Article de méthode

Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

DOI :

10.3791/52307

⸱

18 janvier 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

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Résumé

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Ce protocole décrit des techniques d’isolement de cellules vivantes et de culture primaire de lignées cellulaires myogéniques et fibroblastiques à partir de tissus musculaires ou cutanés. Une technique d’immortalisation de ces lignées cellulaires est également décrite. Dans l’ensemble, ces protocoles fournissent un outil fiable pour générer et préserver des cellules dérivées de patients pour des applications en aval.

Résumé

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La génération de lignées cellulaires spécifiques au patient représente un outil inestimable pour la recherche diagnostique ou translationnelle, et ces cellules peuvent être collectées à partir de tissus de biopsie cutanée ou musculaire disponibles lors du bilan diagnostique du patient. Dans ce protocole, nous décrivons une technique d’isolement de cellules vivantes à partir de petites quantités de tissu musculaire ou cutané pour la culture cellulaire primaire. De plus, nous fournissons une technique pour l’immortalisation de lignées cellulaires myogéniques et de lignées cellulaires de fibroblastes à partir de cellules primaires. Une fois les lignées cellulaires immortalisées, il est possible d’obtenir une expansion substantielle des cellules dérivées de patients. Les cellules immortalisées se prêtent à de nombreuses applications en aval, y compris le criblage de médicaments et la correction in vitro de la mutation génétique. Dans l’ensemble, ces protocoles fournissent un outil fiable pour générer et préserver des cellules dérivées de patients pour des applications en aval.

Introduction

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Le diagnostic moléculaire a considérablement évolué au cours des 20 dernières années. L’ADN génomique est maintenant systématiquement isolé à partir d’expectorations ou d’écouvillons de joue, alors que dans le passé, il nécessitait une prise de sang. Avec le délai d’exécution rapide actuel et la facilité de séquençage des gènes, de nombreuses mutations de la maladie sont régulièrement identifiées sans qu’il soit nécessaire de procéder à des tests supplémentaires. Dans le cas du diagnostic des maladies musculaires, l’identification de dizaines de nouveaux gènes au cours de la dernière décennie responsables de la dystrophie musculaire ou de la myopathie a radicalement changé la façon dont ces maladies sont diagnostiquées 1,2. À l’heure actuelle, des dizaines de gènes ont été identifiés comme causes de dystrophie musculaire et de myopathie congénitale, bien que les mécanismes par lesquels bon nombre de ces gènes produisent la maladie restent incertains. En particulier, les maladies rares constituent un défi en raison de la petite taille des populations de patients. Pour ces cas, ainsi que pour des maladies plus courantes, la génération d’outils stables qui facilitent les études sur le mécanisme de la pathogenèse et le criblage de médicaments thérapeutiques est hautement souhaitable.

Malgré les progrès spectaculaires du diagnostic de l’ADN, des biopsies musculaires sont toujours pratiquées pour établir le diagnostic primaire chez de nombreux patients chez lesquels une maladie métabolique ou musculaire primaire est suspectée. Lorsqu’une biopsie musculaire est nécessaire, elle offre la possibilité d’un diagnostic et d’un prélèvement de tissus de recherche supplémentaires avec un risque de morbidité supplémentaire minimal pour le patient. Comme il existe un certain nombre d’utilisations pour chaque échantillon de tissu, il est hautement souhaitable d’établir des techniques de culture cellulaire primaire à l’aide de tissus chirurgicaux qui sont simples, efficaces et nécessitent des quantités minimales de tissu. Un bon triage des biopsies musculaires ou cutanées est nécessaire pour maximiser l’isolement des cellules primaires des tissus et l’entreposage à long terme du matériel vivant. De plus, la recherche sur les cellules souches et le criblage de médicaments sont très prometteurs pour le développement de thérapies pour de nombreuses maladies à l’aide de tests cellulaires 3,4.

