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Article de méthode

Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans

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DOI :

10.3791/52345

⸱

5 avril 2015

 , 
1Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode rentable pour définir les interactions chimico-génétiques chez les levures bourgeonnantes. L’approche s’appuie sur des techniques fondamentales de biologie moléculaire de la levure et est bien adaptée à l’interrogation mécaniste de petites et moyennes collections de produits chimiques et d’autres environnements de milieux.

Résumé

Déterminer le mode d'action des produits chimiques bioactifs est d'intérêt pour un large éventail d'universitaires, pharmaceutiques, et les scientifiques industriels. Saccharomyces cerevisiae, ou levure bourgeonnante, est un eucaryote modèle pour lequel une collection complète de ~ 6000 mutants de délétion du gène et gène essentiel hypomorphic mutants sont disponibles dans le commerce. Ces collections de mutants peuvent être utilisés pour détecter systématiquement des interactions chimiques de gènes, à savoir les gènes nécessaires pour tolérer un produit chimique. Cette information, à son tour, des rapports sur le mode d'action probable du composé. Ici, nous décrivons un protocole pour l'identification rapide des interactions chimiques-génétiques dans la levure bourgeonnante. Nous démontrons le procédé utilisant l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU), qui possède un mécanisme bien défini de l'action. Nos résultats montrent que l'ARN nucléaire TRAMP exosomes réparation de l'ADN et les enzymes sont nécessaires pour la prolifération en présence de 5-FU, qui est compatible avec m précédenteicroarray approches génétiques basés codes barres chimiques et la connaissance que le 5-FU néfaste à la fois l'ARN et l'ADN métabolisme. Les protocoles de validation requis de ces écrans à haut débit sont également décrits.

Introduction

Les outils et les ressources disponibles dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae génétiques ont permis à grande échelle de génomique fonctionnelle études qui fournissent collectivement un nouvel éclairage sur la façon dont les gènes fonctionnent comme des réseaux pour répondre aux exigences des systèmes biologiques. La pierre angulaire de ces outils a été la création en collaboration d'un ensemble complet de délétions de gènes non-essentiels de tous les cadres de lecture ouverts dans la levure 1,2. Une observation frappante était que seulement environ 20% des gènes de levure sont nécessaires pour la viabilité lorsqu'il est cultivé comme haploïdes dans des conditions de laboratoire standard. Cela met en évidence la capacité d'une cellule à tampon contre les perturbations génomiques grâce à l'utilisation des voies biologiques alternatives. Mutants génétiques qui sont viables individuellement, mais en combinaison mortelle, signalent les voies biologiques parallèles ou convergentes connectés et forment des réseaux d'interactions génétiques qui décrivent la fonction biologique. Avec le développement de te conditionnelleallèles mpérature-sensibles et hypomorphic de gènes essentiels de la technologie n'a pas été limité à l'étude des gènes non essentiels 3,4. Ce concept a été appliqué à l'échelle génomique produire une carte d'interaction génétique impartiale illustrant comment les gènes impliqués dans les processus cellulaires similaires se regroupent 5.

Perturbations chimiques des réseaux génétiques suppressions de gènes imiter (Figure 1) 6. Interrogation composés inhibiteurs de croissance contre une matrice haute densité de souches de suppression de l'hypersensibilité identifie un profil d'interaction chimique génétique, ce est à dire une liste de gènes qui est nécessaire pour tolérer le stress chimique. Comme les interactions génétiques, grands écrans de bibliothèques chimiques ont montré que les composés avec un mode similaire de se regroupent sept d'action. Par conséquent, en établissant le profil d'interaction chimique génétique d'un composé du mode d'action peut être déduite par comparaison avec large échelle interaction génétique génétique et chimique de synthèse datasets 8,9.

Écrans chimiques génétique à grande échelle, où des dizaines de composés sont interrogés, ont été réalisées par des analyses de la concurrence de codes à barres. Dans cette approche, la collecte groupée des souches de suppression est cultivé en masse depuis plusieurs générations dans un petit volume de milieu contenant un produit chimique. Depuis chaque mutant de suppression recèle un code-barres génétique unique, la viabilité / croissance des mutants individuels au sein du pool de souches de suppression est suivi par microarray ou séquençage à haut débit 10.

