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Article de méthode

Règlement des éléments nutritifs par l'alimentation continue pour l'expansion à grande échelle de cellules de mammifères en Spheroids

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DOI :

10.3791/52224

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25 septembre 2016

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1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Dans cet article

Résumé

La régulation des nutriments à l’aide d’une alimentation ajustée en croissance continue améliore les taux de croissance des sphéroïdes de cellules de mammifères par rapport à l’alimentation intermittente par lots pour les cultures dans des bioréacteurs en suspension agitée. Cette étude démontre les méthodes requises pour établir des cultures simples nourries au taux ajusté.

Résumé

Dans cette démonstration, des sphéroïdes formés à partir de la lignée cellulaire d’insulinome β-TC6 ont été cultivés comme modèle de fabrication d’un produit de cellules d’îlots de mariés afin de démontrer comment la régulation des niveaux de nutriments peut améliorer les rendements cellulaires. Dans des études antérieures, les bioréacteurs ont facilité l’augmentation des volumes de culture par rapport aux cultures statiques, mais aucune augmentation des rendements cellulaires n’a été observée. Les limitations de nutriments clés tels que le glucose, qui ont été consommés entre les repas par lots, peuvent entraîner des limitations de l’expansion cellulaire. De grandes fluctuations des taux de glucose ont été observées, malgré l’augmentation des concentrations de glucose dans les milieux. L’utilisation de systèmes d’alimentation continue a éliminé les fluctuations des niveaux de glucose et amélioré les taux de croissance cellulaire par rapport aux méthodes de culture statique et SSB alimentées par lots. Des augmentations supplémentaires des taux de croissance ont été observées en ajustant le taux d’alimentation en fonction de la consommation de nutriments calculée, ce qui a permis de maintenir le glucose physiologique pendant trois semaines en culture. Cette méthode peut également être adaptée à d’autres types de cellules.

Introduction

Afin de générer un grand nombre de cellules humaines viables et fonctionnelles pour la transplantation, la régulation des conditions de culture est impératif. Épuisement des nutriments, ainsi que l' accumulation de déchets métaboliques sont des contributeurs majeurs à la sénescence et métaboliques changements qui réduisent la qualité du produit de la cellule 1-3. Cette procédure présente un procédé de culture de cellules de mammifère dans sphéroïdes en utilisant un bioréacteur agité associé à un système d'alimentation de perfusion ajustée pour réguler le taux de glucose dans une gamme physiologique 4 pendant toute la durée de la culture. Aux fins de ces études, la gamme physiologique a été définie comme étant comprise entre 100 et 200 mg / dl. Les mêmes procédés peuvent être utilisés pour réguler d'autres éléments nutritifs et de déchets métaboliques tels que le lactate.

cultures statiques dans des petits volumes (1 - 30 ml) sont généralement utilisés dans le cadre du laboratoire de conserver et de différencier les lignées cellulaires pour experimefins NTAL. Cellule repiquage est réalisé avec des changements de milieu complet, au besoin, à intervalles réguliers. La plupart du milieu de culture "classique" a une concentration en glucose élevée (450 mg / dl pour DMEM utilisé dans ces études) pour permettre des changements moyens moins fréquents, sans risque de limitations en nutriments. Cependant, ce procédé par lots alimentation nécessite toujours une manipulation fréquente, présente une variabilité dans l'environnement cellulaire et augmente le risque de contamination de 5 à 9. Bioréacteurs de suspension brassés (SSB) fournissent un meilleur mélange et une diminution de la manipulation 3,10 - 20, mais comme les cultures statiques, nécessitent moyennes modifications manuelles qui contribuent aux fluctuations potentiellement dommageables dans les niveaux de produits nutritifs et des déchets. Perfusion alimentation des cultures SSB réduit ces problèmes en perfusion continue et l'élimination du milieu, mais de grands changements dans les niveaux de nutriments en raison de la croissance des cellules demeurent un problème. L'utilisation d'un ra d'alimentation ajustéete à partir de calculs de l' utilisation des éléments nutritifs en fonction des besoins cellulaires estimés peut fournir l'environnement cellulaire stable nécessaire pour optimiser la viabilité cellulaire et la fonction 21 - 24.