Nous décrivons ici des méthodes d’isolement de cellules primaires à partir de biopsies musculaires ou cutanées humaines. De plus, nous incluons un protocole d’immortalisation des cellules myogéniques, qui est utile pour générer un grand nombre de cellules à partir d’un individu. Ces cellules peuvent être utilisées pour des applications en aval, telles que les criblages de médicaments personnalisés, qui sont autrement irréalisables avec le faible nombre global de cellules obtenues à partir de tissus primaires.

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Protocole

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NOTE: Protocoles pour la collecte de tissus humains doivent être examinés et approuvés par le comité institutionnel de la CISR. Collection de rebut, les tissus humains de-identifié a été approuvé par l'Hôpital pour enfants de Boston et des comités hôpital Brigham and Women de la CISR. Les méthodes décrites ci-dessous ont été appliquées pour l'isolement de cellules myogéniques de dépersonnalisés, jetés tissus. Les méthodes décrites sont applicables aux tissus prélevés à partir de matériaux patients consenti.

1. Isolement cellulaire

  1. La dissociation de la biopsie musculaire et la purification de cellules myogéniques
    1. Pré-peser un tissu plaque de culture de 10 cm dans une culture tissulaire biosécurité capot, puis re-peser la plaque contenant la biopsie musculaire pour calculer la quantité de tissu à être dissocié.
    2. Utilisation de scalpels stériles, tissus mince musculaire finement et ajoutez quelques gouttes de HBSS stérile 1x à empêcher le tissu de se dessécher.
    3. Ajouter 3,5 ml chacune de dispase II et de la collagénase D par gramme de tissu musculaire à être digérés. Pipeter le tissu haché et une solution d'enzyme à travers une pipette de 25 ml stérile à plusieurs reprises. Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 15 minutes et à digérer le tissu jusqu'à ce que la suspension passe facilement si une pipette stérile 5 ml.
      REMARQUE: la dissociation des tissus est habituellement obtenue par digestion enzymatique dans les 45 à 90 min. Se il vous plaît se référer à la section 'Les résultats représentatifs de pour plus de détails.
    4. Ajouter deux volumes de milieu de croissance stérile à un tissu dissocié, filtre à travers un tamis de 100 um de la cellule sur une 50 ml à tubes coniques et granulés pendant 10 min à 329 x g (~ 1100 tours par minute), la température ambiante. Se il vous plaît se référer à la table des matières pour la composition des médias.
    5. Remettre en suspension le culot dans 1 volume de milieu de croissance stérile et ajouter sept volumes solution rouge sang de lyse cellulaire. Filtrer la solution à travers un tamis cellulaire 40 um, puis sédimenter tes cellules pendant 10 min à 329 xg, la température ambiante.
    6. Compter les cellules dans un hémocytomètre et remettre en suspension les cellules dans du HBSS 1x 0,5% de BSA à une concentration de 1 x 10 6 cellules / 100 ul. Mettez de côté ~ 250 000 cellules dans un seul tube qui seront utilisés comme un contrôle négatif (non colorées). Régler une seule couleur colorées tubes de contrôle de côté supplémentaires pour l'iodure de propidium et de CD56, qui sont nécessaires pour le bon déclenchement de cellules positives CD56 par tri FACS. Se il vous plaît se référer à la cellule manuels de tri ou de consulter FACS tri experts des installations de base pour assurer des contrôles appropriés sont inclus.
    7. Colorer les cellules à trier avec 5 pi / 10 6 cellules d'anticorps anti-CD56. Incuber tous les échantillons (y compris les contrôles) sur la glace pendant 30 min.
