Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien Suspension

Résumé

Nous présentons ici un protocole accepté par la communauté en format multimédia pour l’injection sous-rétinienne d’un bolus de cellules EPR chez le rat et la souris. Cette approche peut être utilisée pour déterminer les potentiels de sauvetage, les profils d’innocuité et les capacités de survie des cellules EPR greffées lors de l’implantation dans des modèles animaux de dégénérescence rétinienne.

Résumé

La conversion de la lumière en impulsions électriques se produit dans la rétine externe et est réalisée en grande partie par bâtonnets et des cônes photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des cellules. RPE fournir un soutien essentiel pour les photorécepteurs et la mort ou le dysfonctionnement des cellules RPE est caractéristique liée à l'âge dégénérescence maculaire (DMLA), la principale cause de perte de vision permanente chez les personnes de 55 ans et plus. Alors pas de remède pour AMD a été identifié, l'implantation d'un EPR sain dans les yeux malades peut se avérer un traitement efficace, et un grand nombre de cellules RPE peut être facilement généré à partir de cellules souches pluripotentes. Plusieurs questions intéressantes quant à l'innocuité et l'efficacité de la prestation des cellules RPE peuvent encore être examinés dans des modèles animaux, et des protocoles bien acceptées utilisées pour injecter RPE ont été développés. La technique décrite ici a été utilisé par plusieurs groupes dans diverses études et consiste à créer d'abord un trou dans l'œil avec une aiguille. Ensuite, une seringue avec une bluaiguille nt chargé avec des cellules est inséré à travers le trou et passe à travers le corps vitré jusqu'à ce qu'il touche le RPE. En utilisant cette méthode d'injection, ce qui est relativement simple et nécessite un minimum d'équipement, nous obtenons une intégration cohérente et efficace des cellules RPE dérivés de cellules souches dans le RPE entre hôte qui empêche la quantité importante de dégénérescence des photorécepteurs chez des modèles animaux. Bien que ne faisant pas partie du protocole proprement dit, on décrit également comment déterminer l'ampleur du traumatisme induit par l'injection, et la façon de vérifier que les cellules ont été injectées dans l'espace sous-rétinien en utilisant des modalités d'imagerie in vivo. Enfin, l'utilisation de ce protocole ne est pas limitée aux cellules RPE; il peut être utilisé pour injecter ne importe quel composé ou d'une cellule dans l'espace sous-rétinien.

Introduction

La rétine sensorielle est organisée en niveaux fonctionnels de neurones, de cellules gliales et de cellules endothéliales. Les photorécepteurs à l’arrière de la rétine sont activés par la lumière ; Grâce à la phototransduction, ils convertissent les photons en signaux électriques qui sont affinés par les interneurones et transmis au cortex visuel du cerveau. La phototransduction ne peut se produire sans les efforts coordonnés des cellules gliales de Mueller et de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Les EPR sont organisés en une monocouche directement derrière les photorécepteurs et remplissent des fonctions multiples et diverses faisant partie intégrante de la fonction des photorécepteurs et de l’homéostasie. En fait, l’EPR et les photorécepteurs sont tellement codépendants qu’ils sont considérés comme une unité fonctionnelle. La mort ou le dysfonctionnement de l’EPR entraîne des effets secondaires dévastateurs sur les photorécepteurs et est associé à la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de cécité chez les personnes âgées^1,2.

Bien qu’aucun remède n’ait été découvert pour la DMLA, plusieurs études cliniques ont montré que le remplacement des cellules EPR pourrait être une option thérapeutique prometteuse^3-13. Avec l’avènement de la technologie des cellules souches, il est désormais possible de générer un grand nombre de cellules EPR in vitro à partir de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites (hES et hiPS) qui ressemblent fortement à leurs homologues somatiques fonctionnellement et anatomiquement^14-26. Il a également été démontré que l’EPR dérivé de cellules souches fonctionne in vivo par plusieurs groupes indépendants, y compris le nôtre, pour ralentir considérablement la dégénérescence rétinienne chez les lignées de rats et de souris avec une dégénérescence rétinienne spontanée^{16,18,21,22,25,28,29}. Cette combinaison de preuves cliniques et précliniques à l’appui est si convaincante que plusieurs essais cliniques visant à prévenir la dégénérescence rétinienne à l’aide de cellules EPR dérivées de cellules souches sont actuellement en cours^30,31.

