Article de méthode

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l'ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

DOI :

10.3791/52259

⸱

3 janvier 2015

 ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les dosages de sphères in vitro sont couramment utilisés pour identifier les cellules souches cancéreuses. Ici, nous comparons les dosages à sphère unique et à plusieurs cellules. Les tests basés sur des cellules uniques plus laborieux ou la supplémentation en méthylcellulose donnent des résultats plus précis, tandis que les tests multicellulaires effectués en milieu liquide peuvent être fortement influencés par la densité cellulaire.

Résumé

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Des années de recherche indiquent que les cancers de l’ovaire hébergent un mélange hétérogène de cellules comprenant une sous-population de cellules dites « souches cancéreuses » (CSC) responsables de l’initiation, de l’entretien et de la rechute de la tumeur après les chimiothérapies conventionnelles. L’identification des CSC ovariens est donc un objectif important. Une méthode couramment utilisée pour évaluer le potentiel de CSC in vitro est le test des sphères dans lequel les cellules sont plaquées dans des conditions de culture non adhérentes dans un milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance et la formation des sphères est notée après quelques jours. Ici, nous passons en revue les protocoles actuellement disponibles pour les tests de cancer de l’ovaire humain et effectuons une analyse côte à côte entre les tests multicellulaires couramment utilisés et un système plus précis basé sur le placage de cellules uniques. Nos résultats indiquent que les essais de sphères multicellulaires et unicellulaires peuvent être utilisés pour étudier la formation de sphères in vitro. Les tests basés sur des cellules uniques, plus laborieux et plus coûteux, sont plus adaptés à l’évaluation fonctionnelle de cellules individuelles et conduisent à des résultats globaux plus précis, tandis que les tests basés sur plusieurs cellules peuvent être fortement influencés par la densité des cellules en plaques et nécessitent des expériences de titrage en amont. La supplémentation en méthylcellulose des essais multicellulaires peut être utilisée efficacement pour réduire les artefacts mécaniques.

Introduction

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Il est de plus en plus évident que les carcinomes ovariens sont composés de mélanges hétérogènes de cellules et hébergent ce que l’on appelle des « cellules souches cancéreuses » (CSC) responsables de l’initiation, du maintien et de la rechute de la maladie après les thérapies cytotoxiques conventionnelles1-3. Par conséquent, le développement de stratégies moléculaires ciblant les CSC ovariens est un objectif important et promet d’améliorer le traitement des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire.

Une condition préalable à la compréhension des caractéristiques moléculaires des CSC est leur isolement fiable des non-CSC. Cependant, l’identification des CSC ovariens semble difficile. Bien que l’expression de CD133 et l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH)4,5 aient été signalées pour marquer les CSC ovariens, certaines données indiquent que ces marqueurs sont instables6. De manière constante, dans le cancer de l’ovaire, à l’exception par exemple du carcinome du sein7, l’expression d’ALDH1 s’associe à un résultat favorable8 et l’expression du marqueur de cellules souches proposé variant CD44 n’a pas de valeur pronostique9. Plus récemment, nous avons montré que l’expression de la protéine SOX2 des cellules souches embryonnaires confère une souche aux cellules de carcinome ovarien10 et qu’une expression élevée de SOX2 s’associe à des carcinomes de l’ovaire et du sein cliniquement agressifs11,12. Par conséquent, dans ce rapport, nous utilisons une construction de rapporteur lentiviral contenant une protéine de fluorescence rouge (RFP) dont l’expression est contrôlée par une région régulatrice de SOX2, comme méthode pour isoler les CSC ovariens présumés.

Par définition, les CSC peuvent à la fois s’auto-renouveler et se différencier, donnant naissance à tous les types de cellules tumorales. Les populations présumées de CSC doivent être analysées dans des tests fonctionnels effectués in vivo. Pour des raisons évidentes, dans les cellules humaines, ces tests fonctionnels se limitent aux tests de xénogreffe, comprenant principalement la transplantation de cellules tumorales humaines chez des souris immunodéprimées10,13.

