Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche

Résumé

Ce protocole décrit la mesure de la contraction isométrique dans une préparation isolée de muscle lisse, à l’aide d’un système de bain de tissus isolé et d’une acquisition de données informatisée.

Résumé

Les dosages à bain de tissus isolés sont un outil pharmacologique classique pour évaluer les relations concentration-réponse dans une myriade de tissus contractiles. Bien que cette technique soit mise en œuvre depuis plus de 100 ans, la polyvalence, la simplicité et la reproductibilité de ce test lui permettent de rester un outil indispensable pour les pharmacologues et les physiologistes. Les systèmes de bain de tissus sont disponibles dans un large éventail de formes et de tailles, ce qui permet à un scientifique d’évaluer des échantillons aussi petits que des artères mésentériques murines et aussi grands que l’iléon porcin, voire plus. Au cœur de l’essai à bain tissulaire isolé se trouve la capacité de mesurer les changements dépendants de la concentration de la contraction isométrique, et la façon dont l’efficacité et la puissance des agonistes contractiles peuvent être manipulées par des concentrations croissantes d’antagonistes ou d’inhibiteurs. Même si les principes généraux restent relativement similaires, les progrès technologiques récents permettent encore plus de polyvalence à l’essai de bain tissulaire en intégrant des logiciels informatisés d’enregistrement et d’analyse de données. Cette vidéo démontrera la fonction du bain de tissu isolé pour mesurer la contraction isométrique d’un muscle lisse isolé (dans ce cas, les anneaux d’aorte thoracique de rat), et partagera les types de connaissances qui peuvent être créées avec cette technique. On y trouve des descriptions détaillées de la dissection et de la préparation du tissu aortique, du placement des anneaux aortiques dans le bain tissulaire et de l’équilibrage adéquat des tissus avant l’expérimentation, des tests de viabilité tissulaire, de la conception et de la mise en œuvre de l’expérience, ainsi que de la quantification des données. Aorta sera connecté à des transducteurs de force isométriques, dont les données seront capturées à l’aide d’un convertisseur analogique-numérique disponible dans le commerce et d’un amplificateur de pont spécialement conçus pour être utilisés dans ces expériences. Le logiciel d’accompagnement de ce système sera utilisé pour visualiser l’expérience et analyser les données capturées.

Introduction

La discipline de la pharmacologie a utilisé le système de bain de tissu isolé depuis plus de 150 ans. La polyvalence de ce système a permis aux scientifiques à travers le monde pour caractériser les récepteurs et signal du récepteur de transduction, avec cette connaissance à la base de thérapies qui ont traité des millions de personnes souffrant de maladies ou de troubles tels que l'hypertension, l'insuffisance cardiaque, le diabète, les maladies gastro-intestinal, de la vessie dysfonction, l'asthme, et de troubles de la déglutition, pour ne en nommer que quelques-uns. À ce jour, le bain de tissu isolé reste un aspect important du développement de médicaments et la recherche fondamentale, car elle permet le tissu de fonctionner comme un tissu. Dans cette leçon JoVE, un protocole officiel est partagée pour démontrer une expérience visuelle et virtuelle en utilisant les données d'une expérience isolée de tissu de bain qui mesure la contraction isométrique, qui permet la caractérisation du récepteur.

Le principal avantage de cette technique est que le tissu est une visnd fonctions en tant que tissu ensemble, avec un résultat physiologique (contraction ou la relaxation) qui est pertinent pour le corps. Ce est une synthèse des étapes (sur les interactions médicament-récepteur, transduction du signal, la deuxième génération de messagerie, les changements dans l'excitabilité musculaire lisse, et les changements dans la fonction des tissus). Alors que d'autres techniques permettent l'étude de chacune de ces étapes (par exemple, la liaison de radioligand pour l'affinité du médicament, la mesure de messagers secondaires), la technique du bain de tissu isolé permet une intégration de l'ensemble de ces étapes ^1. Un autre avantage est que le maintien de la fonction des tissus permet de calculer des variables pharmacologiques importantes qui sont plus significative dans un tissu par rapport à un cadre cellulaire; il se agit de plus près à la façon dont les médicaments examinés travailleraient dans le corps dans son ensemble.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures décrites dans ce document sont effectuées conformément aux directives établies par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université d'État du Michigan.