Il y a une abondante littérature décrivant les méthodes de cultures SSB évolutives de cellules de mammifères en particulier pour la culture et l' expansion des cellules pluripotentes 25 - 32, avec d' autres mis l' accent sur l' îlot (beta) cellules 17,33,34, ou la production de produits biologiques 24, 35-38. Beaucoup de ces types cellulaires étudiés peuvent être cultivées dans des cultures sphéroïde, et des procédures spécifiques pour le type de cellule utilisé doit être optimisé avant la mise en œuvre d'un système d'alimentation continue. Dans cette démonstration, un procédé de perfusion d'alimentation a été utilisé pour développer une lignée de cellules bêta cultivées sous forme de sphéroïdes dans un bioréacteur agité 39-43. Le procédé décrit ici fournit unla mise en œuvre directe de l'alimentation des ajustements de taux basés sur des mesures de glucose hors-ligne pour obtenir des conditions de culture ciblées. Réglage de la vitesse d'avance avec cette méthode pour maintenir un niveau de glucose physiologique est montré une augmentation des rendements de cellules. Les cellules de mammifères dépendent d'un nutriment essentiel, le glucose, la production d'énergie, de sorte que l'utilisation de cette lignée cellulaire représente un modèle pour de nombreuses cellules de mammifères cultivées 44. En outre, cette ligne illustre la complexité supplémentaire des cellules bêta, qui sont sensibles aux niveaux de glucose élevés et chroniques 45. Pour cette étude, les cellules ß-TC6 sont autorisés à former des sphéroïdes en culture pour approximer la taille moyenne des îlots de Langerhans in vivo. Le système de bioréacteur à perfusion 17 - 19,21,46 avec un taux d'alimentation adapté à la consommation de glucose, a entraîné le maintien des conditions physiologiques , et les rendements des cellules plus élevées sans modification de la viabilité.

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Protocole

1. Cell Line et maintenance

  1. Obtenir les cellules ß-TC6 (ou autre ligne souhaitée de cellules de mammifères adhérentes). En préparation de l'étude, la culture, le passage, et la cryoconservation des cellules selon les instructions du fournisseur.

2. Assembler le système d'alimentation en continu

NOTE: La conception du système d'alimentation en continu dans la méthode ci - dessous est basée sur des systèmes similaires décrits dans la littérature 17 - 19,21,47 - 49. Assemblée du système utilisé ici est décrit en détail dans une publication précédente 3.

