Article de méthode

Méthode d'évaluation des effets d'une gamme de longueurs d'onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif In Vitro

DOI :

10.3791/52221

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21 mars 2015

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1Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Animal Biology, The University of Western Australia, 2School of Animal Biology and The Oceans Institute, The University of Western Australia, 3Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Anatomy, Physiology and Human Biology, The University of Western Australia

Dans cet article

Résumé

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La lumière au xénon non cohérente a été transmise à travers des filtres d’interférence à bande étroite et de densité neutre pour fournir une lumière de longueur d’onde et d’intensité variables aux cellules cultivées. Ce protocole a été utilisé pour évaluer les effets de la thérapie par la lumière rouge/proche infrarouge sur la production d’espèces réactives in vitro : aucun effet n’a été observé en utilisant les paramètres testés.

Résumé

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Rouge / thérapie lumière proche infrarouge (R / NIR-LT), délivré par laser ou diode électroluminescente (LED), améliore les résultats fonctionnels et morphologiques dans une gamme de blessures du système nerveux central in vivo, peut-être en réduisant le stress oxydatif. Cependant, on a montré des effets de R / NIR-LT sur le stress oxydatif varier en fonction de la longueur d'onde ou de l'intensité de l'irradiation. Les études comparant des paramètres de traitement font défaut, en raison de l'absence de dispositifs disponibles dans le commerce qui offrent de multiples longueurs d'onde ou intensités, adaptés à débit élevé mettre en études d'optimisation in vitro. Ce protocole décrit une technique pour la livraison de la lumière dans une plage de longueurs d'onde et des intensités d'optimiser les doses thérapeutiques nécessaires pour un modèle de lésion donnée. Nous émettons l'hypothèse que de fournir un procédé de lumière, dans lequel les paramètres de longueur d'onde et d'intensité peuvent être facilement modifiés, pourrait faciliter la détermination d'une dose optimale de R / NIR-LT pour réduire les espèces réactives de l'oxygène(ROS) in vitro.

Lumière non cohérente au xénon a été filtré à travers des filtres d'interférence à bande étroite pour fournir des longueurs d'onde variables (longueurs d'onde centrales de 440, 550, 670 et 810 nm) et des fluences (8,5 x 10 -3 à 3,8 x 10 -1 J / cm 2) de la lumière à des cellules en culture. Sortie de lumière de l'appareil a été calibré pour émettre des doses thérapeutiques pertinentes quantiques, l'égalité de la lumière à chaque longueur d'onde. Les espèces réactives ont été détectés dans le glutamate a souligné les cellules traitées avec la lumière, en utilisant DCFH-DA et H 2 O 2 des colorants fluorescents sensibles.

Nous avons livré avec succès la lumière à une gamme de longueurs d'onde physiologiquement et thérapeutique et intensités pertinentes, à des cellules en culture exposées à glutamate comme un modèle de lésion du SNC. Alors que les influences de R / NIR-LT utilisées dans la présente étude n'a pas exercer un effet sur ROS généré par les cellules cultivées, la méthode de livraison lumière est applicable à d'autres systems y compris les mitochondries ou plus physiologiquement modèles de culture organotypique pertinentes isolé, et pourrait être utilisé pour évaluer les effets sur un éventail de mesures des résultats du métabolisme oxydatif.

Introduction

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Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont nécessaires pour une série de voies de transduction de signaux et les réactions normales du métabolisme cellulaire, y compris ceux de la neuroprotection 1. Toutefois, lorsque le mécanisme antioxydant endogène sont incapables de contrôler la production de ROS, les cellules peuvent succomber à 2,3 stress oxydatif. Après une lésion du SNC, les augmentations liées à la présence des ROS et le stress oxydatif sont supposés jouer un rôle important dans la progression des dommages de 4,5. Malgré le nombre important des stratégies pour atténuer le stress oxydatif qui ont été évalués, il ne exis....

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Protocole

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1. L'étalonnage optique: Mesure Lumière sortie

  1. Pour préparer l'appareil de distribution de lumière, connecter une source de lumière à large bande (par exemple, Xenon ou une lampe de tungstène) à une alimentation appropriée. Positionner une lentille de collimation devant de la source lumineuse pour produire un faisceau collimaté de lumière. Faire passer la lumière à travers un filtre de chaleur liquide pour éliminer la majeure partie de la chaleur du faisceau lumineux. Selon l'application, focaliser le faisceau collimaté à l'ouverture d'entrée d'un guide de lumière liquide, qui prévoit la livraison plus flexible de la lumière (par exemple.,

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Résultats

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La sortie de la lumière prononcé en longueur d'onde de 670 nm a été calibré en utilisant des filtres de densité neutre afin d'irradier les cellules avec une gamme de fluences englobant une dose de lumière de 670nm précédemment montré pour être bénéfique in vivo (0,3 J / cm 2) 20. Comme le nombre de filtres de densité neutre devant la source de lumière accrue, l'intensité (W / m 2) a diminué, ce qui permet de passer moins de lumière vers la zone cible. Le tableau 1 présente les données d'ét.......