Inférer remise en forme en surveillant la taille des colonies de mutants physiquement disposés en réseau cultivés sur gélose solide contenant un composé bioactif est aussi une méthode efficace pour identifier les interactions chimiques-génétiques 11,12. Cette approche offre une alternative rentable au dépistage fondé sur la concurrence et est bien adapté pour le dosage de petites bibliothèques de produits chimiques.Décrite ici est une méthodologie simple pour produire une liste des interactions chimiques-génétiques dans S. cerevisiae qui ne repose pas sur les manipulations moléculaire ou d'infrastructure biologie. Elle exige seulement une collection de levure de suppression, un appareil de brochage robotisé ou manuel, et librement disponibles des logiciels d'analyse d'images.

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Protocole

NOTE: Le flux de travail général de cette procédure est décrite dans la figure 2.

1. Détermination de la croissance inhibitrice Dose

  1. Préparation de levure culture d'une nuit
    NOTE: Les médias de croissance extrait de levure-peptone-dextrose (YEPD) utilisé dans ce protocole est une recette standard 13.
    1. Streak sur BY4741 (Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 de Mata) cellules sur une plaque de gélose YEPD et incuber pendant 48 heures à 30 ° C ou jusqu'à ce que des colonies visibles forment.
    2. Préparer cultures d'une nuit en inoculant 5 ml de YEPD milieux liquides dans un récipient de culture stérile avec une seule colonie. Incuber une nuit à 30 ° C avec rotation continue ou en secouant. La culture sera typiquement atteindre la saturation par le matin (~ 2 × 10 8 cellules / ml).
  2. Solide préparation des milieux agar contenant diverses doses chimiques
    1. Préparer plusieurs stocks dele produit chimique à tester à 100x la concentration finale souhaitée dans un solvant approprié.
      REMARQUE: Les concentrations efficaces dépendront de la chimie, et doivent être déterminées empiriquement. Il est donc conseillé de tester d'abord une gamme de concentration finale de large; ce est à dire, d'une faible uM à haute mM.
    2. Pour chaque concentration de produit chimique à tester, aliquote de 3 ml de gélose YEPD fondu dans un tube de plusieurs culture stérile. Place à 55 ° C bain d'eau pour garder de se solidifier.
    3. Pour chaque concentration de produit chimique à tester ajouter 30 ul du composé à 100x milieu en fusion, vortex pour mélanger 2-3 secondes, et la pipette 1 ml dans chaque paire de puits en double dans une plaque à 12 puits. Veillez à inclure un véhicule seul contrôle. Permettre aux plaques de fixer pendant une nuit à température ambiante. Jeter ne importe quel média supplémentaire.
  3. cellules Spread placage
    1. Inoculer 10 ml de milieu liquide YEPD avec 2 ul d'une culture de levure saturée, cultivées pendant une nuit comme dans l'étape 1.1.2.
    2. Plate 25 ul de la culture de levure diluée par puits, répartis uniformément en utilisant des billes de verre stériles ou tige, et permettent la plaque sécher sous une flamme. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 48 heures.
    3. Évaluer la croissance des levures (à la fois le nombre total et la taille des colonies) sur les plaques. Sélectionner une concentration sublétale d'un composé qui ne inhibe pas la croissance de plus de 10% à 15% pour effectuer la totalité.