Préparation 1. Système et configuration

1. Ajouter 5 L d'une solution de sel physiologique (PSS), qui est la quantité nécessaire pour une expérience de contraction de bain de tissu qui utilise jusqu'à 50 ml bains de tissus; voir Tableau 2 pour PSS recette. Calculer le volume total requis en multipliant le nombre de bains de tissus fois le volume du bain et en multipliant ensuite par le nombre de lavages de tissus est requise.
   1. Utilisez le Tableau 2 comme un guide pour faire PSS. Dissoudre les sels dans environ quatre litres d'eau. REMARQUE: HPLC - l'eau de type I est recommandé
   2. Ajouter 8 ml d'une solution de CaCl ₂ M (147 g / L si l'on utilise le sel de dihydrate) à la solution, de sorte que la solution finale est de 1,6 mM de calcium.
   3. PSS la solution de Quantum à 5 L.
2. Préchauffer le système de bain de tissu à 37 ° C par mise sous tension du bain d'eau chauffée à recirculation. Etape critique: Chaque composant du système est chemise d'eau, se assurer qu'ils sont connectés en série les uns aux autres. Le sens de circulation est essentielle - veiller à ce que les débits d'eau dans chaque composante au plus bas connexion barbelés et sur la connexion au fer barbelé le plus élevé.
3. Activer le système d'acquisition de données. Puissance sur les capteurs de force au moins 15 minutes avant l'expérience pour équilibrer la température.
   REMARQUE: La plupart des capteurs de force emploient jauges de contrainte qui sont sensibles aux variations de température et présentent dérive thermique initialement après l'alimentation est appliquée.
4. Lancement logiciel d'acquisition de données et assurer une connexion avec le système d'acquisition de données. Se il vous plaît suivre les instructions de fabrication pour permettre l'enregistrement de données.
5. Assurez-vous que les capteurs de force sont étalonnés avant tissu est placé dans le bain de tissu et avant l'enregistrement des données a commencé; foles instructions du fabricant pour l'étalonnage llow.
6. Connectez le système de bain de tissu à un 95% O _2/5% CO ₂ bouteille de gaz de qualité médicale et vérifier les fuites de gaz et le système sous pression.
7. Remplir les réservoirs de bain de tissu avec PSS et laisser le temps de solution atteindre la température optimale. Premier système et éliminer les bulles d'air dans le système et les tubes.
8. Vérifiez aérateurs de bain de tissu pour assurer l'aération de solution cohérente, qui oxygène le tampon PSS et fournit mouvement brownien à distribuer des médicaments qui seront introduites dans le bain de tissu pendant l'expérience. Assurez-vous que l'aération / bulles ne provoque pas de mouvement de tissu, ce qui va perturber les enregistrements de données; diminuer le débit de gaz que nécessaire.
   NOTE: Le bain de tissu et le système d'acquisition de données sont maintenant prêts à commencer l'expérience.