  1. Recueillir les composants nécessaires pour le système d'alimentation qui se compose de cinq éléments principaux: un réservoir moyen, pompe péristaltique, bioréacteur agité, réservoir de déchets, et conçu sur mesure ensemble tube / échantillonnage.
    1. Mettre en place le réservoir de fluide en utilisant une bouteille de 1 L de verre, le réservoir de déchets à l'aide d'une bouteille en verre de 2 L, et l'stirred bioréacteur en utilisant un réacteur en verre d'un volume de 250 ml (de la version du plateau).
    2. Utilisez une pompe péristaltique numérique ou d'une pompe similaire avec une tête de pompe 8 canaux pour contrôler l'échange moyen.
    3. Fabrication du réservoir et des couvercles de bioréacteurs modifiés à partir de plastique dur et autoclavable avec tube en acier inoxydable passe-ports pour fournir une ventilation à travers des filtres stériles, et permettre le transfert moyen entre les réservoirs et les bioréacteurs. Vous pouvez également acheter des couvercles spécialisés avec des ports de différents fournisseurs de flux.
      NOTE: Le couvercle du bioréacteur peut contenir des ports passe-travers supplémentaires pour l' instrumentation en option et les sondes de surveillance (par exemple, moniteur d'oxygène).
    4. Fixer un tube de sortie (OT) fabriquée à partir de tubes d'aération en verre poreux avec une gamme moyenne de 40 um à 60 um de taille des pores, et une densité de pores de 40% au couvercle SSB modifié. Vous pouvez également choisir un autre tube de sortie en fonction des exigences spécifiques de la culture.
      REMARQUE: ChoisissezLa taille des pores OT pour enlever seulement moyen et les débris cellulaires, les agrégats de cellules en culture (comme décrit dans la section 6 et publication 3 pour plus de détails).
  2. Assembler autoclavables ensembles de tubes de perfusion de fluorure de polyvinylidène (PVDF) connecteurs de tubes et de tubes résistant à la pompe péristaltique. La longueur de la section dépend de la distance entre les différents composants.
    REMARQUE: Faites attention lors de la sélection variété de tubes pour assurer la durabilité et la fiabilité pour des expériences à long terme.
  3. Assembler le tube fixé à partir de trois parties: une ligne d'alimentation, une ligne de déchets, et une ligne d'échantillon.
    1. Assembler la ligne d'alimentation en utilisant deux diamètres de tubes (L / S 14 et L / S 13). Utiliser le rapport L / S 14 pour le tube primaire qui couvrira la distance du bioréacteur au réservoir de fluide, et insérer une courte longueur de L / S 13 au milieu de la longueur du tube pour la section de pompe à l'aide des adaptateurs de PVDF appropriés.
    2. Utilisez standard PVDF tuyau de fer barbelé tubing d'adaptateurs pour joindre deux morceaux de L / S 14 colonne de part et d'autre de la section de pompe la plus courte (L / S 13) tubulure.
      NOTE: Sinon, toute la longueur du tube pourrait être plus petit diamètre L / S 13 tubes, et sur toute la longueur du tube pourrait être remplacé lorsque l'intégrité pompe-section est en question.
  4. Assembler la deuxième section de tube pour l'élimination des déchets en utilisant un plus grand diamètre (L / S 16) tube et insérez une courte section de L / S 14 tube au milieu de la section de pompage. Cela se fait de la même manière que la ligne d'alimentation en utilisant l'assemblage des adaptateurs de tuyaux à barbillons-PVDF, ou encore à l'aide d'une longueur continue de la taille du tuyau de pompe souhaité, et de le remplacer si nécessaire.