Une méthode alternative in vitro a été proposée par Brent Reynolds et Sam Weiss, qui ont été les premiers à présenter le test dit de la neurosphère comme un test de substitution évaluant le potentiel souche dans les cellules neurales14. Dontu et ses collègues ont ensuite confirmé l’utilisation de ce test pour l’évaluation du potentiel des cellules souches dans les cellules mammaires15,16. Ici, des cellules mammaires humaines ont été plaquées en différents nombres dans un milieu sans sérum complété par du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF), du B-27 et de l’héparine et cultivées dans des conditions non adhérentes pendant sept à dix jours avant que la formation de la sphère ne soit évaluée par microscopie. En suivant ce protocole avec quelques ajustements dans le nombre de cellules, le milieu de croissance et les suppléments, plusieurs groupes ont exploré le potentiel des cellules souches in vitro de plusieurs types de cancer tels que les tumeurs du sein17, du cerveau18, du pancréas19 et du côlon20. Dans le carcinome ovarien, nous avons récemment rapporté la faisabilité de l’essai des sphères et comparé ses résultats à ceux recueillis dans des modèles de xénogreffes murines in vivo 10. Nous avons constaté que la surexpression de la protéine SOX2 de la cellule souche améliorait à la fois la formation de sphères in vitro et la tumorigénicité in vivo des cellules de carcinome de l’ovaire humain10. Cependant, la fréquence des cellules initiatrices de sphères était plus élevée que la fréquence des cellules initiatrices de tumeurs mesurées in vivo10, ce qui suggère que soit le test de la sphère peut conduire à des résultats faussement positifs pour des raisons techniques, soit, alternativement, le test in vivo peut être inefficace et entraîner des résultats faussement négatifs.

Dans ce rapport, nous analysons plus en détail les dosages de sphères ovariennes multicellulaires, passons en revue les différents protocoles disponibles dans la littérature et les comparons à un test basé sur une seule cellule. Nous montrons que le test basé sur une seule cellule fournit des résultats plus précis et reproductibles que les tests basés sur plusieurs cellules, qui peuvent être fortement influencés par la densité des cellules en placage, à moins que la méthylcellulose ne soit ajoutée aux cultures pour immobiliser les cellules. Cependant, également dans les essais basés sur des cellules uniques, le potentiel d’initiation de la sphère in vitro est observé à une fréquence plus élevée que le potentiel d’initiation de la tumeur in vivo.

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Protocole

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1. Génération des droits de cellules de carcinome de l'ovaire de OVCAR-3 transduites de manière stable avec lentivirus contenant le rapporteur Construct région régulatrice SOX2

  1. Générer des particules lentiviraux par transfection de la lignée cellulaire HEK 293T-emballage avec une construction de rapporteur de reconnaître une région de régulation de la manière décrite SOX2 10,21.
    REMARQUE: La construction de rapporteur contient en outre un domaine de déstabilisation du système ProteoTuner bouclier avant de la protéine de fluorescence tdTomato. Shield1 se lie au domaine de déstabilisation empêchant ainsi le protéasome de dégrader la protéine de fluorescence 22.
  2. Transduire des cellules OVCAR-3 avec des particules lentivirales sur une période de temps de 24 heures. Par la suite, retirer le surnageant viral et laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) et mises en culture dans du milieu complet (RPMI complété avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine).
  3. 48 h plus tard, 10 ng / ml puromycine a été ajouté aux cultures et maintenue pendant 5 jours pour permettre la sélection de cellules transduites correctement.