2. Préparation des tissus

1. Idéalement, disséquer les tissus de l'animal immédiatement avant d'utiliser et directement iNto PSS.
   NOTE: Certains tissus peuvent être sauvegardés dans PSS nuit à 4 ° C, mais les contrôles appropriés doivent être effectués pour valider la fonction des tissus après un stockage prolongé; voir la section 6.
2. Utilisez l'aorte thoracique que le tissu dans cet exercice.
3. Anesthésier le rat conformément aux directives institutionnelles et placer la face dorsale de rat bas. Confirmez anesthésie via un orteil-pincement et la perte de réponse réflexe à ce stimulus douloureux.
   NOTE: Ce protocole utilise 70 mg / kg de pentobarbital envoyé par une injection intrapéritonéale. Les directives institutionnelles pour rongeurs anesthésie peuvent différer.
4. Insérer un pneumothorax par la création d'une incision aux ciseaux le long de la membrane au fond de la cage thoracique. Ensuite, continuer l'incision à partir de la partie inférieure de la cage thoracique et de la couper en deux sternum.
5. Disséquer ou de placer de côté ces organes qui sont au sommet de la colonne vertébrale et de localiser l'aorte, qui se trouve directement le long de la colonne vertébrale.
   NOTE: Ce step fournit un espace de travail clair pour disséquer l'aorte.
6. Sever toutes les connexions à l'aorte; de l'œsophage, du poumon, etc., et couper l'aorte perpendiculaire à la colonne vertébrale au niveau de la membrane.
7. Tenir délicatement l'aorte avec une pince et utiliser des ciseaux à disséquer l'aorte de la colonne vertébrale. Lancer la dissection dans la zone de membrane inférieure adjacente à la colonne vertébrale et le travail vers le cœur. Assurez-vous de prendre des précautions supplémentaires pour ne pas tirer ou tirer sur le tissu aortique, ce qui peut endommager les tissus.
8. Placer immédiatement l'aorte dans le plat de dissection préparée contenant PSS.
   NOTE: La dissection de l'aorte en anneaux est préférable de faire dans un plat de dissection qui a une fondation de silastic noir. Cela permet l'utilisation de fils qui peuvent être utilisés pour cathétériser l'aorte et être fixé à la cuvette, assurant la stabilité tandis que dans le plat de dissection. Le fond noir offre un contraste qui facilite la dissection. Il faut faire attention lors de l'utilisation de fils de canulation selon la endothelialeial couche de cellules peut être enlevée avec un excès de frottement du fil contre la lumière du vaisseau.
9. Prenez un fil et faire un petit angle de 90 ° à une extrémité et pousser l'extrémité coudée dans la fondation silastic pour ancrer le fil de guidage. Placez l'ensemble de l'aorte dans le plat de dissection.
10. Tenez l'extrémité du fil de guidage avec une pince, puis enfilez doucement le fil dans la lumière de l'aorte.
11. Utilisez une pince et faites glisser l'aorte sur le fil. Lorsque l'extrémité libre du fil de guidage est visible, courbe le fil doucement et placez l'extrémité libre dans la fondation silastic du plat pour stabiliser le tissu.
12. Utilisation Vannas petits ciseaux et des pinces, enlever le tissu adipeux périvasculaire et tous les autres tissus étrangers, des caillots de sang, etc., jusqu'à l'aorte thoracique apparaît blanche et un peu fibreuse.
13. Retirer l'aorte nettoyé de fil et utiliser des ciseaux pour couper l'aorte dans les anneaux qui sont d'environ 3-5 mm de largeur.
14. Placez un anneau aortique sur un d'une paire de ticrochets SSUE en maintenant le crochet et l'aide de pinces à glisser doucement l'anneau sur le crochet. Répétez ce processus avec le deuxième crochet. Prenez soin de se assurer que les crochets ne pas se emmêler; voir la figure 3.
15. Vérifiez que chaque crochet a une suture de soie différente attachée. Vérifiez que un crochet a une petite boucle nouée de soie qui permet la fixation à une tige en verre ou en acier inoxydable, tandis que l'autre est une pièce 10-4 cm de long suture qui sera pour le transducteur de force lié à la main; voir la figure 3.
    Remarque: Une fois que l'aorte est fixé aux crochets, le tissu est prêt à être monté dans le bain de tissu; voir la figure 3.
16. Répéter les étapes 02.14 à 02.15, pour monter un deuxième anneau aortique dans la deuxième chambre de bain de tissu.

3. Placement des tissus à Bath

1. A noter que dans ce système, les bains de tissus eux-mêmes sont stationnaires. A cette époque, remplissez les bains de tissus avec réchauffé, PSS aéré et permettre à la solution pour venir à TEMPERATURe.
2. Avec le fil de suture en soie, attacher l'un des crochets de la préparation de tissu de la cheville sur la tige d'acier inoxydable. Placer cette extrémité dans la chambre de bain de tissu. Connectez la tige à un stand de bague et placer l'autre extrémité dans le bac à coloration avec PSS de garder tissu immergé dans un tampon; voir la figure 3.
   1. Placer la tige et du tissu dans la chambre de bain de tissu et se assurer que le tissu est complètement immergé dans PSS et la tige est sécurisé; voir la figure 3.
   2. Attachez l'autre suture pour le capteur de force et veillez à laisser du mou dans la suture entre le tissu et le capteur de force.
      NOTE: Ce jeu sera supprimé en ajustant le micromètre; voir la figure 3.
3. Répétez ces étapes pour la deuxième chambre annulaire et un bain de tissu aortique.

4. Mise en tension passive

Note: Chaque tissu a une longueur (Lo) au cours de laquelle les cellules musculaires lisses répondent optimally. Des expériences préliminaires pour déterminer la tension d'étirage optimal qui permet d'obtenir cette longueur doit être effectuée pour chaque type de tissu particulier à examiner. Le rat aorte thoracique a une tension d'étirage passive optimale de 4 g.

1. Utilisez le micromètre / pignon et crémaillère pour augmenter la tension à 2 g et attendre pour le tissu pour atteindre plateau. Une fois plateau est atteint, augmenter la tension une autre 2 g et attendre pour que le tissu plateau.
   NOTE: Dans les anneaux aortiques, après la tension initiale de 2 g est fixé et le plateau atteint, le tissu doit ensuite se détendre à ~ 1,6 g. Une deuxième application de 2 g porterait le tissu à ~ 3,6 g, à partir de laquelle le tissu sera de nouveau se détendre et la tension diminue. Ainsi, après avoir ajouté 4 g de tension totale, le logiciel devrait indiquer environ 3,2 g de tension.
2. Répétez ces étapes pour la deuxième chambre annulaire et un bain de tissu aortique.