    8. Laver les échantillons dans 10 ml 1x HBSS et un culot de cellules pendant 10 min à 329 xg (~ 1100 rpm) dans une centrifugeuse réfrigérée, 4 ° C la température.
    9. Ajouter l'iodure de propidium à une concentration finale de 1 pg / ml de l'échantillon à être sorTed d'exclusion des cellules mortes. On purifie des cellules positives CD56 de cellules myogéniques non myogéniques en utilisant le trieur de cellules activé par fluorescence.
  2. La dissociation de la biopsie de la peau
    NOTE: fibroblastes dermiques peuvent être isolés à partir d'un coup de poing de la peau des patients lors des biopsies musculaires ne sont pas disponibles. Les fibroblastes dermiques peuvent être utilisés comme biomatériau pour de nombreuses études, y compris la transduction avec MyoD pour générer des cellules myogéniques. En outre, les fibroblastes dermiques peuvent être utilisés pour générer des cellules iPS, qui peuvent être différenciées en divers types de cellules pour une étude plus approfondie.
    1. Transports la biopsie de la peau au laboratoire dans un milieu de transport. Une fois que l'échantillon est reçu, effectuer la culture primaire dès que possible. Si la culture primaire ne peut être établie le même jour, stocker l'échantillon à température ambiante jusqu'au lendemain.
    2. Transférer la biopsie de la peau à une boîte de Pétri de 35 mm dans la hotte stérile à flux laminaire.
    3. Rincer la biopsie de la peau dans une boîte de Pétri avec une stérilex PBS pour éliminer le sang et les débris. Retirer le tissu adipeux avec un scalpel stérile.
    4. Ajouter une solution de collagénase de 2 ml et hacher le tissu avec un scalpel, incuber à 37 ° C pendant 45 min à 1 h, en fonction de la taille du tissu.
    5. Transférer le tissu digéré dans un tube conique de 15 ml, rincer la boîte de Pétri avec 2 ml de milieu de culture de fibroblastes de deux fois, et de recueillir le milieu dans le même tube.
    6. Pellet les cellules à 200 xg pendant 5 min à température ambiante.
    7. Jeter le surnageant et laver le culot avec 3 ml de milieu de fibroblastes de retirer la collagénase, puis les cellules granules nouveau. Se il vous plaît se référer à la table des matières pour la composition des médias.
    8. Répétez l'étape 1.2.7 une fois de plus.
    9. Remettre en suspension le culot dans des cellules de fibroblastes de taille et de la plaque 5 ml sur un T25 culture tissulaire stérile ballon. Incuber le flacon à 37 ° C avec 5% de CO 2.
    10. Évaluer la culture pour la fixation des fibroblastes et la croissance au cours des 1-3 prochains jours.
      NOTE: Certains petits morceaux de tissus peuvent également se attacher à la plaque et les fibroblastes migrer hors de ces morceaux de tissu.
    11. Maintenir la culture dans les mêmes conditions jusqu'à ce que les fibroblastes sont cultivés jusqu'à confluence d'environ 80%.
    12. Recueillir fibroblastes par trypsinisation et transfert sur des flacons de culture frais d'expansion supplémentaire. Effectuer trypsinisation par lavage des cultures 3 fois en PBS 1x sans Ca ++ et Mg ++. Ajouter la trypsine-EDTA (voir Matériaux Table) pour les cellules (2 ml / fiole T25) pendant 2 minutes à 37 ° C.
    13. Diviser les cellules individuelles dans des flacons supplémentaires. Si des morceaux de tissu restent attachés aux flacons T25 originaux, ajouter 5 ml de milieu de culture frais à ce ballon en plus de fibroblastes migrent hors continuellement.
      NOTE: La culture de fibroblastes élargi peut être congelé bas que P1 et stocké dans l'azote liquide pour des expériences futures.

