Dérivation efficace des cellules d'épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

Résumé

Les cellules d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules souches peuvent être utilisées pour de multiples applications, notamment des thérapies cellulaires pour la dégénérescence rétinienne, la modélisation de maladies et des études de médicaments. Nous présentons ici un protocole simple pour dériver de manière reproductible l’EPR à partir de cellules souches.

Résumé

Aucun remède n’a été découvert pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de perte de vision chez les personnes de plus de 55 ans. La DMLA est une maladie multifactorielle complexe dont l’étiologie est inconnue, bien que l’on pense généralement qu’elle survient en raison de la mort ou d’un dysfonctionnement de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une monocouche de cellules qui sous-tend la rétine et fournit un soutien essentiel aux photorécepteurs. Les stratégies de remplacement des cellules EPR peuvent être très prometteuses pour apporter un soulagement thérapeutique à un large sous-ensemble de patients atteints de DMLA, et des cellules EPR qui ressemblent fortement aux cellules humaines primaires (hRPE) ont été générées dans plusieurs laboratoires indépendants, y compris le nôtre. De plus, les utilisations de l’iPS-RPE ne se limitent pas aux thérapies cellulaires, mais ont également été utilisées pour modéliser les maladies de l’EPR. Ces types d’études peuvent non seulement élucider les bases moléculaires des maladies, mais aussi servir d’outils inestimables pour le développement et l’essai de nouveaux médicaments. Nous présentons ici un protocole optimisé pour la différenciation dirigée de l’EPR à partir de cellules souches. L’ajout de nicotinamide et d’Activin A ou d’IDE-1, une petite molécule qui imite ses effets, à des moments précis, améliore considérablement le rendement des cellules EPR. En utilisant cette technique, nous pouvons dériver un grand nombre d’EPR à faible passage en aussi peu que trois mois.

Introduction

Les différents types de cellules qui occupent la rétine sont organisés dans une architecture fonctionnelle. Les photorécepteurs à l’arrière de la rétine sont responsables de la conversion de la lumière en impulsions électriques par phototransduction. Cependant, la phototransduction ne peut se produire sans les efforts coordonnés d’autres types de cellules voisines, notamment la glie de Mueller et les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Une monocouche de cellules EPR sépare la rétine sensorielle du choriocapillaire, la principale source d’approvisionnement en sang des photorécepteurs, et est idéalement située pour contrôler plusieurs fonctions importan....

Protocole

1. différenciation dirigée des cellules souches dérivées RPE

Remarque: Toutes les étapes d'incubation sont effectuées à 37 ° C dans 5% de CO ₂

1. Maintenir les lignes ou les hanches (hES nourrir quotidienne) dans les médias de maintenance (MM; Tableau 1). Une fois que les lignes ont atteint les normes suffisantes de contrôle de la qualité, les maintenir sur une couche de cellules nourricières de souris embryonnaires (MEF) ensemencé à une densité de 250 000 / puits d'une plaque de six. Cultures sans Xeno-peuvent également être générés suivant le protocole établi par Tuc....

Résultats

Les étapes décrites dans ce manuscrit, comme représenté sur la figure 1, peuvent être utilisés pour générer facilement RPE partir de cellules souches tel que présenté antérieurement ^10,12. Après avoir maintenu les lignes iPS pour plusieurs semaines, des colonies pigmentées commencent à apparaître dans les colonies après 5-7 semaines (7 semaines vieilles cultures sont présentées à la figure 2A-C). Ces colonies peuvent continuer à croître pendant des semaines que les cultures s.......

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour générer efficacement un grand nombre de cultures iPS-RPE pures. Nous avons montré précédemment en utilisant ce protocole de différenciation dirigée avec activine A que nous pouvons générer iPS-RPE qui ressemblent fortement hRPE basée sur la transcriptomique, protéomique, métabolomique et fonctionnalité, et qu'ils retarder la dégénérescence rétinienne lorsqu'ils sont implantés chez des rats RCS ^12,31,32 . Le processus de génération iPS-RPE prend du temp.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Couteau cornéen  ;	Surgipro	SPOI-070	couteau x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4  ;
Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s, 1X sans Ca ou Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Sérum fœtal de bovin, régulier (inactivé par la chaleur)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 & micro ; g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1  ;
KnockOut Serum Replacement Life	Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM  ;	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Solution d’acides aminés non essentiels 100X  ;	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Activine A  ;	PeproTech	120-14E	10 & micro ; g x 2
Synthemax-T Surface 6 Puits Plaques	Corning	3877	Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol  ;	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1  ;
Système de filtre à vide/bouteille de stockage, 0,1 & micro ; M Pore, 500ml  ;	Étui 431475 Corning		(12) x 1  ;