Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

Résumé

Les macrophages sont les cellules clés impliquées dans la pathogénicité de l’hôte. Les macrophages présentent une diversité phénotypique et fonctionnelle qui peut être analysée et détectée par analyse protéomique. Cet article décrit comment réaliser l’électrophorèse 2D de cultures primaires de macrophages humains différenciés en phénotype M1 ou M2.

Résumé

L’objectif du protocole d’électrophorèse bidimensionnelle (2D) décrit ici est de montrer comment analyser le phénotype des macrophages humains cultivés. Le rôle clé des macrophages a été démontré dans divers troubles pathologiques tels que les maladies inflammatoires, immunologiques et infectieuses. Dans ce protocole, nous utilisons des cultures primaires de macrophages dérivés de monocytes humains qui peuvent être différenciés en phénotype M1 (pro-inflammatoire) ou M2 (anti-inflammatoire). Ce modèle in vitro est fiable pour l’étude des activités biologiques des macrophages M1 et M2 et aussi pour une approche protéomique. Les techniques protéomiques sont utiles pour comparer le phénotype et le comportement des macrophages M1 et M2 au cours de la pathogénicité de l’hôte. L’électrophorèse sur gel 2D est une technique protéomique puissante permettant de cartographier un grand nombre de protéines ou de polypeptides simultanément. Nous décrivons le protocole d’électrophorèse 2D à l’aide de colorants fluorescents, appelé électrophorèse différentielle sur gel 2D (DIGE). Les protéines des macrophages M1 et M2 sont marquées avec des colorants cyanine avant d’être séparées par focalisation isoélectrique, en fonction de leur point isoélectrique dans la première dimension, et de leur masse moléculaire, dans la seconde dimension. Des taches protéiques ou polypeptidiques séparées sont ensuite utilisées pour détecter les différences dans les niveaux d’expression des protéines ou des polypeptides. Les approches protéomiques décrites ici permettent d’étudier les modifications des protéines des macrophages associées à divers troubles tels que la pathogénicité de l’hôte ou les toxines microbiennes.

Introduction

Les macrophages sont des cellules hétérogènes et plastiques qui sont capables d'acquérir des phénotypes fonctionnels distincts. In vivo, ces cellules répondent à une grande variété de micro signalssuch l'environnement comme les produits microbiens, des cytokines, etc. ^1. In vitro, le phénotype pro-inflammatoire (M1) de macrophages peut être induite par le lipopolysaccharide (LPS) et le phénotype anti-inflammatoire (M2) par des cytokines telles que l'interleukine-4 (IL-4). En outre, les macrophages peuvent passer d'un M1 à M2 phénotype activé, et inversement, sur des signaux spécifiques ^2.

En fonction du phénotype, les macrophages ont différentes fonctions. M1 macrophages sont des cellules qui produisent des cytokines pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), afin de tuer des micro-organismes ou des cellules tumorales ^3. En revanche, les macrophages M2 empêcher ces réponse inflammatoire comme dans la cicatrisation des plaies et de la fibrose en produisant des anti-inflammatorfacteurs y tels que TGF-β ^3,4.

Des cellules mononucléaires de sang périphérique humain provenant de donneurs sains ont été isolées par gradient de densité Ficoll centrifugation comme décrit précédemment en utilisant ⁵ une technique adaptée de Boyum ^6. Macrophages en culture peuvent être différenciées en M1 ou M2 phénotype après 6 jours de culture primaire ^7.

Analyse de l'expression des protéines ou des changements de protéines entre les deux sous-types de macrophages en vertu de divers stimuli contrôlés, tels que la pathogénicité d'accueil ou les toxines microbiennes, sera utile pour déchiffrer la fonctionnalité du pro- et anti-inflammatoires des macrophages.

Protéomique sont des outils uniques pour la surveillance directe de protéines qui sont spécifiquement en amont ou en réglementés dans les macrophages humains cultivés en vertu de divers stimuli. Les colorants fluorescents ont résolu certaines des limitations de l'électrophorèse sur gel 2D, tels que la faible sensibilité et l'analyse d'image ^{8 <} / Sup>. Les colorants qui réagissent avec les résidus de cysteine ​​ont augmenté la sensibilité de détection par rapport à ceux faisant réagir avec des résidus de lysine ^9. Dans une étude précédente, nous avons démontré l'utilité de l'étiquetage DIGE de saturation pour l'analyse des échantillons rares ¹⁰ par rapport à la coloration à l'argent classique 2D électrophorèse ^11. Cette technologie est utile pour analyser rapidement des modifications de protéines entre les deux sous-types de macrophages ou entre macrophages traités et non traités de la même sous-type.