2. Préparation de la cellule de tri et de Placage

  1. Ajouter Shield1 au 1: 1000 dilution 24 heures avant le tri de cellules. Utilisation transduites de manière stable des cellules OVCAR-3 sans traitement Shield1 comme témoins négatifs (Figure 1). Aspirer le milieu de flacon, laver les cellules avec PBS 1x et Trypsiniser cellules avec 0,05% de trypsine-EDTA pendant 3 min.
  2. Arrêtez la trypsine en utilisant un milieu complet (voir ci-dessus), compter le nombre de cellules, les cellules de centrifugation à 300 xg à température ambiante (15-25 ° C) pendant 5 min.
  3. Décanter le surnageant et remettre les cellules soigneusement 0,5 à 1 ml de PBS stérile.
  4. Utilisez 40 um filtre de bouchon de crépine de cellules pour obtenir une suspension à cellule unique.
  5. Ajuster le nombre de cellules de 5 millions de cellules par ml.
  6. Préparer faible fixation des plaques à 96 puits ultra avec 100 ul de milieu sphères (MEGM supplémenté avec des facteurs de croissance, les cytokines, et les suppléments,B-27, l'héparine de sodium; ou DMEM / F12 supplémenté en facteurs de croissance, cytokines, et des suppléments, B-27, l'héparine de sodium avec ou sans addition de 1% de méthylcellulose, voir également le tableau 1). Ajouter éventuellement des antibiotiques dans le milieu à une concentration de 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine afin de minimiser le risque de contamination possible.
  7. Trier DP + et les cellules RFP- préparés dans des plaques à 96 puits à partir de ci-dessus, une cellule par puits (single sphères de dosage à base de cellules) et 100 cellules par puits de dosage (multi sphères à base de cellules), respectivement. Effectuer tri sur disponible dans le commerce trieur de cellules (voir Matériaux) en utilisant le mode unique de cellules, Trier configuration: 100 μ buse, la pression de la gaine 20 psi, et le masque de rendement 0, masque pureté 32, masque de phase 16.
  8. Évaluer l'efficacité de placage en marquant au microscope puits contenant des cellules (pour le dosage à base de cellules unique) et en comptant le nombre de cellules dans des puits individuels (pour le dosage à base de cellules multiples; Figure 2 ).
  9. Incuber les cellules dans des conditions normales dans les sphères moyennes (pour la composition voir l'étape 2.6) à 37 ° C et 5% de CO 2. Supplément quotidien bFGF (20 ng / ml) et de l'EGF (20 ng / ml).
  10. Après une semaine, compter le nombre de nouvelles sphères tumorales en utilisant un microscope standard avec un grossissement de 10X ou 4X et un microscope à fluorescence pour détecter le signal de fluorescence à partir du système rapporteur intégré. Comptez sphères avec un diamètre supérieur à 100 um comme «grands» des sphères et des sphères d'un diamètre de 50 à 100 um comme "petits" domaines (Figure 3). Assurez-vous que vous comptez sphères réelles et non cellulaires grappes.
    NOTE: Dans les essais à base de cellules simples formation sphère est plus facile de marquer au microscope après 10 (contre 7) jours de culture.
  11. Calculer la proportion de cellules de la sphère formation en DP + et les cellules respectivement RFP- dans des dosages à base de cellules simples (une plaque de 96 puits pour chaque expérience individuelle) ou plusieurs cellules-basphères sed essais (un puits pour chaque expérience individuelle) présentés par Shaw et al. 16
    REMARQUE: Proportion de cellules formant sphère (en%) = (nombre de sphères) / (nombre de cellules ensemencées) x 100