5. équilibration et l'élaboration de médicaments

1. Equilibrer le tissu pour60 min après l'application d'une tension au tissu passive.
2. Pendant la phase d'équilibre, lavez le tissu toutes les 15-20 minutes. Égoutter le bain de tissus et de remplacer le PSS avec PSS partir d'un réservoir chauffé.
   REMARQUE: Pendant ce temps, le tissu va se détendre, ce qui est indiqué par la perte de tension passif.
3. Pendant ce temps, préparer des médicaments pour l'expérience, qui doivent être d'au moins 1 000 fois plus concentrée que la concentration réelle dans le bain, de sorte que seul un petit volume du stock de médicaments est nécessaire pour obtenir la concentration désirée.

6. Défi initiale

1. À la fin de la période d'équilibrage, lavez le tissu une dernière fois, enregistrer les données et remettre à zéro toutes les entrées.
2. Choisir un agoniste (composé qui provoque la contraction actif) auquel répond le tissu.
   NOTE: Dans le rat aorte thoracique, le muscle lisse artériel activement contracter à un agoniste de récepteur adrénergique alpha en raison de l'innervation dutissus par le système nerveux sympathique. Un agoniste adrénergique ne serait pas utile dans les tissus intestinaux étant donné que les agonistes adrénergiques provoquent la relaxation. Dans ce cas, un agoniste du récepteur tel que l'acétylcholine (récepteur cholinergique) peut être utilisé. Une alternative à la fois la phényléphrine et l'acétylcholine est d'utiliser un agoniste non-récepteur tel que riche en potassium (K) comme le premier défi. Dans le muscle lisse, haute K fonctionne pour indirectement canaux calciques ouverte et est donc considérée comme un indice général de l'intégrité du muscle lisse.
   1. Effectuer le premier défi ou le défi de réveil en ajoutant 10 ^-5 M phényléphrine au bain de tissu. Pour atteindre cette concentration dans 50 ml de bain tissulaire, ajouter 50 ul d'une solution de phenylephrine 10 ^-2 M.
      NOTE: 50 ul dans 50 ml de PSS est une dilution de 1/1000, de sorte que la concentration finale est 1,000x moins de stocks, ou 10 ^-5 M. La connaissance du volume et maintien cohérente du volume dans le bain de tissu chambre est critique pour la détermination de la concentration finale du médicament.
3. Ajouter 10 ^-5 M à la phényléphrine bain de tissu et permettre la contraction de plateau pic, puis, lorsque la pente de données devient égal à zéro. Assurez-vous d'enregistrer chaque événement expérimentale pour faciliter l'analyse post-expérimentale.
4. Après plateau, laver l'agoniste de manière approfondie par la vidange et le remplissage de la chambre de bain de tissu avec le nouveau PSS. Assurez-vous d'enregistrer ces événements ainsi.
   REMARQUE: Une règle de base est que la concentration de l'agoniste dans le bain est réduite de 10 fois à chaque lavage. Bien que, plus de 3-4 lavages peuvent être nécessaires pour ramener le tissu vers le bas à son ton de référence d'équilibre (de tension).
5. Laisser reposer le tissu au ton de référence pour ~ 10 min avant de continuer.

7. Expérience

NOTE: La prazosine, un antagoniste des récepteurs adrénergiques alpha, sera introduit dans la chambre de bain de tissu pour déplacer le resp de concentrationcourbe onse à la phényléphrine (PE); ce est un antagonisme démontrable.