    NOTE: Si la même pompe et la tête de la pompe sont utilisés pour le circuit d'alimentation et le circuit des déchets, la section de la pompe des lignes de tubes d'enlèvement des déchets doit être un plus grand diamètre que la section de la pompe de la ligne d'alimentation. Cela garantit que le débit de la pompe d'évacuation est plus rapide que le débit d'alimentation, et éviter le puissantial pour les grands changements dans le volume de la culture, et de réduire le risque de débordement.
  5. Assembler la dernière composante de l'ensemble de tubes: un ensemble de collecte d'échantillons.
    1. Cette procédure décrit une coutume assemblé échantillonner système portuaire; alternativement, un port d'échantillonnage stérile peut être acheté auprès de divers fournisseurs.
    2. Construire l'ensemble de trois courts (~ 6 cm) L / S 14 longueurs de tubes reliés entre eux avec un connecteur PVDF de type T, et deux petits colliers de serrage sur deux des longueurs de tubes.
    3. Fixer un filtre à gaz stérile pour l'évacuation de gaz à l'une des longueurs serrées, et l'autre est utilisé pour la connexion à une seringue d'échantillonnage stérile (filtres à gaz stériles peuvent doivent être ajoutés dans une armoire bio-sécurité après stérilisation autant de filtres stériles ne sont pas autoclavable).
    4. Connecter la troisième extrémité à un connecteur inoxydable échantillon d'acier fixé sur le couvercle du bioréacteur.
    5. Autoclave l'ensemble d'échantillonnage étant connecté au bioréacteur avant de commencerl'expérience (voir l'étape 3 ci-dessous).
    6. Utilisez cet ensemble pour recueillir des échantillons stériles du bioréacteur au besoin sans perturber le processus d'alimentation continue.

3. autoclaves Tous les matériaux

  1. Préparer tous les composants de bioréacteurs pour la stérilisation en autoclave.
  2. Collecter des composants individuels pour la stérilisation. Moyen et déchets réservoirs (assemblés à partir de l'étape 2.1.1), 250 ml spinner flacon (assemblé à partir de 2.1.1), les couvercles modifiés nécessaires (assemblés à partir de 2.1.3), le tube d'écoulement (décrit dans 2.1.4), trois ensembles de tubes ( assemblé dans les sections 2.2 through2.5), le tube d'écoulement (selon les besoins pour l'alimentation en continu).
    1. Assembler spinner flacon avec tous les composants et être sûr que le tube d'écoulement est fermement attaché à l'intérieur du flacon spinner (décrit dans la section 2.1.4), et fixer le port personnalisé assemblé d'échantillonnage (section 2.5), ou tout autre point d'échantillonnage vers le haut du couvercle .
    2. Enveloppez la totalité de l'ensemble spinner flacon avec automatériau clave wrap et autoclave indiquant la bande. Assurez-vous que l'enveloppe étanche à l'air. NOTE: La feuille d'aluminium ou d'un matériau similaire peuvent être utilisés pour couvrir les extrémités individuelles de chaque port d'accès dans le couvercle du bioréacteur pour préserver la stérilité du connecteur / se termine lorsque déballant et en cas de non-connectés aux ensembles de tubes à l'intérieur de l'incubateur.
    3. Assembler les couvercles modifiés des moyennes et des déchets des réservoirs puis attacher les bouteilles en verre respectives. Couvrez-les en utilisant une feuille d'aluminium et de l'autoclave indiquant bande.
    4. envelopper individuellement les ensembles de tubes (section 2.2 à 2.5) avec une pellicule autoclave et du ruban adhésif pour aider à l'assemblage final. La feuille d'aluminium ou d'un matériau similaire peuvent être utilisés pour envelopper les extrémités individuelles de chaque tube fixé pour préserver la stérilité du connecteur / se termine lorsque dépliage.
    5. Autoclave tous les articles emballés à l' aide d' un cycle d'autoclave sec standard (par exemple, "Gravity" réglage avec ~ 15 psi à 121 ° C pendant 30 minutes ou plus).
      NOTE: Ne fixez pas stérileles filtres avant autoclavage sauf si elles sont confirmées pour être sûr autoclave.

