 pipette ul pour laver toutes les cellules, et les remettre en suspension.
6. Isoler (800 g pendant 5 min), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 18 ml de milieu de DM.
7. Re-cellules de la plaque 6 puits une dans chaque matrice six puits revêtus 6 dans 3 ml de DM par puits (1: 6 expansion) ou revêtue d'un ballon de 75 cm ² (1: 7,5 expansion).
8. Répétez les étapes 3.4 à 3.8 que nécessaire jusqu'à ce que suffisamment de cellules sont obtenues.
   REMARQUE: Essayez de recueillir autant de colonies que possible pour l'expansion plutôt que de planifier pour amplifier les cultures via des passages depuis chaque passage induit RPE dédifférenciation.

Résultats

Les étapes décrites dans ce manuscrit, comme représenté sur la figure 1, peuvent être utilisés pour générer facilement RPE partir de cellules souches tel que présenté antérieurement ^10,12. Après avoir maintenu les lignes iPS pour plusieurs semaines, des colonies pigmentées commencent à apparaître dans les colonies après 5-7 semaines (7 semaines vieilles cultures sont présentées à la figure 2A-C). Ces colonies peuvent continuer à croître pendant des semaines que les cultures s...

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour générer efficacement un grand nombre de cultures iPS-RPE pures. Nous avons montré précédemment en utilisant ce protocole de différenciation dirigée avec activine A que nous pouvons générer iPS-RPE qui ressemblent fortement hRPE basée sur la transcriptomique, protéomique, métabolomique et fonctionnalité, et qu'ils retarder la dégénérescence rétinienne lorsqu'ils sont implantés chez des rats RCS ^12,31,32 . Le processus de génération iPS-RPE prend du temp...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Couteau cornéen  ;	Surgipro	SPOI-070	couteau x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4  ;
Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s, 1X sans Ca ou Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Sérum fœtal de bovin, régulier (inactivé par la chaleur)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 & micro ; g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1  ;
KnockOut Serum Replacement Life	Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM  ;	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Solution d’acides aminés non essentiels 100X  ;	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Activine A  ;	PeproTech	120-14E	10 & micro ; g x 2
Synthemax-T Surface 6 Puits Plaques	Corning	3877	Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol  ;	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1  ;
Système de filtre à vide/bouteille de stockage, 0,1 & micro ; M Pore, 500ml  ;	Étui 431475 Corning		(12) x 1  ;