1. Pour une salle de bain, ajouter du véhicule (H ₂ O) dans laquelle a été dissous prazosine. À un autre, ajouter la concentration appropriée de la prazosine. Dans ce cas, ajouter 25 ul de véhicule à une salle de bain et 25 ul de 10 ^-5 M de concentration prazosine à l'autre pour obtenir un 5 x 10 ^-9 M ou une concentration de 5 nM dans le bain.
   REMARQUE: Bien que l'ajout d'un véhicule semble inutile dans cet exemple, il est impératif de le faire lors de l'utilisation d'autres véhicules qui ont un potentiel pour être vasoactif (par exemple, le DMSO, l'éthanol, l'acétate). Ajouter le véhicule correspondant, même si peu de preuves existe pour qu'il soit vasoactif.
2. Laissez véhicule / prazosine dans les bains et ne pas laver le tissu pendant 1 heure.
   1. Alors que les tissus sont équilibrage, préparer plusieurs concentrations de l'agoniste (PE). Inclure une large gamme de concentrations, à partir des concentrations suscitant pas de réponse (par exemple, </ Em> 10 ^-9 M PE) à des concentrations qui dépassent la réponse maximale (par exemple, 10 ^-4 M PE). Depuis courbes concentration-réponse sont logarithmiques dans la nature, faire six solutions séparées d'achat d'actions de PE (10 ^-6 -10 ^-1 M) par des dilutions en série à partir de la solution mère à 10 M ^-1. Assurez-vous que le volume nécessaire pour chaque concentration est légèrement supérieure à tripler le volume total nécessaire pour tous les bains (c.> 300 pi).
3. Procéder à l'ajout de l'agoniste, tel que décrit dans le Tableau 1.
   NOTE: Cette expérience va générer une courbe de réponse de concentration cumulative à PE; chaque itération tient compte de la quantité de matière déjà ajouté au bain. Ajouts se produisent jusqu'à ce qu'ils augmentent plus la contraction, ou toute la courbe a atteint un plateau.
   1. Ajouter chaque concentration de médicament individuellement jusqu'à ce que le seuil de tissu est atteinte.
   2. Si aucun changement ne se produit, ajouter la prochaine concentration dans lesérie; voir le tableau 2.
      NOTE: Le calendrier de ces ajouts dépend de l'agoniste utilisé. Par exemple, la noradrénaline et la phényléphrine contraction se développe rapidement, et devraient se stabiliser en quelques minutes. En revanche, l'endothéline-1 contraction se développe lentement et peut ne pas se stabiliser à près de 45 min. Autres expérimentation peut être effectuée sur le tissu après la construction d'une courbe de ce type, pour autant que (1) la substance hors lavages; et (2) il peut être démontré que le tissu revient au comportement contractile normale et ne est pas affecté par les sollicitations précédentes.

8. Analyse des données

1. Assurez-vous de sauvegarder les données immédiatement avant et après une intervention (par exemple, réveil ou la courbe pleine).
2. Trouver et mettre la ligne de base de tissu pour chaque canal chambre / d'entrée de bain de tissu, ce qui contribuera à l'analyse des données.
3. Une fois la ligne de base est réglé, trouver la réponse maximale pour chaque concentration, et enregistrer le change de base. Déplacer successivement à travers chacune des concentrations et enregistrer le décalage vertical.
4. Graphiquement des données résultantes. Pour ce faire, dans tout programme graphique.
   REMARQUE: Graph Pad Prism est conçu pour pharmacologues, et ce est idéal pour le type d'expérience présentée ici.

Résultats

En termes d'agonisme, l'efficacité relative (E _max) et la puissance (CE ₅₀₎ d'un agoniste dans un tissu donné peuvent être calculées et comparées aux réponses d'autres agonistes de la même tissu ^1. Dans notre expérience, le rat aorte thoracique a été incubée avec le véhicule ou la α ₁ adrénergique antagoniste du récepteur de la prazosine (5 nM) pendant une heure avant l'addition de l'α ₁ adrénergique phenylephrine dans le bain de tissu et pour générer contraction (figure 1).

La figure 2 présente les résultats de la figure 1 modifiées. Les réponses verts ont marqué la contraction maximale atteinte par PE marqué comme max, la contraction maximale ½ marqués comme tels, puis associé à la concentration de PE qui a provoqué cette réponse. L'identification de ces valeurs est l'identification de la concentration efficace d'un agoniste qui réalise une demi-max (50%) ou CE réponse _de CE50.

Dans la génération et l'interprétation de ces résultats, il est important d'utiliser à la fois basses et hautes concentrations d'agoniste pour créer la courbe concentration-réponse. Sans suffisamment de points pour afficher une ligne de base stable et le plateau au maximum, ₅₀ CE et E _MAX ne peuvent être estimés. Cela a été fait sous forme graphique dans cet exemple. Logiciels qui utilise les fonctions logistiques pour les courbes sigmoïdales peut être utilisé pour l'ajustement de courbe et le calcul des valeurs _de CE _50.

Figure 1:. Tissue Bath schématique Cartoon représentant un anneau de tissu placé dans la double paroi, ba de tissus de chemise d'eaue. Buffer entrées et sorties sont réglementées par un robinet en verre à 3 voies intégré dans la base de la chambre. O ₂ / CO ₂ est mis à barboter à travers un aérateur qui est scellé avec un joint d'étanchéité pour empêcher la fuite de gaz ou PSS. entrée de remise en circulation est inférieure à la sortie pour maintenir la recirculation correcte et empêcher la formation de poches d'air susceptibles d'entraîner un dérèglement de la température.