RPE peut être facilement dérivé de hES et/ou hiPS et implanté dans l’espace sous-rétinien des rongeurs en utilisant diverses techniques de dérivation et d’injection^32,33. (Voir Westenskow et al. pour un article sur les méthodes au format multimédia démontrant le protocole de différenciation dirigée que nous utilisons)³⁴. Des questions cruciales subsistent concernant l’innocuité, la survie et la capacité fonctionnelle des cellules EPR délivrées de manière exogène lors de l’implantation, par conséquent, la capacité d’effectuer des injections sous-rétiniennes chez les rongeurs est une compétence essentielle^{16,18,21,29,36,37}. L’administration de l’EPR n’est pas anodine, et le domaine est divisé sur la technique d’injection la plus efficace. Le protocole que nous décrivons ici est un moyen simple et efficace d’administrer un bolus de cellules EPR par voie sous-rétinienne, et a été utilisé dans le premier essai clinique pour la transplantation d’EPR dérivée de cellules souches³¹. (Le lecteur peut également se référer à un autre article de JoVE par Eberle et al. pour une représentation alternative des injections sous-rétiniennes chez les rongeurs. ³⁸)

La technique décrite dans ce manuscrit ne peut pas être visualisée et le traumatisme est inévitable (comme pour toute technique d’injection sous-rétinienne). Elle est réalisée en faisant un trou juste sous les vaisseaux limbiques et en insérant une aiguille émoussée le long d’une voie transsclérale pour injecter un bolus de cellules sous la rétine diamétralement opposée. La personne qui fait l’injection ressentira une résistance lorsque l’aiguille émoussée touchera la rétine. Cependant, les cellules peuvent être visualisées directement après l’injection, et le degré de décollement de rétine induit peut être déterminé en marquant les cellules EPR avec un marqueur fluorescent transitoire et en les détectant avec un ophtalmoscope à balayage confocal (cSLO). Un système de tomographie par cohérence optique (OCT) peut également être utilisé pour surveiller le traumatisme et identifier facilement le site d’injection.

Protocole

REMARQUE: Tous les animaux ont été traités conformément aux directives éthiques établies par l'Institut de recherche Scripps.

1. Préparation des matériaux pour l'injection (~ 20 min)

1. Solution de dissociation cellulaire pré-chaud (de préférence une qui est inactivé par dilution avec du sérum non), du PBS stérile et le milieu de culture (Tableau 1).
2. Stériliser la seringue avec une aiguille émoussée de démonter les pièces d'ébullition et dans l'eau pendant 15 min.

2. Préparation des cellules RPE pour injection (~ 30 min à 1 h)

1. Détacher les cellules RPE utilisant une solution préchauffée dissociation cellulaire pour 5-8 min à 37 ° C.
2. Grattez les cellules doucement pour libérer celles qui sont encore attachés.
3. Diluer les cellules avec un grand volume de milieu de culture (remplir un tube de 15 ml) pour inactiver la solution de dissociation et les compter.
4. Centrifuger à 800 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules.
5. Remettre en suspension les cellules à 200 000 cellules / ul (à livrer 100 000 cellules dans un volume de 0,5 pi) dans stérile préchauffée PBS et les transférer dans un tube de 1,5 ml.
6. Facultativement, ajouter un marqueur fluorescent transitoire de cellules vivantes et incuber à 37 ° C pendant 30 à 45 min.
7. Chargez la seringue avec une aiguille émoussée avec 0,5 pi de cellules. Injecter les cellules dès que possible.

3. Sous-rétinienne injection (~ 5 min par injection)

NOTE: Si possible, apprendre la technique avec des rats albinos adultes depuis les navires limbe sont beaucoup plus faciles à visualiser. Injecter la solution vert rapide lors de l'apprentissage (avant d'essayer d'injecter des cellules) pour faciliter plus facilement la visualisation du site d'injection.