3. Le passage en série des Sphères

  1. Placez le contenu de chaque puits dans un tube et centrifuger stérile appropriée à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Pour plusieurs sphères dosages à base de cellules, rassembler les sphères d'un puits. Laver le bien 3-5 fois avec du PBS et centrifuger 2 min plus. Pour sphères simples tests à base de cellules, recueillir des sphères individuelles. En raison du faible nombre de cellules, utilisez tubes de 1,5 ml pour centrifugation et lavage étapes.
  2. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de 0,05% de trypsine-EDTA.
  3. Afin d'obtenir une séparation optimale des cellules, incuber la suspension de cellules à 37 ° C pendant 5 min dans un agitateur doux. Optimiser trypsinisation temps pour votre lignée cellulaire à taux de mort cellulaire inférieure: si aucune grandesphères est trituré visible doucement à l'aide d'une pipette de 100 pi. En cas de grosses sphères sont toujours présents, incuber avec de la trypsine autre 3 min, puis passez à l'étape de trituration. En cas de simple tests cellulaires veillez à optimiser le temps pour le rendement cellulaire optimal de cellules vivantes au cours de l'étape de traitement à la trypsine.
  4. Pour inactiver la trypsine, ajouter 500 pi de milieu complet et centrifuger à 300 g pendant 10 min, dans le cas de dosages cellulaires simples, centrifuger pendant 2 min supplémentaires.
  5. Éliminer les cellules surnageant et remettre soigneusement dans le milieu des sphères.
  6. Utiliser un filtre de plafonnement des tamis cellulaire de 40 um pour obtenir une suspension monocellulaire.
  7. Dans le cas de l'utilisation DP + et les cellules RFP- dans des dosages cellulaires bassed multiples, évaluer le pourcentage de cellules présentant une fluorescence dans chaque puits après remise en suspension par analyse cytomètre de flux.
  8. Pour les essais de réensemencement série de cellules individuelles, semences 1 cellule par puits dans une nouvelle plaque de fixation basse ultra 96 ​​puits préparés comme détaillé ci-dessus. D'une sphère individuelle, ensemencer environ 20 puits individuels. Pour les essais de réensemencement de multiples sphères primaires à base de cellules, les cellules obtenues à partir de graines et une des sphères primaires dans une nouvelle plaque à 96 puits et compter le nombre de cellules par microscopie lendemain.
  9. Évaluer la proportion de cellules de la sphère formant dans les sphères secondaires essais utilisant la formule décrite à l'étape 2.11.

4. Analyse des résultats

  1. Analyser les résultats des expériences réalisées en triple indépendants et utiliser le test t de Student recto-verso pour analyser les valeurs normalement distribués et autrement Mann-Whitney-Tests pour l'analyse statistique.

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Résultats

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Dans les sphères des analyses classiques, près de 40% des DP + OVCAR-3 cellules contre 20% des cellules RFP- a donné lieu à une sphère de tumeur individuelle dans le dosage des sphères primaire (figure 4A). En outre, les sphères formées par DP + cellules sont plus grandes en taille que ceux qui sont formés par des cellules RFP-.

Lorsque plaqués dans des essais à base de cellules simples, les cellules de la DP + également formés plusieurs sphères que les cellules RFP-, confir...

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Discussion

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Sphères cultures sont une méthode largement utilisée pour analyser le potentiel de cellules souches du cancer et enrichir en cellules souches-comme dans un large éventail de cellules tumorales humaines 15,25,26. Dans ces conditions de culture, les cellules cancéreuses qui ne ont pas la capacité d'auto-renouvellement se attend à différencier et, éventuellement, subir une mort cellulaire. Bien qu'ils puissent former initialement des agrégats de cellules ou même des sphères de tumeurs primaires dans des ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été financée par une subvention de la Baden-Württemberg Stiftung (Programme II sur les cellules souches adultes) attribuée à C.L. Nous remercions la Dre Martina Konantz pour sa contribution critique et son examen du manuscrit. Nous remercions Emmanuel Traunecker et Toni Krebs de l’Hôpital universitaire de Bâle (DBM) pour leur aide dans le tri FACS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de fixation basseCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulineLonzaCC-4136SingleQuots&trade ; Kit
HydrocortisoneLonzaCC-4136SingleQuots&trade ; Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots&trade ; Kit
EGFSigmaE9644concentration finale : 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bconcentration finale : 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044concentration finale : 1X
Heparin-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02dilution 1:1 000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsine-EDTAGibco25300-054
Dulbecco' s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontech632189dilution 1:1 000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (poudre)Gibco42400-010
MéthylcelluloseSigmaM0387
Dichlorhydrate de puromycineApplichemA2856
Cell trieurBDAria III trieur de cellules Analyseur
FACSCytomètre en flux BDAccuri c6
MicroscopeOlympusIX50 Osiris

Références

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Mots-clés

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