2. L'immortalisation des cellules myogéniques

  1. cellules Plate 5000000 Phoenix écotrope emballage (PE) la nuit dans une plaque de culture de tissu de 10 cm stérile dans DMEM et moyennes 199 dans un rapport de 4: 1, complété avec du sérum de veau à 10%.
  2. les cellules d'alimentation 30 min avant la transfection avec 5 ml de milieu frais supplémenté avec 10 mM de caféine.
  3. Homogénéiser un mélange de 2 pg d'ADN de plasmide à partir d'une préparation midi (CDK4 ou plasmide hTERT) et Polyjet et incuber à température ambiante pendant 15 min, tel que recommandé par le fabricant.
  4. Ajouter le mélange plasmide / Polyjet aux cellules PE nuit.
  5. Cellules nourrir avec du milieu frais (DMEM et moyennes 199 dans un rapport de 4: 1, complété avec du sérum de veau à 10%). Douze heures plus tard, recueillir le surnageant contenant le virus et la filtrer à travers un filtre de taille de pore de 0,45 um.
  6. Utiliser 1 ml de surnageant recueilli pendant une nuit à infecter la cellule d'encapsidation amphotrope PA317 ligne 5 et à obtenir une lignée de cellules productrices de virus stables après sélection avec soit 0,5 mg / ml de néomycine (G418) pour CDK4 ou 0,5 mg / ml d'hygromycine pour hTERT.
  7. Préparer travailler surnageants viraux par la croissance des cellules d'emballage stables à près de confluence, puis en récoltant le surnageant chaque matin, soir et matin pour trois récoltes.
  8. Filtrer les surnageants viraux et soit utiliser directement ou de les diviser en aliquots de 1 ml et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Notez que surnageant viral perd 50% d'efficacité de l'infection par chacun de congélation-décongélation. Ne oubliez pas de blanchir de lavage avant de jeter tout ce qui a touché les particules virales.
    NOTE: La lignée cellulaire PA317 virus produisant stable peut être congelé et maintenu à -150 ° C pour le stockage permanent (milieu de congélation est de 10% de DMSO; 90% de sérum).
  9. Plate-purifiée FACS des cellules myogéniques (décrite dans les étapes 1.1 à 1.9) à une densité de 5 x 10 4 cellules / puits dans des plaques à 6 puits revêtues de gélatine à 0,1%. Se assurer que les cellules sont fixées à la plaque avant de procéder à l'infection virale.
  10. Ajouter 400 ul filtré, freshly produit surnageant viral ou aliquotes congelées à chaque plaque à six puits nuit (garder deux puits comme témoins).
  11. Changer moyen en alimentant les cellules avec 2,5 ml / puits de milieu frais musculaire (4: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et le milieu 199 supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 15%; 0,02 M tampon HEPES; 1,4 mg / L de vitamine B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L de dexaméthasone, 2,5 ug / l facteur de croissance des hépatocytes et 10 ug / L fibroblastes basique facteur de croissance). Jeter les médias et les pipettes contenant les particules virales dans un récipient de blanchiment. Laissez cellules dans le même milieu pendant 3 jours pour se remettre de l'infection, puis traitent pour la sélection en utilisant soit 400 pg / ml de néomycine (infection de CDK4) ou 300 pg / ml d'hygromycine (infection de hTERT).
  12. Maintenir cellules dans la sélection des médicaments jusqu'à ce que les cellules dans le plat de commande filière (1-2 semaines).
  13. Passage cellules avant qu'elles ne deviennent confluentes (60-80% de confluence; utilisant 0,05% de trypsine EDTA), même pendant la selectisur la période. Réensemencement cellules dans plusieurs plats 10cm avec un milieu de myoblastes frais (comme décrit dans 2.11) complétés avec le médicament de sélection. Maintenir des cellules immortalisées sélectionnées comme étant une population hétérogène ou cloner d'obtenir un fond génétique complètement homogène (même de l'insertion du transgène dans chaque cellule).
  14. Effectuer la sélection clonale utilisant les étapes suivantes:
    1. Ensemencer les cellules à une faible densité (par exemple 300 à 500 cellules dans des plats de 10 cm) et les maintenir pendant environ deux semaines, jusqu'à ce que de petites colonies sont formées (10 à 20 cellules).
    2. Enlever la plupart du milieu à ce point, laissant seulement un film mince pour empêcher les cellules de se dessécher.
    3. Placez un anneau de clonage (avec une fin trempé dans la graisse à vide de silicone) sur chaque clone désiré et ajouter quelques gouttes de trypsine / EDTA.
    4. cellules de récolte une fois qu'ils sont arrondis en aspirant soigneusement les cellules en utilisant une pointe de 1 ml ou une pipette Pasteur et de les transférer à la plus petite pla multipuits disponibleste (96 ou 48, ou 24 plaques de 12 puits).
    5. Développer clones comme nécessaire pour éviter la confluence locale.

