Method Article

Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

DOI:

10.3791/52333

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June 17th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

In This Article

Summary

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Les protocoles décrivent deux vitro systèmes de test de toxicité sur le développement dans (UKK et UKN1) basée sur les cellules souches embryonnaires humaines et des études de transcriptome. Les systèmes de test prédisent risque de toxicité pour le développement humain, et peuvent contribuer à réduire les études sur les animaux, les coûts et le temps requis pour l'essai de la sécurité chimique.

Abstract

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Protocoles efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines à divers tissus en combinaison avec les technologies -omiques ouvert de nouveaux horizons pour les tests in vitro de toxicité de médicaments potentiels. Pour fournir une base scientifique solide pour ces essais, il sera important d'obtenir des informations quantitatives sur l'évolution dans le temps de développement et sur les mécanismes de régulation sous-jacents par des approches de biologie des systèmes. Deux essais ont donc été à l'écoute ici pour ces exigences. Dans le système d'essai UKK, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) (ou d'autres cellules pluripotentes) sont laissés à différencier spontanément pendant 14 jours dans des corps embryoïdes, afin de permettre la génération de cellules des trois couches germinales. Ce système récapitule les principales étapes du développement embryonnaire humaine début, et il ne peut prédire la toxicité embryonnaire précoce / tératogénicité humain spécifique, si les cellules sont exposées à des produits chimiques lors de la différenciation. Le système de test est fondé sur UKN1 hESC différenciation à une population de neuroectodermale progénitrices (NEP) cellules pour 6 jours. Ce système récapitule le développement neural précoce et prédit la neurotoxicité développementale précoce et les changements épigénétiques provoqués par des produits chimiques. Les deux systèmes, en combinaison avec des études transcriptome de puces à ADN, sont appropriées pour l'identification de biomarqueurs de toxicité. En outre, elles peuvent être utilisées en combinaison pour générer des données d'entrée pour l'analyse de biologie des systèmes. Ces systèmes de test ont des avantages sur les études toxicologiques traditionnels nécessitant de grandes quantités d'animaux. Les systèmes de test peuvent contribuer à une réduction des coûts de développement des médicaments et l'évaluation de la sécurité chimique. Leur combinaison éclaire en particulier sur les composés qui peuvent influer sur le développement neurologique spécifiquement.

Introduction

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La capacité des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à se différencier en divers types de cellules a ouvert une nouvelle ère de tests de toxicité in vitro 1, modélisation de la maladie et la médecine régénérative 2. Les cellules souches sont dotés de la capacité de se reproduire, de garder leur état ​​pluripotent, et de se différencier en cellules spécialisées 3,4. Les propriétés de CSEh (capacité de se différencier à tous les principaux types de cellules) se trouvent également dans d'autres cellules souches pluripotentes humaines, telles que les cellules d'origine humaine souches pluripotentes (hiP....

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Protocol

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Le protocole suivant a été réalisée en utilisant la ligne Embryonic Stem Cell humaine (CSEh) H9. Cette lignée cellulaire a été cultivées en routine sur des fibroblastes de souris mitotiquement inactivé embryonnaires (MEF) dans les milieux de culture de CSEh complété avec bFGF puis cultivées dans des milieux de cellules souches sur 6 cm boîtes de Pétri revêtues de la matrice de la membrane basale comme matrigel, de se débarrasser de MEF. Les cellules H9 de> 80% de plaques confluentes ont été utilisés pour plus de passage. Cellules H9 cultivées sur des plaques de matrice de membrane basale ont été utilisés pour la formation EBS. Toutes les p....

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Results

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L'exposition au méthylmercure dans le système de test UKK

L'essai de cytotoxicité a été effectué avec H9 EB pour obtenir une valeur de CI 10 (réduction de la viabilité de 10%) pour la cytotoxicité de mercure de méthyle (figure 1). Nous avons également effectué une puce à base (plate-forme Affymetrix) étude de biomarqueurs. L'EB H9 ont été exposées au mercure de méthyle (0,25 et 1 uM) pendant 14 jours. Au jour 14, des échantillons ont été recueillis à l'aide TRIzol.......