Figure 2:. Rat aorte thoracique + endothélium La figure ci-dessus montre quatre expériences distinctes (différents animaux et effectuées par différents chercheurs sur différents set up tels que représentés par des couleurs différentes) pour tester la capacité de la prazosine pour décaler une contraction induite par PE. Prazosine (5 nM) induit clairement décalée PE courbe de contraction vers la droite de façon parallèle.

Figure 3: Rat aorte thoracique + endothélium de l'estimation graphique des valeurs _de CE ₅₀ pour le PE en l'absence (véhicule) et la présence (de prazosine) de l'antagoniste.. Ligne verte (groupe C) ne est marqué.

Sel	MW (g / mole)	5 Litres	FINAL mM
			(grammes)
NaCl	58,45	37,99	130
KCl	74,56	1,75	4.7
KH2PO4	136,1	0,8	1,18
MgSÛ4• 7H20	246,5	1,45	1,17
NaHCO3	84,21	6,25	14,9
Dextrose	180,16	5	5.5
EDTA	380	0,05	0,03

Tableau 1: physiologique normal de Salt Solution (PSS) Recette Contenu de la PSS de bicarbonate tamponnée utilisée dans cette expérience.. Sont inclus les masses moléculaires de tous les sels et la quantité ajoutée de 5 L de dH ₂ O pour obtenir la concentration désirée.

Concentration dans le bain	Ajout de l'agoniste fait pour salle de bain
1 x 10 -9 M	50 ml 1 x 10 -6 M
3 x 10 -9 M	100 ml 1 x 10-6 M
1 x 10 -8 M	35 ml 1 x 10 -5 M
3 x 10 -8 M	100 ml 1 x 10 -5
1 x 10 -7 M	35 ml 1 x 10 -4 M
3 x 10 -7 M	100 ml 1 x 10 -4 M
1 x 10 -6 M	35 ml 1 x 10 -3 M
3 x 10 -6 M	100 ml 1 x 10 -3 M
1 x 10 -5 M	35 ml 1 x 10 -2 M
3 x 10 -5 M	100 ml 1 x 10 -2 M
1 x 10 -4 M	35 ml 1 x 10 -1 M

Tableau 2:. Tissue Bath Additif agoniste concentrations Le montant de l'agoniste à ajouter à chaque bain de proconstruire Perly courbes cumulatives concentration-réponse. La concentration désirée du bain est réalisé par addition de quantités successives consistant à augmenter les concentrations de l'agoniste. Chaque addition tient compte de la concentration de l'agoniste déjà présent dans le bain. Ceci est fait pour minimiser l'augmentation de volume dans le bain de tissu qui résulterait de l'utilisation de volumes croissants d'une seule concentration de l'agoniste.

Discussion

Mesure de la force isométrique comme un outil de recherche est plus de 150 ans, mais il continue d'être la technique prototype pour la caractérisation des récepteurs dans les tissus contractiles ^2. La puissance de cette technique réside dans sa simplicité et sa polyvalence: en enregistrant les réponses induites par des concentrations croissantes d'un agoniste en présence ou en l'absence d'un antagoniste, une multitude d'informations peuvent être obtenues sur les caractéristiques pharmacologiques de chaque médicament et le récepteur auquel ^5.3 il se lie. Des expériences de ce type Garner également des informations sur la concurrence face à la nature non-concurrentielle des antagonistes utilisés, ainsi que l'hétérogénéité des récepteurs et des effets des médicaments non spécifiques ^6-8. Ainsi, avec permutations simples à cette expérience de bain de tissu isolé, un profil pharmacologique relativement complet des récepteurs qui médient induite par l'agoniste contraction musculaire peut être généré.

En termes de agonisme, ee efficacité relative (E _max) et la puissance _(CE50) d'un agoniste dans un tissu donné peut être calculé et comparé à d'autres agonistes de réponses à ^une même tissu. Dans notre expérience, le rat aorte thoracique a été incubée avec le véhicule ou la α ₁ adrénergique antagoniste du récepteur de la prazosine (5 nM) pendant une heure avant l'addition de l'α ₁ adrénergique phenylephrine dans le bain de tissu et pour générer la contraction. La figure 2 présente modifié résultats de la figure 1. Les réponses verts ont été marquées avec la contraction maximale atteinte par PE marqué comme max, la contraction maximale ½ marqué comme tel, puis associé à la concentration de PE qui a provoqué cette réponse. L'identification de ces valeurs est l'identification de la concentration efficace d'un agoniste qui réalise une demi-max (50%) ou réponse CE ₅₀ valeur.