2. Systematic crible génétique chimique

  1. Maintien de suppression-mutant-array (DMA) et la préparation de plaque source
    1. Pour une description détaillée sur la construction de réseaux de mutants suppression des stocks de glycérol se il vous plaît se référer à Baryshnikova et al. 14. Une fois que les mutants de deletion ont été revêtu à une densité de 384 colonies par plaque, la DMA peut être stocké pendant plusieurs mois à 4 ° C. Répliquer sur gélose YEPD contenant 200 ug / ml de G418 que nécessaire pour empêcher les colonies de se développer dans chaqueautre.
      Note: plusieurs répétitions de série devraient être évités pour prévenir la perte de souches à croissance lente et de minimiser l'apparition de mutants suppresseurs. Ceci est particulièrement pertinent si le maintien des collections que haploïdes.
    2. Effectuez toutes les étapes réplique placage utilisant un microbienne rangeant système robotique. Alternativement, manipuler colonies en utilisant des outils manuels d 'ancrage vêtu.
      NOTE: La collection de levure de suppression est disponible en haploïdes et diploïdes provenant de plusieurs sources commerciales et est généralement expédié en stocks de glycérol dans des plaques à 96 puits.
  2. Condenser le tableau suppression de mutant
    1. Préparer 250 ml de milieu de gélose YEPD contenant 200 ug / ml de G418. La concentration efficace de G418 peut varier et chaque lot doit être testé empiriquement.
    2. Préparer cinq plaques de gélose YEPD en versant 50 ml d'agar YEPD contenant 200 ug / ml de G418 par plaque. Pour ce faire, un jour avant la condensation du tableau et laisser les plaques refroidir à la température ambianterature nuit sur une surface plane.
      NOTE: Quatre plaques seront requis pour la collecte à une densité 1536-souche, la cinquième plaque est versé comme un supplément.
    3. Retirer les 16 boîtes de Pétri contenant le mutant de deletion de collecte à une densité de 384 colonies par plaque et laisser revenir à la température ambiante (environ 1 heure).
    4. Essuyez toute condensation qui se est formée sur le couvercle de chaque plaque en utilisant une tâche délicate essuyer. Ne pas le faire peut entraîner des gouttelettes d'eau se dépose sur le tableau et la contamination croisée de mutants disposés.
    5. L'utilisation d'un tableau épinglant robots microbienne, condenser la DMA d'une densité de 384 colonies par plaque (16 boîtes de Pétri) à 1536 colonies par plaque (4 boîtes de Pétri). Effectuez cette sorte que le 1 er colonie de la plaque 1 pins à la ligne 1 colonne 1 du tableau condensé, le 1 er colonie de la plaque 2 à la ligne 1 colonne 2, le 1 er colonie de la plaque 3 à la ligne 2 et la colonne 1, et la colonie 1 er de la plaque 4 à la ligne 2colonne 2.
    6. Incuber le tableau consolidé à 30 ° C pendant la nuit.
    7. Examinez le tableau pour assurer un transfert uniforme de colonies à partir de plaques de source. Il y aura plusieurs positions vierges, à dessein incorporés dans la matrice, qui servent de guide pour assurer le DMA a été condensé correctement (figure 4A).
      NOTE: Il se agira des plaques de base pour des répliques sur des milieux contenant le composé d'essai. Une plaque de source unique peut être utilisé pour plusieurs pinnings. Aussi de nombreux robots auront une fonction de compensation, ce qui assurera un nombre similaire de la levure sont transférés à chaque fois.
  3. plaque de gamme Replica suppression de mutant
    1. Préparez 700 ml de contrôle (véhicule seulement) et 700 ml de milieu expérimental (contenant de produits chimiques). Ce est suffisant pour la réalisation du test en trois exemplaires (12 plaques par condition, plus deux extras).
    2. Verser 50 ml de gélose YEPD contenant lutte chimique ou par plaque test. Autoriser les plaques to refroidir à la température ambiante pendant une nuit sur une surface plane.
    3. En utilisant le robot à la plaque de réplique, inoculer le DMA sur trois jeux de plaques contenant des produits chimiques à la concentration déterminée expérimentalement, ainsi que trois jeux de plaques contenant le contrôle du véhicule. Incuber les plaques à température ambiante pendant 24-48 h.

