Nous présentons un protocole pour générer des cultures primaires de cellules stromales œsophagiennes murines et humaines avec un phénotype de myofibroblastes. Les cellules cultivées ont une morphologie en forme de fuseau, expriment l’α-SMA et la vimentine, et manquent de marqueurs de surface épithéliaux, hématopoïétiques et endothéliaux. Les cellules stromales caractérisées peuvent être utilisées dans des études fonctionnelles des interactions épithéliales-stromales.
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Article de méthode
Isolement de myofibroblastes de Mouse et œsophage humain
Dans cet article
Résumé
Résumé
Murins et oesophagiennes humaine myofibroblastes sont générés par digestion enzymatique. Nouveau-né (8-12 jours old) murin œsophage est récolté, hachée, lavée et soumise à une digestion enzymatique avec de la collagénase et de la dispase pendant 25 min. Spécimens de résection de l'œsophage humaines sont dépouillés de la musculeuse et adventice et la muqueuse restante est hachée, et soumis à une digestion enzymatique avec de la collagénase et dispase jusqu'à 6 h. Les cellules cultivées expriment α-SMA et vimentine et desmine expresse faiblement ou pas du tout. Les conditions de culture ne sont pas propices à la croissance des cellules épithéliales, hématopoïétiques ou cellules endothéliales. pureté de la culture est encore confirmée par l'évaluation de cytométrie en flux de l'expression des marqueurs de surface de cellule hématopoïétique de potentiel de contamination et les cellules endothéliales. La technique décrite est simple et conduit à la production de non-cohérente, hematopoieitc cellules stromales non-endothéliales. Les limites de cette technique sont inhérents à l'utilisation decultures primaires dans les études de biologie moléculaire, à savoir, la variabilité inévitable rencontre entre les cultures établies dans différents souris ou les humains. Les cultures primaires sont cependant une réflexion plus représentatif de l'état in vivo par rapport aux lignées cellulaires. Ces procédés fournissent également la capacité des chercheurs à isoler et culture des cellules stromales de différentes conditions cliniques et expérimentales, ce qui permet des comparaisons entre les groupes. Les cellules stromales de l'œsophage caractérisés peuvent également être utilisés dans des études fonctionnelles de l'enquête interactions épithéliales stroma dans les troubles de l'œsophage.
Introduction
interactions épithéliales stromales sont impliqués dans la régulation d'une variété de fonctions du tractus gastro-intestinaux, y compris la régénération des muqueuses, la réparation, la fibrose, et la carcinogenèse 1,2. Ces interactions ont été le mieux étudié dans l'intestin grêle et du côlon et peuvent de même jouer un rôle dans les troubles de la muqueuse de l'œsophage 3. Une sous-population de myofibroblastes et de cellules stromales intestinal du côlon a été démontré appelées à participer à la médiation de la lésion tissulaire, l'inflammation et la réparation de 4,5. Dans le tractus gastro-intestinal distale, ces cellules en forme de fuseau sont situés à côté de la membrane basale à l'interface entre l'épithélium et la lamina propria et sont définis comme α-SMA et vimentine positif, pan-cytokératine négative, et faiblement positive ou desmine négatif 5.
Le stroma de l'œsophage n'a pas été caractérisé rigoureusement au niveau cellulaire ou moléculaire. Notre travail dans l'œsophage murin a démonstrated α-SMA cellules et vimentine dans le stroma de l'œsophage, parfois sous-jacentes à l'épithélium malpighien 6. interactions stroma-épithéliales ont été impliqués dans les troubles de la muqueuse de l'œsophage, tels que gastro-oesophagien blessure médiée 6 et l'oesophagite eosinophile 3. Sténoses fibreuses sont également une complication connue de cellules stromales de blessures et de l'œsophage ont été impliqués dans la pathogenèse de la fibrose gastro-intestinal. Isolement de ces cellules permettra d'effectuer les études nécessaires pour enquêter sur les voies de signalisation dérangés.
Cette présentation fournit les techniques nécessaires pour créer des cultures primaires de α-SMA, myofibroblastes positifs vimentine positifs tels que les lacunes existantes dans les connaissances concernant les voies de signalisation de médiation ces interactions peuvent être abordés. La technique décrite a été utilisée avec succès par les auteurs à établir primaires myofibroblastes coliques murins 7 et further adapté pour l'établissement de murin 6 et cellules humaines stromales oesophagiennes myofibroblastes-like.