Les avantages de cette technique sont protéomique avoir accès à l'information de la taille de la protéine et des modifications post-traductionnelles en analysant le gel 2D ^12. Il doit être pris en compte que ce pas est une technique à haut débit, ce qui limite le nombre d'échantillons pouvant être analysés. Le développement de tests à haut débit basés sur la spectrométrie de masse tel que revu récemment ¹³ peut améliorer cette situation.

_content "> Ici, nous présentons comment effectuer l'analyse 2D DIGE de l'extraction de la protéine des macrophages en culture dans les processus de l'électrophorèse, isoélectrofocalisation, et SDS-PAGE ainsi que des informations sur l'utilité des logiciels 2D adéquate.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices de notre comité des institutions d'éthique de la recherche humaine. Buffy coat partir de donneurs humains sains ont été obtenus à partir de la transfusion sanguine Centre régional (Lille, France). Les échantillons obtenus à partir des couches leucocytaires sont déclarés comme une collection Inserm (n ° DC2010-1209).

1. Matériel et de la culture des médias Préparation

1. Diluer 10x tampon phosphate salin (PBS) dans de l'eau distillée stérile pour obtenir 1x PBS.
2. Faire un milieu RPMI 1640 supplémenté avec de la gentamicine (40 ug / ml) et de L-glutamine (2 mM), avec ou sans 10% de sérum humain.

2. Les cultures primaires de macrophages dérivés de monocytes (MDM)

1. Diluer couche leucocytaire (25 ml) avec du PBS 1x. Disposer soigneusement sur un / tube et centrifuger de Leucosep Ficoll à 1600 g pendant 20 minutes, à la température ambiante.
2. Recueillir des monocytes à l'interface dans un nouveau tube. Laver 3 fois avec 10 ml de PBS 1X contenant 0,1% d'acide éthylènediamine tétraacide acétique (EDTA) par centrifugations successives à 1.000 xg, 370 xg et 160 xg pendant 10 min chacun, puis une fois dans 1 x PBS seul à 160 xg pendant 10 min.
3. Remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu RPMI-1640 sans sérum et ensemencer les cellules dans des boîtes de 35 mm à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules par boîte.
4. Après sédimentation pendant 90 minutes dans l'incubateur, jeter le surnageant contenant les cellules non adhérentes. Laver les cellules adhérentes, comprenant des monocytes, 3 fois avec 1 ml de PBS; puis ajouter 1 ml de milieu frais contenant 10% (v / v) de sérum humain à des cellules libres sériques précédemment.
5. Après 6 jours de culture, les macrophages différenciés pour donner alternatifs (M2), ajouter recombinant humain de l'IL-4 (15 ng / ml) et maintenir pendant 6 jours. Ensuite, traiter les macrophages différenciés avec un lipopolysaccharide (100 ng / ml) au jour 12 pendant 4 heures pour obtenir les macrophages M1.

3. Extraction de M1 et M2 des macrophages protéines pour électrophorèse 2D

1. Laver macrophtrois fois à l'âge mM de Tris, pH 7,4, et la ferraille dans un tampon contenant 30 mM Tris pH 8, 4% 25 3 - [(3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), thiourée 2 M et 7 M d'urée.
2. Lyse des cellules en utilisant un mélangeur approprié pour tubes de 1,5 ml à centrifuger pendant 5 min dans la glace et conserver à -20 ° C.
3. Déterminer la concentration de protéine en utilisant un réactif de Bradford commercial. Stocker des aliquotes de 100 ul des protéines à -20 ° C jusqu'à utilisation.

4. isoélectrofocalisation

REMARQUE: Effectuer toutes les procédures d'étiquetage dans l'obscurité.

1. Réduire 5 pg de chaque échantillon (macrophages M1 et M2) ajusté à 9 ul avec du tampon de lyse avec du Tris 2 mM (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) pendant 1 heure à 37 ° C.
2. Ajouter cyanine 3 (Cy3) extrait de M1 et M2 extrait de colorant réactif sulfhydryle à une concentration de 0,8 nM de protéine / ug. Ajouter cyanine 5 (Cy5) pour M1 et M2 extrait à une concentration de 0,8 nM / pg de protéine et incuberpendant 30 min à 37 ° C.
3. Arrêter la réaction avec l'addition d'un volume égal de tampon d'échantillon contenant 7 M d'urée, thiourée 2 M, 4% de CHAPS, 130 mM de dithiothréitol (DTT) et 2% pharmalytes.
4. Mix Cy3 marqué échantillons M1 M2 avec des échantillons Cy5 dans une main et marqué au Cy3 échantillons M2 avec des échantillons M1 Cy5 dans une autre main.
5. Réhydrater un gradient de pH immobilisé (IPG) bande (240 mm, pH 3-10 gradient linéaire) avec 450 ul d'échantillons mixtes marqués dans un tampon contenant 7 M d'urée, 2 M thiourée et 4% de CHAPS sur une focalisation isoélectrique (IEF) système de pile pendant 24 heures sans appliquer de courant.
6. Effectuer concentrer à 300 volts (V) pendant 3 heures, puis à un gradient de 1000 V pendant 6 heures, à un gradient de 8000 V pendant 3 heures et enfin à 8000 V pendant 3 heures.