4. Formation Spheroid

Remarque: cette technique est similaire à ceux décrits dans la littérature 17 - 19,21,50 - 52 pour d' autres cultures de cellules de mammifères. Toutes les procédures ci-après stérilisation doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire et en utilisant des gants stériles pour maintenir des conditions stériles pour la culture cellulaire.

  1. Pour toutes les conditions, la culture et développer des cellules β-TC6 dans des cultures adhérentes standard (décrites par le fournisseur) jusqu'à ce que des quantités suffisantes de cellules sont obtenues pour ensemencer le nombre désiré de bioréacteurs.
    1. Assembler le bioréacteur d'alimentation en continu avec le tube de sortie comme le montre la figure 1 et décrit dans la section 2, et connecter le port d'échantillonnage sur le couvercle d'échantillonnage. REMARQUE: le tube de sortie et de prélèvement ensemble d'orifice doivent être ajoutés à la bioreactou pour l'alimentation en continu avant la formation de sphéroïde et doit être tiré vers le haut hors du milieu de culture jusqu'à ce que l'alimentation continue est démarrée.
    2. Stériliser l'ensemble SSB modifiée par autoclave (décrit dans la section 3).
    3. Fixer les évents stériles (0,22 um ou plus petits filtres stériles) aux endroits appropriés sur les couvercles de la fiole centrifuge, et les vaisseaux moyens et déchets.
      NOTE: Ceci est important pour éviter le blocage de la vapeur, et pour permettre l' échange de gaz entre l'incubateur (5% de CO 2) l' environnement et le bioréacteur. L'échange de gaz est nécessaire pour maintenir le bon pH lors de l'utilisation des médias de bicarbonate tamponnée.
  2. Recueillir les cellules par trypsinisation douce en utilisant 0,25% (p / v) de solution de trypsine EDTA 0,53, à température ambiante , aidée par agitation mécanique pendant 2 à 3 min, et la semence dans les bioréacteurs , à une densité d'environ 1,3 x 10 6 cellules / ml 200 dans un milieu de culture ml.
    1. Déplacer des flacons désignés de l'incubateur etdans une armoire Bio-sécurité.
      NOTE: Toute la culture et les manipulations cellules doivent être faites dans une armoire Bio-sécurité en utilisant une technique stérile appropriée.
    2. Éliminer le milieu de culture à partir des flacons par aspiration.
    3. Laver les cellules par pipetage 5 ml de solution saline tamponnée phosphate (sans Ca ++ ou Mg ++), dans le flacon et le rinçage à travers les cellules à la surface, puis aspirer le PBS.
    4. Ajouter 3 ml de solution de trypsine-EDTA à chaque flacon qui seront recueillies (typiquement environ 10x 175 cm 2 flacons T).
    5. Laisser les cellules récoltées à incuber à température ambiante pendant 2 - 3 min dans l'armoire bio-sécurité.
    6. Agiter doucement à la main pour desserrer les cellules de la surface du flacon et recueillir les cellules en ajoutant 6 ml de milieu de culture (avec sérum) dans le ballon, et transférer les cellules dans un tube de 50 ml. Quand on tube de 50 ml est plein, utilisez un autre tube de 50 ml jusqu'à ce que toutes les cellules nécessaires ont été recueillies (environ un tube de 50 ml sera nécessaire pour tous les 5 T-175 flaconsrecueillies).
    7. Doucement centrifuge (environ 50 x g), les suspensions de cellules recueillies pour sédimenter les cellules.
    8. Aspirer le milieu restant, laissant le culot intact.
    9. Recueillir toutes les cellules dans un seul tube en remettant en suspension les culots dans un (contenant du sérum), le milieu de culture à l'aide d'une pipette, et le transfert de toutes les pastilles dans le même tube.
    10. Compter la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre standard avec une coloration au bleu trypan comme décrit dans la littérature 53.
    11. Ajouter nombre désiré de cellules totales à stériles SSB pour chaque état (1,3 x 10 6 cellules / ml a été les densités cellulaires de départ ciblés pour cette démonstration).
    12. Ajouter moyen (avec la concentration de glucose souhaité, dans ce cas, le taux de glucose moyen dans la gamme physiologique, nous avons utilisé) pour SSB en utilisant une pipette pour atteindre le volume de la culture totale désirée (200 volumes ml de culture a été utilisé pour ces études).
      NOTE: Pour ces alimentés en continu SSB étudie la cu ltures ont été ensemencées en utilisant un "low-glucose» version modifiée du milieu de culture (100 mg / dl). Cela a permis aux cultures de commencer à la concentration souhaitée de glucose cible plutôt que de commencer avec un milieu "haut glucose" et en attente de la consommation de glucose pour amener les niveaux de glucose vers le bas dans la gamme physiologique pour commencer l'alimentation. Tout autre support pour l'alimentation dans ces études ont utilisé la norme "haute glucose" moyen (500 mg / dl).
    13. Déplacer SSB avec des cellules sur une plaque d'agitation dans un incubateur de culture cellulaire.
  3. Les cellules de culture dans les bioréacteurs sans alimentation pendant 3 jours à 37 ° C, avec 5% de CO 2, 100% d' humidité relative, et un taux de 70 tours par minute d'agitation pour permettre sphéroïdes pour former.
    NOTE: Aucune prolifération significative doit être observée pendant la période de formation de sphéroïde de trois jours.
  4. Après la formation sphéroïde, diviser sphéroïdes entre les bioréacteurs avec des conditions de culture désirées.
le "> 5. Continuous Culture d'alimentation et ajusté Débit d'alimentation