Nous décrivons ici les conditions nécessaires pour établir et caractériser ces cultures établies à partir de la souris ou de l'œsophage humaine avant de les utiliser dans des études fonctionnelles futures. Les cultures peuvent être cultivées et utilisées pour un maximum à 15 passages. L'isolement et l'établissement de cultures primaires par les méthodes décrites ci-dessous génère des cellules stromales de phénotype des myofibroblastes; α-SMA, vimentine positif, et faiblement positif ou négatif pour la desmine et cytokératine négative. Ce phénotype est distinct du phénotype de l'œsophage fibroblastes qui est principalement la vimentine positif, négatif α-SMA 3 ou l'α-SMA positif, la vimentine phénotype négatif de la musculaire muqueuse 6.
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Protocole
Le protocole pour effectuer des expérimentations animales, la justification et les objectifs de la recherche, ont été soumis et approuvé par l'Université de Californie du Sud institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.
Le protocole de mise en place de cultures primaires de spécimens dépersonnalisées Oesophagectomie humains a été approuvé par l'Université de l'Institutional Review Board de Californie du Sud.
1. Obtenir la souris ou de l'œsophage humain
- Obtenir souris œsophage:
- Euthanasier l'ancienne souris de 8 à 12 jours avec 2% d'inhalation isoflurane surdosage suivie par dislocation cervicale.
- Epingler l'animal vers le bas avec le ventre vers le haut et mouiller la surface ventrale avec 70% d'éthanol. Avec des pinces, saisir et soulever la partie antérieure de la peau à l'ouverture de l'urètre avec une pince. Utilisez des ciseaux chirurgicaux droites standard pour couper le long de la ligne médiane ventrale de l'ouverture de l'urètre au menton. Soyez prudent de ne couper que la peau.
- Faire une incision vers le bas à partir de l'ouverture du genou des deux côtés de l'animal urétrale, formant une tête en bas "Y". Faire une autre incision des deux côtés de l'animal le long de la cage thoracique.
- Retirer délicatement la peau des deux côtés, au large du péritoine sous-jacent et la cage thoracique, et de jeter sur les côtés. Examiner la cage thoracique recouvrant la cavité thoracique et le péritoine recouvrant la cavité abdominale.
- Soulevez le péritoine avec une pince et couper à travers elle jusqu'à le diaphragme et la cage thoracique, pointant vers le haut des ciseaux pour éviter d'endommager le contenu abdominal. Soulevez doucement le lobe gauche du foie, l'estomac exposer sous-jacente, la jonction de l'œsophage-gastrique et la partie abdominale de l'œsophage.
- Utilisez des ciseaux chirurgicaux autoclave pour couper à travers le sternum et la cage thoracique le long de la ligne médiane jusqu'à la ceinture col de l'utérus. Ciseaux pointer vers le haut pour éviter d'endommager le contenu thoraciques. Entièrement d'exposer le contenu de lacavité thoracique en tirant sur la cage thoracique vers les côtés.
- Retirez délicatement le cœur et les deux lobes des poumons. Absorber l'excès de sang avec Q-tips. L'œsophage thoracique est un étroit tube souple allongée postérieure à la trachée et antérieure à la vertèbre thoracique.
NOTE: L'œsophage peut être difficile d'identifier les nouveau-nés de souris. Localisation de la jonction de l'œsophage-gastrique rend l'identification de l'œsophage simple. - Suivre attentivement l'oesophage de l'estomac, disséquer le système vasculaire, la graisse environnante et mésentère tout le chemin jusqu'à l'origine de l'œsophage dans la cavité du col utérin. Ciseaux chirurgicaux avec pointe émoussée fonctionnent le mieux à cette fin.
- Réséquer la totalité de la longueur de l'œsophage et le placer dans une solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS) pour un traitement ultérieur décrit ci-dessous. Retirer une partie de l'estomac à des fins d'orientation, si désiré.
NOTE: En raison de la petite taille des tissus, la séparation de la musculeuse du musculaireest muqueuse ne est pas réalisable dans murin nouveau-né de l'œsophage et de l'ensemble de l'œsophage est soumise à un traitement décrit ci-dessous.