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Résultats

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La figure 1 illustre certaines des étapes clés impliquées dans la dissociation de tissu primaire: le montant exact du tissu est pesé dans un plat culture de tissus de Pétri stérile (Figure 1A, B). Le tissu est ensuite finement hachée à l'aide de scalpels stériles, jusqu'à ce qu'une suspension de tissu est obtenu (figure 1C, D). Après l'addition des enzymes de la digestion, les muscles primaire dissociation tissulaire est habituellement obtenue par digestion enzymatique ...

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Discussion

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Cellules comme une ressource utile

L'isolement et la culture de populations de cellules myogéniques est extrêmement utile lors de l'établissement des phénotypes de la maladie ou dans des modèles in vitro de la maladie. La procédure d'isolement des cellules myogéniques décrite ici permet l'isolement des myoblastes et fibroblastes à partir d'échantillons de muscle squelettique, qui peuvent ensuite être propagées, différenciée, ou immédiatement analysés. St...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette publication est financée par Cure CMD, une subvention de l’Association Contre Les Myopathies (AFM) (projet 16297), et par les National Institutes of Health (subventions numéros K08 AR059750, L40 AR057721 et 2R01NS047727).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement
Tissus  ; cagoule de biosécurité pour la cultureBaker Company, Inc.Modèle SterilGuard Hood
Centrifugeuse de paillasse, tel que le modèle Beckman.Beckman CoulterModèle Allegra 6RSi le tri cellulaire est effectué, une centrifugeuse avec réfrigération est préférable
MicroscopeNikonModèle Eclipse TS100
Incubateur de culture tissulaire, connecté à une source de CO2Forma Scientific  ;Trieur
de cellules activé par fluorescence (FACS)Becton DickinsonModèle Aria
Réactifs pour l’isolement des myoblastes primaires à partir de la
IIRoche Applied Science#04942078001Préparez une solution de chaussette de 2,4U/ml dans de
la collagénase DMEM D  ;Roche Applied Science#088882001Préparez une solution mère de 10 mg/ml
1x Sterile Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS), sans calcium ni magnésiumGIBCO Life Technologies#14185-052
Albumine sérique bovine, fraction VSigma#05470Préparez une solution stérile de 1X HBSS 0,5 % BSA pour le tri FACS
Milieu de croissance stérile pour myoblastes : Dulbecco' s Aigle modifié' s Milieu (DMEM) avec un taux élevé de glucose (4,5 g) complété par 30 % de sérum fœtal bovinGIBCO Life Technologies11965-092L-glutamine
Qiagen158904
Propidium Stock d’iodure 10 mg/mlSigmaP4170Préparez la solution mère en diluant la poudre dans de l’eau distillée stérile
Anticorps anti-CD56 humain pour la cytométrie en fluxBiolegend318310Anticorps conjugué à l’APC, d’autres marqueurs sont disponibles
Réactifs pour l’immortalisation des myoblastes
Emballage écotrope Lignée cellulaire PECell BiolabsRV-101
Emballage amphotrope Lignée cellulaire PA3174Cell BiolabsRV-102
Gélatine de peau de porcSigmaG1890-500gPréparez une solution mère de gélatine à 0,1 % dans de l’eau. Enduire le plat avec la solution à 37° ; C pendant une heure. Retirez la solution et ajoutez du milieu.
PolyJet ;SignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
les plasmides pBabe contenant mCDK4 et hTERTne sont pas disponiblesle commerce Stadler et al, 2013
Qiagen plasmide midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life Technologies  ;Moyenne 199 (31150022)
Dulbecco' s medium Eagle modifié (DMEM)Life Technologies  ;DMEM (11965-092)Mélange 4:1 DMEM :199