  1. Autoclave ou de gaz stériliser tous les composants, et le montage dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant des techniques stériles (étapes 2-4).
  2. Après la formation sphéroïde, retirez le SSB de l'incubateur et assembler les composants du système d'alimentation en continu dans une enceinte de sécurité biologique.
    1. Remplissez d'abord le réservoir milieu frais avec le milieu de culture souhaitée, puis se connecter à un côté de la ligne d'alimentation. Assurez-vous également que le réservoir du milieu frais est correctement ventilé avec un filtre stérile.
    2. Connecter un côté de la ligne d'alimentation à l'orifice d'entrée d'alimentation sur le bioréacteur d'une façon stérile. Un filtre stérile doit être installé entre la conduite d'alimentation et l'orifice d'entrée du réacteur biologique pour filtrer le milieu avant son entrée dans le bioréacteur.
    3. Connectez la ligne de déchets vers le bioréacteur à tube de sortie et le réservoir de déchets moyen, et veiller à ce que le réservoir de déchets est correctement ventilé avec un sterilFiltre e.
  3. Déplacer l'ensemble de l'enceinte de sécurité biologique (ce sera probablement besoin de deux personnes pour transporter tous les vaisseaux et les tubes), et de mettre tous les composants pour la culture à long terme.
    1. Mettre le SSB sur la plaque d'agitation à l' intérieur de l'incubateur en utilisant les mêmes paramètres de culture pour la formation de sphéroïde (37 ° C, 5% de CO 2, à 100% d' humidité et à 70 tours par minute). NOTE: Il peut être nécessaire de déconnecter temporairement les segments de tube du bioréacteur si les lignes doivent fonctionner à travers des trous dans le côté de l'incubateur plutôt que par l'intermédiaire du joint de la porte. Cela peut être effectué d'une manière aseptique, en enveloppant les extrémités des ensembles de tubes avec une feuille d'aluminium avant l'autoclavage (étape 3), et l'attente pour attacher le côté bioréacteur des sections d'alimentation et le tube de déchets jusqu'à ce que le bioréacteur est à l'intérieur de l'incubateur. Les lignes de tubes peuvent être mises en place, et la feuille d'aluminium peuvent être éliminés à l'intérieur de l'incubateur et rapidement attachés au bioréacteur.
    2. Exécuter extrémités restantes des ensembles de tubes (ceux non connectés au couvercle du bioréacteur) à travers l'orifice d'accès de l'incubateur (pass-through), ou par l'intermédiaire d'un cran dans le joint de la porte de l'incubateur.
    3. En dehors de l'incubateur (dans une enceinte de sécurité biologique à proximité si possible), connecter rapidement la ligne d'alimentation vers le réservoir du milieu frais, et la ligne de déchets vers le réservoir de déchets moyen, et veiller à ce que le réservoir de déchets est correctement ventilé avec un filtre stérile. NOTE: Pour ce faire d'une manière aseptique, retirez la feuille d'aluminium à partir des tubes et des vaisseaux connecteurs et se connecter aux navires respectifs le plus rapidement possible (surtout si cette connexion doit être effectuée en dehors de l'enceinte de sécurité biologique).
    4. Mettez le réservoir du milieu frais (rempli de milieu d'alimentation souhaitée) à l'intérieur à proximité mini-réfrigérateur. Assurez-vous que les lignes d'alimentation et les déchets sont en mesure de sortir de l'incubateur et entrer dans le réfrigérateur sans empêcher les portes de chaque de se fermer. Il est également essentiel que l'alimentation lines ne sont pas pincés fermés par les portes de du réfrigérateur ou de l'incubateur.
      NOTE: Le milieu utilisé pour ces études était le taux élevé de glucose standard (500 mg / dl) milieu de culture recommandé par le fournisseur pour ce type de cellule. Tout milieu de glucose élevé peut être utilisé en fonction des besoins spécifiques du type de cellule cultivée. La concentration en glucose du milieu d'alimentation doit être relativement élevée (2x ou plus) que la concentration souhaitée dans la culture en tant que système d'alimentation repose sur l'augmentation du taux de milieu de glucose élevé d'alimentation pour maintenir les niveaux de glucose adéquates dans les cultures, tout en maintenant les taux d'alimentation raisonnables .
    5. Ensuite, le réservoir de milieu de déchets peut être mis sur le dessus de banc à l'extérieur de l'incubateur dans un emplacement idéal.
    6. Ensuite, placer la partie "pompe" des conduites d'amenée et de déchets dans la tête de pompe assurant l'orientation correcte de telle sorte que les lignes d'alimentation seront pompe à fluide à partir du réservoir de milieu frais dans le SSB, et les lignes de déchetspompera moyen de la SSB et au réservoir de fluide de déchets.
  4. Tourner la pompe à la vitesse d'avance souhaitée.
    1. Calculer le taux d'alimentation en utilisant l'équation de débit d'alimentation ajusté décrit dans la littérature 3 et dans la section prévue des résultats représentatifs ci - dessous.
    2. Utiliser les informations les plus récentes de comptage de cellules (mode opératoire décrit dans l'étape 5), ainsi que la prédiction de la croissance, et les mesures moyennes de glucose pour estimer la vitesse d'alimentation nécessaire pour maintenir la concentration de glucose souhaité dans la culture.
      NOTE: Les taux de croissance des cellules et des taux de consommation de glucose devront être obtenus avant de faire ces procédures.
    3. Réglez la vitesse de la pompe en fonction du débit d'alimentation calculée.
  5. Répétez le calcul du taux d'alimentation et d'ajuster la vitesse de la pompe pour chaque point d'échantillonnage (tous les trois jours pour la méthode décrite).