5. Deuxième Dimension

REMARQUE: Effectuer toutes les procédures d'électrophorèse dans l'obscurité.

1. Incuber les bandes IPG dans un tampon d'équilibration contiennenttion de 0,1 mM de Tris-HCl (pH 8), 6 M d'urée, 2% (p / v) de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 30% (v / v) de glycerol pendant 10 min.
2. Transférer les bandes IPG équilibrée pendant la seconde dimension (électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (PAGE)) sur 12,5% de gels de PAGE et d'assurer l'étanchéité avec l'agarose bas point de fusion.
3. Effectuer l'électrophorèse à 20 ° C en utilisant un système Ettan-Daltsix à une tension constante de 70 V pendant la nuit, suivie par 300 V jusqu'à ce que le front de bleu de bromophénol atteigne le fond du gel.

6. Acquisition d'image et en bioinformatique analyse

1. Des gels d'analyse exprimés entre les deux plaques de verre à faible fluorescence avec un scanner Imager DIGE aux longueurs d'onde d'excitation / émission de 532/580 nm pour Cy3 et Cy5 633/670 nm pour pour donner des images avec une taille de pixel de 100 um.
2. Effectuer l'analyse d'image avec un logiciel commercial comme détaillé précédemment ^12.
3. Calculer et normaliser des volumes au comptant dans chaque image. Attribuer un volume de place normalisée comme un accessoireortion de la valeur totale de chaque spot détecté dans le gel.
4. Analyser les différences de volumes au comptant de protéines pour chaque type de macrophages en comparant la valeur du volume de place normalisée entre les deux groupes (M1 et M2). Considérez la différence entre les volumes au comptant à être importante si le changement est 1,5 fois (p <0,05, à sens unique analyse ANOVA).

Résultats

Pour effectuer l'analyse protéomique différentielle appropriée, le traitement des échantillons à analyser doivent être vérifiées.

Dans l'exemple présenté, la qualité de macrophages de culture de cellules est requis pour les aspects morphologiques et moléculaires comme précédemment publiée ^5. La différenciation des monocytes en macrophages et l'homogénéité de la culture a été suivie par microscopie de phase. La figure 1 a montré un exemple de cultures primaires de ...

Discussion

Le protocole décrit ici en détail une méthode pour analyser l'impact de divers stimuli des deux sous-types de macrophages, M1 (pro-inflammatoire) et M2 (anti-inflammatoire). Des cultures primaires de macrophages M1 et M2 ont été obtenus à partir de la différenciation de monocytes comme précédemment publié ^7.

La procédure de l'électrophorèse sur gel 2D DIGE nécessite des matériaux et d'équipements spécialisés, tels que les cellules IEF pour plaques isoélectrofocalisatio...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-glutamine-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
gentamycine 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
sérum humain	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1 077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
; Plaque à 6 puits PRIMARIA  ;	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Research Organics  ;	3.00E+01
Filtre 0.22 & micro ; m	Millipore	SCGPTORE Cylindre
de 100 ml	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Réactif Bradford	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-réactif	GE Healthcare	25-8009-83
Bande IPG 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protéan Cellule IEF	Bio-Rad	165-4000
Agarose à bas point de fusion	Invitrogen	15517-014
Système Ettan-Daltsix	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Imager scanner	GE Healthcare
Progenesis Samespot	Dynamique
Tubes de 50 ml	tout fournisseur	n/a
Tubes de 15 ml	n	/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
uré ; e	Merk	108484-500
Thiouré ; e	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
FDS	Sigma-Aldrich	L3773
Bleu bromophénol	Sigma-Aldrich	114391
Glycérol	Sigma-Aldrich	G6279
Acrylamide 40 %	Bio-Rad	161-0148
Nettoyage 2D GE	Healthcare	80-6454-51
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Dimé ; thylformamide	Sigma-Aldrich	22705-6
mèches d’électrodes	Bio-Rad	165-4071

non linéaire