- Obtenir oesophage humain:
- Laver spécimens de résection de l'œsophage (typiquement 5 cm ou moins) avec du HBSS et retirez tout tissu conjonctif, la graisse, ou le système vasculaire joint.
- Réséquer une partie de l'échantillon et le placer dans le formol pour l'avenir de l'examen histologique, si désiré.
- Séparer les restants de muqueuse musculeuse sous-jacente au bistouri.
- Couper muqueuse en fragments centimétriques sous et sous réserve le protocole décrit ci-dessous.
REMARQUE: résections oesophage humaines peuvent être stockées dans du PBS pendant jusqu'à 6 heures avant le traitement décrit ci-dessous. Source des spécimens de Oesophagectomie dictera la taille de l'échantillon et sera tributaire laboratoire.
2. Isoler murines et humaines de l'oesophage stromales cellules
- Isoler les cellules stromales oesophagiennes from murin et tissus humains par une combinaison de digestion enzymatique et mécanique.
- Digérer mécaniquement par hacher le tissu avec des ciseaux et de multiples lavages avec HBSS. Digérer par voie enzymatique par incubation du tissu avec 300 U / ml de collagénase XI et 0,1 mg / ml de dispase pendant 25 min (tissu murin) ou jusqu'à 6 heures (de tissu humain). Veiller à ce que les instruments utilisés pour hacher ont été autoclave et stérilisé.
REMARQUE: Les collagénases sont des enzymes qui dégradent le collagène, une protéine de la matrice extracellulaire responsables de l'organisation des tissus animaux ensemble. Collagénase XI a une forte activité de collagénase et a connu un succès dans ce protocole d'isolement. Dispase est une enzyme bactérienne à activité protéolytique de dissociation doux qui conserve l'activité de la membrane cellulaire et qui est utilisé en combinaison avec de la collagénase comme enzyme secondaire. - Placez fragments obtenus à partir de la muqueuse souris ou tissus humains dans 1,7 ml de micro-centrifugeuse ou tubes de 5 ml, respectivement, contenant HBSS. Mince tissus plusen 2-3 morceaux mm avec des ciseaux avec une largeur de pointe ouvert qui se intégrera dans des tubes respectifs. Laisser suffisamment de temps pour permettre à des fragments de la muqueuse de l'œsophage dans les sédiments au fond du tube.
- Lentement décanter HBSS, en faisant attention de ne pas jeter par inadvertance le tissu. Remplacer par HBSS frais suivant par agitation douce. Sinon, retirez HBSS avec un pipette de 1 ml.
- Laver les tissus de cette manière un total de huit fois avec agitation douce entre lavages permettant temps pour des fragments de l'œsophage dans les sédiments entre chaque lavage.
REMARQUE: tissus humains, il faudra plus que le tissu hacher nouveau-né de la souris.
- Digérer mécaniquement par hacher le tissu avec des ciseaux et de multiples lavages avec HBSS. Digérer par voie enzymatique par incubation du tissu avec 300 U / ml de collagénase XI et 0,1 mg / ml de dispase pendant 25 min (tissu murin) ou jusqu'à 6 heures (de tissu humain). Veiller à ce que les instruments utilisés pour hacher ont été autoclave et stérilisé.
- Incuber le tissu murin avec 300 U / ml de collagénase XI et 0,1 mg / ml dispase pendant 25 min sur un agitateur à bascule réglé à une vitesse lente à la température ambiante.
- Incuber tissus humains avec 300 U / ml XI collagénase et 0,1 mg / ml dispase jusqu'à 6 h, sur un agitateur à bascule réglé à une vitesse lente à la température ambiante.
NOTE: Disponibilité des œso humainegus est variable. Muqueuse œsophagienne humaine incubée avec des enzymes pour un maximum de 6 résultats des RH dans succès génération de cultures primaires.
- Incuber tissus humains avec 300 U / ml XI collagénase et 0,1 mg / ml dispase jusqu'à 6 h, sur un agitateur à bascule réglé à une vitesse lente à la température ambiante.
- Après digestion enzymatique, plus mince tissu avec des ciseaux et centrifuger à 200 g pendant 10 min.
- Jeter le surnageant. Transférer la pastille, constituée d'une suspension de cellules mélangé dans un tube de 5 ml et laver 5 fois dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 2% de sorbitol pour éliminer les cellules non viables et les débris.