6. Comptage des cellules, la viabilité et les mesures de concentration de glucose

  1. Recueillir des échantillons de chaque bioréacteur tous les trois jours, ou comme on le souhaite.
  2. Prélever des échantillons de culture de cultures SSB alimentés en continu en utilisant le port d'échantillonnage spécialisé décrit ci-dessus.
    1. En quittant le SSB alimenté en continu à l'intérieur du bioréacteur, fixer une seringue stérile (un volume seringue de 5 ml a été utilisée pour ces études) pour une connexion non-filtrée de l'orifice d'échantillonnage.
    2. Déplacer le tube d'échantillonnage vers le bas dans le milieu de culture.
    3. Débrider la section de tube allant à la seringue, et de retirer le volume total souhaité de l'échantillon.
    4. Déplacer le tube d'échantillonnage de façon à ce qu'il ne soit plus immergée dans la culture, et de continuer à retirer la seringue jusqu'à ce que l'air est enlevé.
    5. Fixer le tube qui alimente la seringue, et retirer la seringue contenant l'échantillon, et mettre de côté.
    6. Pré-charger une seconde seringue stérile fraîche avec de l'air, et l'attacher sur le côté du filtre stérile de l'orifice d'échantillonnage.
    7. Débrider le tube va du côté seringue-filtrel'orifice d'échantillonnage, puis purger l'orifice d'échantillonnage en chassant l'air doucement dans la seringue à travers le filtre stérile. Cela garantit que le port d'échantillonnage sera clair de tout milieu résiduel.
    8. Re-serrer le tube passe au filtre, débrancher la seringue stérile et le jeter.
  3. Prendre la seringue contenant l'échantillon de cellules à partir de la culture et de l'expulser dans un tube de 10 ml. Les sous-échantillons de volumes connus peuvent être prises directement à partir de ce tube.
  4. Pour le nombre de cellules, enlever un volume connu de cellules et transférer dans un tube de micro-centrifugeuse et centrifuger doucement pendant 1 - 2 min (environ 50 x gravité).
  5. Transférer le surnageant dans un tube séparé pour les mesures de glucose, et remettre en suspension le culot avec le même volume de solution de trypsine-EDTA (0,25% (p / v) de trypsine, EDTA 0,53) et compter en triple exemplaire en utilisant un hémocytomètre standard avec la coloration au bleu trypan comme décrit dans la littérature 53.
    1. Ajouter du milieu (avec sérum) àl'échantillon pour la dilution si nécessaire.
    2. Compter les cellules, et calculer la viabilité des cellules en enregistrant des cellules vivantes (non colorées), et les cellules mortes (colorées) indépendamment (viabilité% = cellules vivantes / cellules au total).
  6. Mesurer le taux de glucose moyen en triple exemplaire, en utilisant un appareil de mesure de la glycémie et à usage unique test-bandes.
    1. Prendre des mesures de glucose comme décrit par les instructions de compteurs de glucose en substituant le milieu de culture pour le sang.
    2. Trempez la bandelette de test dans le milieu à tester (collectées à partir d'échantillons de comptage ci-dessus), et répéter pour le nombre désiré de répétitions (trois répétitions sont recommandées).
    3. Testez aussi bien le milieu frais et moyenne des déchets pour les concentrations de glucose.
      NOTE: Pour certains compteurs, des mesures inférieures à 20 mg / dl (seuil détectable de l'appareil de mesure), peut être observée comme une erreur dans la sortie du compteur.

7. Spheroid Mesures Tassement de taux

  1. Pour veiller à ce que cell grappes ne sont pas éliminées par le système d'alimentation en continu, mesurer la vitesse de sédimentation des sphéroïdes ß-TC6 en observant leur sédimentation dans un grand diamètre de pipette en plastique.
  2. la culture des cellules ß TC6 dans des bioréacteurs SSB pour former des sphéroïdes comme décrit ci-dessus.
  3. Après 3 jours de culture, prendre 30 ml des échantillons de la suspension sphéroïde et placer dans un tube de 50 ml.
  4. Pipeter doucement vers le haut et vers le bas en utilisant une grande pipette diamètre de 25 ml pour répartir uniformément en suspension, puis arrêter pipetage avec la suspension à un niveau connu dans la pipette (par exemple, 20 ml marque), puis enregistrer le temps pour tous les sphéroïdes à régler 5 cm.
  5. Répétez cette procédure suffisamment de fois pour atteindre la confiance statistique (généralement n> 3).
    NOTE: Pour les études biologiques, une valeur p inférieure à 0,05 est considérée comme statistiquement significative lorsque l'on compare les mesures. L'erreur standard de la moyenne a été utilisée pour les erreurs de déclaration, et l'étudiant-t test non apparié les deux taileda été utilisé pour comparer les conditions pour les données présentées.

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Résultats

Les niveaux et les fluctuations de la glycémie moyenne Limiter l' expansion des cellules dans les cultures standard SSB

Les niveaux de glucose dans des cultures statiques varient et les cultures SSB pendant toute la période de culture de 3. Ces fluctuations intensifient avec l'augmentation du nombre de cellules au cours de la période de culture de 21 jours et étaient presque identiques dans les de...