Malheureusement, en utilisant le paramètre agoniste-dépendanteest seul pour déterminer les caractéristiques de liaison aux récepteurs peuvent être compliqués ^neuf. Idéalement, des expériences supplémentaires en utilisant des antagonistes du récepteur permettent le calcul de deux paramètres importants que sont la clé de la définition de l'interaction entre un médicament et un récepteur: l'-log ₁₀ de la dissociation de l'antagoniste constante (pK _B) et le -log ₁₀ molaire de l'antagoniste concentration nécessaire pour provoquer une double déplacement vers la droite de la courbe concentration-réponse (pA ₂₎ ^10. Les deux _B et K pA ₂ de gain leur utilité dans le fait que ce sont des valeurs agonistes indépendante, et reste constante, même entre ¹¹ différents tissus. D'après les données de la figure 2, pK _B peut être calculée en utilisant l'équation suivante et basée sur CE ₅₀ valeurs calculées ailleurs:

EC ₅₀ en l'absence de la prazosine = 2 x 10 ^-8 M
CE ₅₀ dans le préle sens de la prazosine = 7 x 10 ^-6 M

Résolvez K _B dans l'équation suivante:
log (DR-1) = log [B] - log K B
Où:
[B] = concentration antagoniste, ou 5 x 10 ^-9 M. log (5 x 10 ^-9 M) = -8,3
dr = rapport de dose de CE ₅₀ valeur, en présence de l'antagoniste / CE ₅₀ dans l'absence. Se il ya un déplacement vers la droite, cette valeur sera supérieur à un. Ainsi:
dr = 7 x 10 ^-6 M / 2 x 10 ^-8 M ou 700 x 10 ^-8 M / 2 x 10 ^-8 M = 700/2 = 350
Substituer à [B] et dr:
log (350-1) = -8 - log K _B
2,54 = -8 - log KB
pK _B = 10,54

Cette valeur de la prazosine est compatible avec les valeurs obtenues lorsque la prazosine interagit avec un α ₁ adrénergique receptou ^12,13, ce qui suggère que le récepteur adrénergique médiation contraction à la phényléphrine est le récepteur adrénergique α _1.

Plusieurs étapes sont essentielles à la réussite de ces expériences. Les tissus doivent rester dans PSS après la dissection afin d'éviter la perte de viabilité tissulaire. Toute préparation musculaire isométrique a un rapport longueur-tension optimale qui génère la force maximale contre tension passive ^14,15. Pour l'expérience décrite dans ce protocole, la tension passive optimale a déjà été déterminée par incréments brièvement l'ajout de 0,5 g de tension passive au tissu. Le tissu doit commencer sans tonalité et puis après 30 min d'équilibration, le tissu a été contestée avec une concentration maximale de KCl (80 mM), qui a généré tonalité actif. Ensuite, le tissu a été lavé et laisse revenir à la tonalité de référence. Après 15 min au départ, a été placée un autre 0,5 g de tension passive et ce processus est répété jusqu'à ce qu'un plateau detension active a été obtenue avec une tension passive supplémentaire. Dans des expériences préliminaires, 4 g total de tension passive a été déterminé à atteindre maximale génération de tension active dans les anneaux aortiques, et donc ce montant total de tension est placé sur les anneaux avant équilibration. La procédure, il est préférable de zéro demande de tension passive avant, mais peut être fait à tout moment avant l'expérience. Sur-étirement des tissus, en tout point de l'expérience ou de dissection, aura un impact négatif viabilité des tissus et les résultats expérimentaux. Ce est plus impératif lorsque plaçant les tissus dans le bain, car cette étape a la plus forte probabilité d'étirement excessif. Un lavage adéquat, en nombre et en durée est nécessaire pour les effets reproductibles. Un deuxième défi trop tôt après un premier défi, ou avant tissus sont retournés à la tension de base, se traduira dans les réponses aberrantes. Si l'étude antagonistes / inhibiteurs réversibles, des tissus doivent pas être lavés avant agoniste outre, comme l'INHIBIconcentration Tor sera diminué.

Il ya des avantages et des inconvénients notables aux essais isolés de bain de tissu.