- cellules de semences dans des plaques 6 puits et de la culture dans DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 10 mg / ml d'insuline, 10 pg / ml de transferrine, 10 pg / ml de gentamicine et 2 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF) . On filtre sous vide (0,22 um) tous les composants à l'exception de l'EGF qui peuvent être ajoutés après filtration. Distribuer des cellules obtenues à partir d'échantillons de résection humaines entre plusieurs plaques à 6 puits, en fonction de la taille de la résection.
- Une fois que les puits sont 80% de confluence, passage cellules adhérentes à T25 nous Gourdeing acide trypsine à 0,05% / éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Neutraliser avec les médias et rotation à 400 x g.
- Pour un passage 6 puits à un flacon T25, cellules de passage à un rapport de 1: 1. Confluent flacons T25 peuvent être soumises à des passages à un rapport de 1: 3: 2 ou 1. Pour passage d'un flacon T25 dans un flacon T75, utiliser un rapport de 1: 1. Changer les médias tous les 2-3 jours, quel que soit le navire.
- Cultiver les cellules à 37 ° C dans un humidifié à 5% de CO 2 incubateur et la culture dans les médias de myofibroblastes décrites ci-dessus.
NOTE: Les cellules épithéliales ne survivent pas dans ces conditions de culture ou de passage. Les cellules utilisées pour la caractérisation et les études décrites ci-dessous sont entre 5 et 15 passages. - Cryo-à préserver les cellules dans du N2 liquide par addition de 10% de diméthylsulfoxyde à la presse des myofibroblastes.
3. Caractériser murines et humaines de l'oesophage stromales cellules
- Examiner la morphologie des cellules avec un microscope inversé. Observez la forme de brochemorphologie des cellules adhérentes (figure 1).
- Caractériser les cellules cultivées par évaluation des marqueurs suivants: α cytosquelette-SMA, la vimentine, la desmine, la cytokératine et. Les cellules stromales avec un phénotype des myofibroblastes comme expriment des marqueurs de myofibroblastes cytosquelette α-SMA et vimentine (Figure 2).
- Pour distinguer en outre des cellules du stroma de culture à partir de cellules musculaires, immunocoloration pour la desmine. Pour effectuer immunocoloration sur des cellules en culture, plaque 1,5 x 10 4 cellules dans les diapositives de la chambre 4 puits et croître dans des milieux de myofibroblastes pendant 24 heures. Les cellules stromales avec un phénotype des myofibroblastes comme auront faible ou absent expression de la desmine. Les cellules stromales manquent expression du marqueur épithélial pan-cytokératine (données non présentées).
NOTE: L'évaluation comprend l'évaluation de cultures de marqueurs cytosquelette par immunocytochimie et les marqueurs de surface cellulaire par cytométrie de flux. Immunocytochimie est utilisé comme la principale méthode de caractérisation que l'exprofil de compression de protéines du cytosquelette est unique pour le fibroblastes, myofibroblastes ou cellule musculaire. La cytométrie de flux établit la pureté de la culture en évaluant l'expression de surface cellulaire de cellules épithéliales, endothéliales, les cellules et les marqueurs hématopoïétiques. CD90 est utile en tant que méthode d'appoint de l'identification de cellules stromales humaines telle qu'elle est exprimée sur les deux fibroblastes humains et myofibroblastes. CD90 ne est pas utile dans la caractérisation des cellules stromales de souris comme il a également exprimé par les cellules T murines.
- Pour distinguer en outre des cellules du stroma de culture à partir de cellules musculaires, immunocoloration pour la desmine. Pour effectuer immunocoloration sur des cellules en culture, plaque 1,5 x 10 4 cellules dans les diapositives de la chambre 4 puits et croître dans des milieux de myofibroblastes pendant 24 heures. Les cellules stromales avec un phénotype des myofibroblastes comme auront faible ou absent expression de la desmine. Les cellules stromales manquent expression du marqueur épithélial pan-cytokératine (données non présentées).
- Après que les cellules atteignent 60% de confluence, rincer les lames avec un tampon phosphate salin (PBS) et le fixer avec du méthanol. Incuber les cellules dans du methanol pendant 10 min à -20 ° C, puis stocker dans du PBS à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Suivez protocole d 'immuno standard.