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Discussion

Générer des produits de cellules de mammifères pour la production d'agents biologiques et des thérapies cellulaires nécessite la culture et la surveillance des cellules de mammifères à grande échelle 55-58. En outre, ces applications nécessitent des conditions de culture définies et validées. Il suffit d'augmenter le volume des cellules en utilisant des technologies de recherche ne sera pas répondre à toutes ces exigences. moyennes modifications manuelles causant des fluctuations...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Michael Garwood et Sam Stein pour leurs commentaires utiles, ainsi que Kristen M. Maynard pour leur aide dans la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
β ; TC-6 CellsATCC, Manassas, VACRL-11506Lignée cellulaire d’insulinome de souris (type de cellule adhérente)
DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144 ? ICID=search-14190144
Dulbecco’s Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAVoir ci-dessous pour les numéros de produit  ;
DMEM High Glucose (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM Low Glucose (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (notez que ce milieu contient déjà du pyruvate)
L-glutamineInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081 ? ICID=produit-de-recherche
Pyruvate de sodiumInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070 ? ICID=search-product
Sérum porcin inactivé par la chaleurGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056 ? ICID=search-product
T-150 Flacons traités pour la culture tissulaireCorning, Corning, NY430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Sciences de la vie)
& categoryname=
Incubateur de culture cellulaire NuAirePrinceton, MNUS Autoflow. N’importe quel incubateur de culture cellulaire régulant le CO2 avec chemise d’eau peut être utilisé.
CentrifugeuseSorvall RT 7 (Toute centrifugeuse de paillasse similaire peut être utilisée)
RéfrigérateurN’importe quel réfrigérateur de laboratoire peut être utilisé (une petite version de table a été utilisée pour ces études)
1 L Bouteille en verreCorning, Corning, NY1395-1LN’importe quel fournisseur peut être utilisé. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Sciences de la vie)
& categoryname=
2 L Bouteille en verreCorning, Corning, NY1395-2LN’importe quel fournisseur pourrait être utilisé
250 ml de bioréacteurs agités  ;Corning, Corning, État de New York4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Sciences de la vie)
& categoryname=
Plaque à mélangerFisher Scientific11-496-104AN’importe quelle plaque à agiter sans danger pour l’incubateur peut être utilisée, n’importe quel fournisseur
Boîtes de culture tissulaire 100 mm de diamètreNunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598  ;N’importe quel fournisseur peut être utilisé (commandé via Fisher Sci)
FALCON 50 ml Tubes coniquesFalcon, San Jose, CA1256598 N’importequel fournisseur pourrait être utilisé
Delran Plastic Utilisé pour les pièces personnaliséesMcMaster CarrDiversN’importe quel matériau de choix peut être utilisé, mais Deran est choisi parce qu’il est sans danger pour l’autoclave, non réactif et facile à usiner. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Tuyau en acier inoxydable pour couvercles personnalisésMcMaster CarrDiversN’importe quel fournisseur peut être utilisé. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Couvercles de bioréacteur Delran modifiés sur mesure pour l’alimentation continueFabriquéNe connaît aucun fournisseur produisant un produit similaire Couvercles de
bouteilles en verre modifiés sur mesure pour l’alimentation continue Fabriquéssur mesureCertains fournisseurs ( par exemple , Fischer Sci, Corning) fabriquent des produits similaires dans les liens ci-dessous.
Pompe péristaltique numérique MasterflexCole Parmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25N’importe quelle pompe péristaltique de précision peut être utilisée. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
Connecteurs de tubes PVDF (divers)Cole Parmer, Vernon Hills, ILvoir le lienN’importe quel fournisseur pourrait être utilisé. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
Pharmed BPT Tubing L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16N’importe quel fournisseur peut être utilisé. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
Tube BPT armé L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14N’importe quel fournisseur peut être utilisé. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
Tube BPT armé L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13N’importe quel fournisseur peut être utilisé. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Millipore Millex GP Membrane PES 0.22 µ ; l filtre à seringue stérile (utilisé pour la ventilation et la filtration moyenne)Fisher ScientificSLGP033RSTout fournisseur peut être utilisé
25 ml Pipette graduéeFisher Scientific13-678-11N’importe quel fournisseur peut être utilisé, et différentes tailles peuvent être utilisées
PipetteFisher Scientific13-681-15ETout fournisseur ou produit similaire peut être utilisé
HémocytomètreFisher Scientific02-671-6N’importe quel fournisseur ou produit similaire peut être utilisé
Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061N’importe quel fournisseur ou produit similaire peut être utilisé. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
Microscope à lumière inverséeLeicaN’importe quel fournisseur ou produit similaire peut être utilisé
One Touch Ultra Blood GlucoseMeter Fisher Scientific22-029-293Tout fournisseur ou produit similaire peut être utilisé (par ex. , Bayer)
One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292  ;Tout fournisseur ou produit similaire peut être utilisé (par ex. , Bayer)
sur mesure

Références

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