Inconvénients: Les tissus peuvent éprouver différents degrés de dommages pendant l'ablation chirurgicale ou le placement d'anneaux sur des crochets. Depuis la cellule endothéliale est la doublure intérieure de l'anneau aortique, il faut veiller sur le placement de l'anneau sur des crochets afin de ne pas endommager cette couche cellulaire. Les tissus peuvent également avoir nettement différentes longueurs de temps dans lequel elles sont viables dans le bain de tissu, et cela doit être déterminé; pas tous les tissus sont les mêmes. Le long de ces lignes, les tissus peuvent changer dans leur réactivité tout au long de la journée tels que les contrôles de temps deviennent un contrôle nécessaire pour chaque expérience. Un bon exemple en est le cochon de Guinée trachée qui permet d'améliorer la contractilité maximale de 100% lors d'une expérience typique de 8 heures. Les médicaments qui sont faiblement solubles dans l'eau peuvent précipiter dans le PSS. Enfin, un cumulatife ajouts non cumulatifs d'un médicament qui est un agoniste pourrait entraîner des résultats différents si désensibilisation du récepteur à l'agoniste se produit; angiotensine II est un de ces médicaments qui montre tachyphylaxie rapides.

Avantages: Un des principaux avantages des expériences de bain de tissu, ce est qu'il est en temps réel; on peut voir l'expérience telle qu'elle se déroule et peut rapidement tirer des conclusions et de planifier les prochaines étapes, ainsi que dépanner pendant une expérience. Une expérience prend un jour à faire. Tissus multiples peuvent généralement être préparés à partir d'un animal tel qu'un animal peut servir comme son propre contrôle, et qui ajoute la force à une expérience. On peut également isoler le tissu à partir d'autres facteurs afin de tester une réponse relativement pur du tissu au médicament. Expériences in vitro, tels que le système de bain de tissu permettent également l'utilisation d'une petite quantité de médicament par rapport à une expérience in vivo.

Le dispositif expérimental de base décrits ici peuvent êtrelargement modifié pour permettre l'enregistrement de paramètres supplémentaires ou l'introduction d'autres stimuli externes. Par exemple, l'addition d'électrodes pour permettre la stimulation électrique des nerfs innervant de ^16,17 terrain. Avec l'ajout de sondes thermiques ou de pH, les effets de la température et du pH sur les réponses contractiles peuvent également être mesurés ^18,19. De même, l'oxygène peut être substitué partiellement ou en totalité avec N ₂ pour évaluer les effets induits par l'hypoxie. En outre, les mêmes principes de base de la mesure de la contractilité isométrique utilisés dans cette vidéo peuvent être utilisés pour développer des systèmes qui permettent la mesure concomitante de développement et les changements de tension isométrique en calcium intracellulaire ^20. la transduction de signal est également facilement étudié, étant donné que les systèmes existent qui peuvent congeler rapidement un échantillon de tissu au cours d'une réaction, de telle sorte que l'activité d'un système de voie de transduction de signal peut être vérifiée biochimiquement.

La variation de equipment qui peut être utilisé pour ce faire est énorme. Tout ce système, soit la main construit ou automatisé, peut être acheté auprès de plusieurs sociétés différentes. Les bains de tissu et les détenteurs de tissus utilisés dans ce protocole étaient (bains de tissus) et main construit (titulaires) soufflé à la main par un atelier d'usinage en interne Michigan State University.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
LabChart Software	ADInstruments		7.2
PowerLab (4 canaux)  ;	ADInstruments	ML760
QuadBridge (4 canaux)	ADInstruments	ML112	ML112
Câble adaptateur	pour herbe ADInstruments	MLAC11	MLAC11
Transducteur de force-déplacement d’herbe	Grass Instrument Co	FT03	FT03 Câble
sonde d’herbe	Grass Instrument Co	TAC-7 REV-1
Câble	BNC vers BNCADInstruments	MLAC01
IsoTemp 2100	Fisher Scientific		IC-2100
Bain de tissu Sources	multiples  ;
		saline physiologique	PSS
Suture en soie tressée	Harvard Apparatus	51-7615	SP104
Support d’anneau	Humboldt MFG Co	H-2122 7
Plats de dissection	faits à la main avec
Tygon	VWR Scientific	63010-100	R-3603
Pinces de serrage	Cole-Parmer Instrument Co	06832-08	SNP-8
50 ml Bain musculaire	Eberhartglass Soufflage	personnalisé
250 ml Chambres de réchauffement	Eberhartglass Soufflage	personnalisé
Tube de dispersion de gaz	Ace Glass	7202-06	7202-02
Micromètre
Supports
personnalisésPinces à trois broches	VWR International		Talon
S-connector	VWR International		Talon
Crochets à tissus	Fabriqué à la main en interne
Leica Stereomicroscope MZ6	Leica		10447254
		12562-36	12562-36
Culture Boîte de Pétri	Pyrex		7740 Verre
Sylgard Silicone Elastomère	Dow Corning		Sylgard 170 Kit
Vannas Ciseaux	George Tiemann & Co	160-150	160-150
Éclats & Pince de fixation	George Tiemann & Co	160-55	160-55