- Brièvement, avant l'application de l'anticorps primaire, de bloquer les cellules fixées avec 5% dans du PBS goatserum. Diluer anticorps primaires et secondaires dans le sérum de chèvre à 5% également.
- Pour la détection des α-SMA et vimentine, utilisez leanticorps et les concentrations suivantes: Souris MAB α-SMA au 1: 250 dilution et Rabbit pAb à vimentine au 1: 500 dilution.
- Incuber avec l'anticorps primaire à température ambiante pendant une nuit à 4 ° C, laver trois fois avec du PBS et ajouter des anticorps secondaires rhodamine chèvre conjugué anti-souris à une dilution de 1: 200 et Cy2 chèvre conjugué anti-lapin à une dilution de 1: 1000 pendant 1 heure à la température ambiante.
- Noyaux Counterstain avec 4 ', 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) à une concentration de 1 ug / ml pendant 1 min, puis laver avec du PBS. Analyser lames avec un microscope inversé.
- Établir la pureté des cultures par l'examen de cellules murines et humaines de l'œsophage pour hématopoïétiques (CD45) et endothéliales (CD31) marqueurs de surface cellulaire par cytométrie de flux (Figure 3). Caractériser en outre des cellules humaines par l'expression de la cellule stromale marqueur de surface CD90.
REMARQUE: CD90 peut pas être utilisé pour identifier les cellules stromales murines que murine T cells expriment aussi CD90.- Détacher culture des cellules de l'oesophage de la souris stromales provenant des flacons de culture par traitement avec cellulaire non enzymatique dissociation solution à 37 ° C pendant 10 minutes, lavées avec du tampon FACS deux fois, comptées et colorées avec du FITC-CD45 et APC-CD31 avec contrôles isotypiques pertinentes, selon de procédures de coloration standard.
- Recueillir cellules en utilisant FACS Calibur et analyser les données avec le logiciel FlowJo. Avant de cellules colorées, optimiser les anticorps et titrer concentrations en utilisant des contrôles d'isotype, la rate normale de la souris, et les cellules de la moelle osseuse.
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Résultats
Cellules stromales oesophage isolées par digestion enzymatique mécanique et sont initialement ensemencées et cultivées dans six plaques à puits. L'examen des cellules avec un microscope inversé à l'intérieur du placage heure démontre une suspension cellulaire mixte faiblement adhérentes au fond de la plaque (figure 1A). Au cours de la 24 heures suivantes, les cellules en forme de fuseau fermement adhérentes au fond de la plaque sont observés prise de vue à partir de la suspension cellulaire mixte
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Discussion
Les techniques pour la production de culture primaire sont généralement similaires lors de l'utilisation du tissu murin ou humain avec hacher et de digestion fois adaptés à la taille de tissu. Notre expérience avec le tissu murin suggère que l'utilisation des méthodes décrites ci-dessus entraîne régulièrement dans l'établissement réussi de cultures primaires. Les étapes critiques au sein du protocole comprennent la stérilisation du matériel chirurgical et en suivant des techniques stériles standard de cultur...
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Déclarations de divulgation
Ce travail est soutenu par le NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell Institute de la Santé et Nutrition Research Scholar Award en physiologie de l'intestin et de la santé (AS) et un prix pilote Fondation Wright (AS).
Remerciements
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs de culture tissulaire | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagénase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsine/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Facteur de croissance épidermique | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Réactifs pour l’immunocoloration Sérum de | |||
| chèvre | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Souris mAB à &alpha ;-SMA ; | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugué Chèvre anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugué à eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugué à APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexine V et 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Souris Bloc Fc pour CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| Tube de 5 ml | Eppendorf | 30108310 | |
| Microscope inversé | Motic | AE31 | |
| Armoire de biosécurité et incubateurs | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| Lames de chambre à 4 puits | Thermo Scientific | 177437 | |
| Centrifugeuse réfrigérée | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Microscope fluorescent | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Nikon | Eclipse TE300 | ||
| Plaques 6 puits | Corning | 3516 | |
| T25 Flacons | TRP | 90026 | |
| T75 Flacons | Corning | 43064 | |
| Ciseaux de dissection Pince | |||
| dissection Pointe | |||
| unique Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Logiciel | |||
| Logiciel Metamorph (Dispositifs moléculaires) | Dispositifs | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience |
Références
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
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- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
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- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
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Réimpressions et autorisations