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Discussion

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Nous avons adapté avec succès un système de distribution précise de la lumière et calibré pour fournir un mécanisme pour l'étude d'optimisation de la R / NIR-LT in vitro. Longueur d'onde et l'intensité de paramètres R / NIR-LT sont capables d'être manipulées avec précision et de manière efficace en utilisant ce système. Nous avons établi que le traitement lumière des cellules ne ont pas conduit à la mort cellulaire, bien que ROS ne ont pas été réduite au niveau des longueurs d'onde et le.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Neurotrauma Research Program (Australie-Occidentale). Ce projet est financé par le Compte d’affectation spéciale pour les traumatismes routiers, mais ne reflète pas les points de vue ou les recommandations du Conseil de la sécurité routière.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de dosage ROS intracellulaire OxiSelect (fluorescence verte)Cell BiolabsSTA-342
Sondes moléculairesréactif Amplex UltraRedA36006
Lampe à arc au xénon de 300 wattsNewport Corporation6258Source de lumière très intense, ne regardez pas directement dans la lampe. Assurez-vous que la lampe est suffisamment refroidie lorsqu’elle est allumée Spectromètre
de fluorescence USB4000-FLOcean Optics
CC-3-UV Correcteur de cosinus pour la collection d’émissionsOcean Optics
200&mu ; Fibre optique de quartz de diamètre mOptics
SpectraSuite Plate-forme de spectroscopieOcean Optics
2300 EnSpire Lecteur de plaques multimodePerkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Toxicité aiguë, porter des gants lors de la manipulation.
Sel monosodique d’acide L-glutamique hydratéSigma-Aldrich142-47-2 (anhydre)
Phéochromocytome de rat (PC12) cellules de la médullosurrénaletype américainCRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640)Médias Gibco11875-119
Sérum de veau fœtal, certifié, inactivé par la chaleur, origine américaineGibco10082-147Chaud à 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
Sérum de cheval, origine Nouvelle-ZélandeGibco16050-122Chaud à 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
GlutaMAX SupplémentGibco35050-061Chaud à 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
100 mM Pyruvate de sodiumGibco11360-070Chaud à 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140-122Chaud à 37 ° ; C dans le bain-marie avant utilisation
100X MEM Solution d’acides aminés non essentielsGibco11140-050Chaud à 37 ° ; C dans le bain-marie avant utilisation
Cellules de Muller rétinien (rMC1)Université de Californie, San Diego
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-118Chaud à 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
75 cm2 FlaconsBD BiosciencesB4-BE-353136
Bromhydrate de poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Aliquote et conserver à -20 ° ; C
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)Gibco14025-134Chaud à 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010-049Chaud à 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
Laminine Protéine de souris, Gibco naturel23017-015Aliquote et stocker à -20 ° ; C
1X Neurobasal MoyenGibco21103-049Chaud à 37 ° ; C dans le bain-marie avant utilisation
Trypan Blue Solution, 0,4 %Gibco15250-061
165U PapainWorthington
L-CysteineSigma-AldrichW326305
Corning 96 plaques de puits, fond transparent, noirCorningCLS3603-48EA
Costar Polystyrène transparent 96 puits Plaques non traitées ; Forme du puits : Rond ; Stérile.Costar07-200-103
Bascule à basculeCentrifugeuse
laboratoire standard Papier
filtre à densité neutre (0.3)THORLABS
442 nm Filtre passe-bandeTHORLABSFL441.6-10
550 nm Filtre passe-bandeTHORLABSFB550-10
Filtre passe-bande 670 nmTHORLABSFB670-10
Filtre passe-bande 810 nmTHORLABSFB810-10e
Non monté & Oslash ; Filtres absorbants à densité neutre de 25 mm (0.1)THORLABSNE01B
Non montés & Oslash ; Filtres absorbants à densité neutre de 25 mm (0.2)THORLABSNE02B
Non montés & Oslash ; Filtres absorbants à densité neutre de 25 mm (0.3)THORLABSNE03B
Non montés & Oslash ; Filtres absorbants à densité neutre de 25 mm (0.5)THORLABSNE05B
Non montés & Oslash ; Filtres absorbants à densité neutre de 25 mm (0.6)THORLABSNE06B
Non montés & Oslash ; Filtres absorbants à densité neutre de 25 mm (1.0)THORLABSNE10B
de Ocean de de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
  2. Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signalin....

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Mots-clés

valuation du stress oxydatifmanipulation de l intensit de la longueur d ondesyst me de diffusion de lumi re au x nonfiltres d interf rence bande troitefiltres densit neutred tection des esp ces r actives de l oxyg necolorant fluorescent DCFH DAessai sensible au H2O2cellules soumises un stress au glutamate

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