1. Anesthésier le rongeur. Utilisez injection intrapéritonéale de 100 mg / ml kétamine et 10 mg / ml de xylazine (20 pi / 10 g de corps whuit) sur isofluorane inhalation car il est difficile de manoeuvrer le rongeur et l'injecter dans l'oeil avec le museau de l'inhalateur.
   1. Assurez-vous que l'animal est profondément anesthésié en pinçant une de ses pattes. Se il sursaute, attendre encore plusieurs minutes et essayez à nouveau avant de commencer l'injection sous-rétinien.
2. Placez le rongeur sur le côté afin que l'œil qui sera injecté est confronté le plafond.
3. Sous un microscope de dissection étirer doucement la peau afin que l'œil se ouvre en légère hausse de la prise (de proptosis temporaire) et devient plus accessible en tenant la tête avec deux doigts juste au-dessus de l'oreille et de sa mâchoire et étirer doucement la peau parallèlement aux paupières de sorte que l'œil se ouvre en légère hausse de la prise (voir figure 1C). Ne pas saisir le rongeur trop près de la gorge.
4. Avec une aiguille de pré-stérilisé jetable forte 30 G, faire un trou juste au-dessous du limbe (si les navires sont touchés, saignement be significative et il sera difficile de trouver le trou plus tard) et à un angle pour éviter de toucher l'objectif avec l'aiguille (figure 1D). Évitez de toucher l'objectif avec le aiguille pointue (ou émoussée) ou la formation immédiate de la cataracte se produira.
   NOTE: Les injections fonctionnent mieux avec deux personnes. De cette façon, une personne peut passer la seringue avec l'aiguille émoussée à la personne effectuant l'injection après avoir créé le premier trou avec l'aiguille jetable forte de maintenir l'accent sur la où le trou est.
5. Rétracter l'aiguille jetable forte de l'œil tout en maintenant la poignée sur la tête. Ne oubliez pas exactement où le trou est.
6. Après soit le montage de la seringue pré-chargé avec une aiguille émoussée sur un micromanipulateur ou le tenant par la main, insérez la pointe de la seringue avec l'aiguille émoussée à travers le trou, en prenant également soin de ne pas toucher la lentille et doucement pousser à travers l'œil très doucement jusqu'à ce qu'une résistance se sentir (figure 1D).
7. Keeping tous les mouvements au minimum, injecter attentivement les cellules RPE lentement dans l'espace sous-rétinien.
   REMARQUE: décollement de l'EPR / de la rétine sera induite; ce est inévitable. Cependant, une injection propre minimise le détachement et améliore considérablement les chances de rattachement (figure 1E). Les mouvements exagérés peuvent reculer l'aiguille dans la rétine, et les mouvements latéraux peuvent endommager la rétine. L'utilisation d'une pompe d'injection est facultative, mais permet une livraison très précise.
8. Rétracter la seringue lentement. Appliquer hydratant de gouttes pour les yeux de garder l'oeil hydraté.
9. Continuer à surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il retrouve décubitus sternal. Ne pas laisser animal sans surveillance, ou retourner à une cage avec d'autres animaux d'alerte jusqu'à ce qu'il retrouve décubitus sternal.

Résultats

Nous pouvons livrer une suspension de cellules RPE dans l'espace sous-rétinien de rongeurs rapidement et régulièrement en utilisant la technique décrite dans ce manuscrit. Bien que pas nécessaire, les traumatismes peuvent être considérablement réduits au minimum en utilisant la configuration illustrée avec un micromanipulateur à la figure 1A & B. Maintenir le rongeur comme représenté sur la figure 1C pour une exophtalmie temporaire. Les étapes sont les mêmes se il est effectué a...

Discussion

Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement simple pour réaliser des injections sous-rétiniens de cellules RPE en suspension dans les rats et les souris. Le protocole est facile à apprendre et plus d'expérience avec la technique se traduiront par moins de traumatismes (figure 3, ce qui représente l'un des meilleurs injections), surtout si un micromanipulateur est utilisé (figure 1A). Tout traumatisme peut être contrôlée in vivo avec un système d'ALSC e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Mercaptoéthanol (55 mM)	Gibco  ;	21985-023	50 ml x 1  ;
Scapers cellulaires	VWR	89260-222	Boîtier x 1
CellTracker Green CMFDA	Sondes moléculaires	C34552	50 µ ; g x 20
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190-144	500 ml x 1  ;
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1  ;
Genteal Geldrops Gouttes oculaires lubrifiantes modérées à sévères  ;	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modèle 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringue x 1  ;
Hamilton Aiguille 33 G, 0.5", pointe 3 (acier inoxydable 304)	Hamilton	7803-05	Aiguilles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1  ;
Sérum KnockOut de Remplacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1  ;
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Support magnétique	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Solution d’acides aminés non essentiels 100X  ;	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulateur	Leica Biosystems	3943001	Manipulateur x 1
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Seringues à embout coulissant sans aiguilles BD  ; (3 ml)  ;   ;	VWR	BD309656	pack x 1
aiguilles à usage spécialisé BD  ; (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol	Gibco	12604013	100 ml x 1