Milieu de croissance du myoblaste : 4:1 Dulbecco' milieu Eagle modifié (DMEM) et Medium 199 complétés par 15 % de sérum de bovin fœtal ; 0,02 M tampon HEPES ; 1,4 mg/L de vitamine B12 ; 0,03 mg/L de ZnSO4, 0,055 mg/L de dexaméthasone, 2,5 &mu ; g/L de facteur de croissance hépatocytaire et 10 &mu ; g/L de facteur de croissance des fibroblastes bêta.les technologies du vivant (DMEM, F199) ; Atlanta Biological (FBS) ; Invitrogen (Hepes) ; Fisher (sulfate de zinc) ; Sigma (Vit.B12, Dexaméthasone) ; Chemicon international (HGF) ; Biopionnier (betaFGF)  ;#15630-080 (Hepes) ; #Z68-500 (ZnSO) ; #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex) ; GF116 (EFC) ; HRP-0011 (bFGF).  ;Préparer le milieu et la solution mère de vitamine B12 (20 mg/ml) ; Sulfate de zinc (60µ ; g/ml) ; Dex (55µ ; g/µ ; l) séparément pour une utilisation plus facile. Solution mère HGF (5µ ; g/ml) et FGF (20µ ; g/ml) doit être ajouté fraîchement chaque semaine à la concentration finale de travail.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
Anticorps à chaîne lourde de myosine pour l’immunomarquageBanque d’hybridomes développementauxMF20Clone MF20
Anticorps Desmin pour l’immunomarquageThermo ScientificMS-376-S0Clone D33
Sérum de chevalInvitrogen26050-088
Réactifs pour l’isolement des fibroblastes cutanés primaires
Milieu de transport : RPMI 1640 complété par 10 % de sérum de bovin fœtal et 0,2 % de pénicilline/streptomycineMilieu RPMI 1640 : GIBCO Life Technologies11875-093
Milieu de culture primaire de fibroblastes humains : RPMI 1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de sérum de veau fœtal: Thermo ScientificSH30071.03
Solution de collagénase : Collagénase de type 2 (100 mg) remise en suspension dans 12,5 ml de milieu de culture de fibroblastes et stérilisée par filtreWorthington4176
Tampon phosphate stérile 1X sans solution saline (PBS) sans calcium ni magnésiumLonza17-516F
Matériaux pour l’isolement des myoblastes primaires
de 50 ml et 15 ml GeneMate/BioexpressC-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Scalpels stérilesAspen Surgical372610
HémocytomètreHausser Scientific1492
Pipettes stériles de 5, 10 et 25 mlBellco glass1226-05010 (5 ml) ; 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)Les pipettes réutilisables sont lavées, bouchées en coton et autoclavées avant utilisation
Boîtes en plastique stériles traitées pour culture tissulaire (10 cm)BD Falcon353003
Filtres stériles à cellules en nylon (100 µ ; m et 40 & micro ; taille m)BD Falcon352340 (40µ ; m); 352360 (100 et micro ; m)
  ; Matériaux pour l’immortalisation des
Stérile 0,45 & micro ; m filtersMilliporeSLHV013SL
Anneaux de clonageCorning#3166-8À nettoyer et à autoclaver avant et après utilisation
Matériaux pour lignées cellulaires de fibroblastes  ;
Boîtes stériles en plastique traitées pour culture tissulaire de 35 mmGreiner bio-one628160
Scalpels stérilesDeRoyalD4510A
Gourdes stériles pour culture tissulaire T25Techno Plastic Product, TPP90026vendues aux États-Unis par MIDSCI
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
dispase tissulaire Contient une solution de lyse des globules rouges primaires dans Tubes coniques stériles myoblastes

Références

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Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

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Stacy C. Cossette

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Stacy A. Cossette

Mots-clés

Isolement par biopsie musculaireimmortalisation de lign e cellulaireculture cellulaire primairepurification par FACSdiff renciation cellulaire myog niquesurexpression de CDK4expression de hTERTproduction de surnageant virals lection antibiotiquetechnique du cercle de clonage

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