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Discussion

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Les approches traditionnelles de tests toxicologiques impliquent de vastes études animales rendant ainsi tests coûteux et chronophage. En outre, en raison des différences entre les espèces les études de sécurité précliniques animale ne sont pas toujours valable pour prédire les effets de la toxicité des médicaments potentiels pertinents pour les humains. Bien que les primates non-humains sont le plus prévisible, encore forte éthique, et les demandes socioeconomical élèvent rapidement par les sociétés modernes pour le dé.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Nous remercions M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani et Cornelia Böttinger pour leur excellent support technique. Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation allemande pour la recherche (RTG 1331) et du ministère allemand de la Recherche (BMBF).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F-12Life Technologies11320082Dulbecco’s Modified Eagle Mélange moyen :nutriments F-12
KOSRLife Technologies10828028Knockout Serum Replacement
GlutaMAXLife Technologies35050061GlutaMAX
NEAALife Technologies11140050MEM Acides aminés non essentiels Solution
DPBSLife Technologies14190-0144Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, sans calcium, sans magnésium
mTeSR mediumStemcell Technologies5850
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
V Plaqueinférieure VWR734-0483Plaque, Micropuits, V BTTM, 96 Puits, stérile 1 * 50 ST
V Couvercle de la plaque inférieureVWR634-0011Couvercle, plaques de microtitrage, Cond. Anneau 1 * 50 ST
Pen/StrepLife Technologies15140-122Pénicilline-Streptomycine, Liquid
Distilled WaterLife Technologies15230-089.Eau distillée stérile
FGF-2 humain (bFGF)MilliporeGF003AF-100UGFacteur de croissance des fibroblastes basique, recombinant humain, sans animaux
Filtre 0,22 &mu ; mMilliporeSCGPU02REStericup-GP, 0,22 &mu ; m, polyéthersulfone, 250 ml, radio-stérilisé
StemPro EZPassageTM DisposablteInvitrogen23181010
BD MatrigelTM, certifié hESC MatrixStemcell Technologies354277flacon de 5 ml
DMSOSigmaD-2650
RNAlater Stabilization SolutionLife TechnologiesAM7020Il stabilise et protège l’intégrité de l’ARN dans les échantillons non congelés.
70 &mu ; m Cell StrainerBecton Dickinson352350Filtre à cellules avec 70 &mu ; m Maille de nylon
35 &mu ; m Crépine de cellule de couvercle, 5  ; TubeBecton Dickinson352235tube à essai à fond rond en polystyrène de 5 ml, avec un capuchon de crépine à cellules (35 &mu ; m)
Tube stérile en polypropylène de 50 mlGreiner Bio-One227261Tube en polypropylène de 50 ml à fond conique,
Fiole stérile T75Greiner Bio-One658175CELLSTAR Capuchon filtrant Culture cellulaire 75 cm2 Flacons
TRIzolLife Technologies10296010
plaques de fond optiques à 96 puitsThermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
AccutasePAAL11-007
ApotransferineSigma-AldrichT-2036
DispaseWorthington BiochemicalsLS002104
DorsomorphineTocris Bioscience3093
EDTARoth8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R& D Systems233-FB
GélatineSigma-AldrichG1890-100G
GlucoseSigma-AldrichG7021-100G
GlutaMAXGibco Invitrogen35050-038
HEPESGibco Invitrogen15630-056
InsulineSigma-AldrichI-6634
Knockout DMEMGibco Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR& D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
ProgestéroneSigma-AldrichP7556
PutrescineSigma-AldrichP-5780
Inhibiteur de ROCK Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
SeleniumSigma-AldrichS-5261
&beta ;-MercaptoethanolGibco Invitrogen31350-010
[en-tête]
Liste des kits
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
Kit d’hybridation, de lavage et de coloration GeneChipAffymetrix900721, 22, 23Ce kit fournit tous les réactifs nécessaires à l’hybridation, au lavage et à la coloration des microarrays.
Kit DNase sans RNASEQIAGEN79254
[en-tête]
Liste des équipements
Microscope inverséOlympusIX71
Genechip Hybridation Oven - 645Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450Affymetrix
Affymetrix Scanner de puces génétiques-3000-7 GAffymetrix
Spectramax M5Dispositifsmoléculaires
  ;
  ;
  ;
[en-tête]
Liste des logiciels
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Outils en ligne pour l’annotation fonctionnelle
DAVID
Onto-tools Laboratoire de systèmes intelligents et de
supplement bioinformatique

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceut....

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Human Pluripotent Stem CellsDevelopmental Toxicity AssaysEmbryoid Body FormationNeuroectodermal Progenitor DifferentiationTranscriptome Microarray AnalysisChemical Safety ScreeningSystems Biology Data GenerationEarly Embryonic DevelopmentNeural Development ToxicityToxicity Biomarker Identification

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