3. Les plaques d'imagerie et d'analyse de données

  1. Retirer les plaques de l'incubateur et leur permettre de revenir à température ambiante (~ 1 h) avant l'imagerie. Cela permettra d'éviter la formation de condensation en imagerie les plaques.
  2. plaques d'image au 24 et 48 h en enlevant le couvercle et placer face vers le bas sur un scanner à plat. Capturez des images à une résolution d'au moins 300 dpi. Sinon, utilisez un appareil photo numérique pour capturer des images. Si faisant, place des plaques face vers le haut sur un fond sombre et retirez les couvercles à l'image.
    NOTE: Le format de fichier et le positionnement des plaques dépendront sur le programme de quantification utilisée.
  3. Effectuer la quantification et la comparaison de la taille des colonies de tableau en utilisant l'un des nombreux programmes open source, y compris Balony 15, SGAtools 16 et 17 ScreenMill.

4. Validation de l'écran

NOTE: A ce stade, plusieurs mutants de suppressions de levure seront marquer une hypersensibilité à la substance chimique d'intérêt. Ces interactions chimiques-génétiques doivent être validés prochaine de deux façons. D'abord l'identité des souches sensibles devrait être confirmée par PCR. En second lieu, la sensibilité chimique doit être reçu de façon indépendante. Décrit ci-dessous est un bref protocole pour effectuer des dosages de repérage pour valider hypersensibilité de la souche, une technique courante dans la levure biologie.

  1. Tués sur le souhaite (hypersensible) de la collection de mutants de deletion de la levure sur de la gélose YEPD contenant 200 ug / ml de G418. Incuber à 30 ° C jusqu'à ce que des colonies se forment. Vérifier le génotype de la souche de diagnostic par PCR avec des amorces selon lale protocole du fabricant.
  2. Inoculer 5 ml du liquide YEPD pour chaque souche et incuber une nuit à 30 ° C avec agitation ou rotation.
  3. Mesurer 600 OD et diluer chaque souche à DO 600 = 1 en DH stérile 2 O. Ce sont maintenant les cultures de levure normalisées.
  4. Distribuer 100 ul de normalisée levure de type sauvage (BY4741) la culture de bien A1 d'une plaque de 96 puits. Distribuer 100 ul de jusqu'à sept souches supplémentaires aux puits B1-H1.
  5. Utilisez une pipette multicanaux pour distribuer 90 ul de dH 2 O stérile aux puits A2-H2 à A6-H6. Enfin, préparer une série de dilutions de 1:10 cultures de levures normalisées. Commencez par pipetage en série 10 ul de la colonne 1 à la colonne 2 avec une pipette multicanaux, et continuer à travers la plaque 96 puits jusqu'à six dilutions sont faites (ce est à dire, 10 0 à 10 -5).
  6. 5.2 Transfert ul de cultures de levure dilués dans une grille à l'aide d'un multicanalpipette sur YEPD milieux solides contenant chimique et la maîtrise du véhicule. Incuber les plaques à la température appropriée pour 24 à 48 h.
  7. Inspectez plaques et de comparer la sensibilité de certains mutants aux produits chimiques (par rapport à BY4741 commande). plaques d'image à 24 et 48 heures comme dans l'étape 3.2.
    REMARQUE: Bien que l'identification de plusieurs souches hypersensibles ontologies de gène apparenté ou fonctions prête confiance à la validité de l'écran, la transformation d'une souche de suppression hypersensible avec un plasmide contenant une copie de type sauvage du gène est nécessaire pour établir formellement qu'un gène suppression d'intérêt (et seconde mutations site pas cachés) provoque la sensibilité aux médicaments.

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Résultats

En tant que validation de cette approche nous avons effectué un écran d'interaction chimique génétique représentant de l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU) en suivant le protocole décrit ci-dessus. 5-FU est connu de perturber la thymidylate synthase, ainsi que le métabolisme de l'ADN et de l'ARN 18. Les interactions génétiques chimiques de 5-FU sont bien étudiés et ont été étudiés par des techniques de levure code à barres de puces à ADN en utilisant les deux collections de suppr...

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Discussion

Décrit ici est une approche pour générer des profils d'interaction chimiques génétique. La méthode est simple: en comparant les tailles des colonies de chacune des souches dans des collections complètes de deletion de gène en présence et en absence d'un produit chimique, tous les gènes nécessaires pour tolérer une insulte chimique sont identifiés. analyse de l'enrichissement d'annotation de la liste résultant de souches sensibles peut alors être utilisé pour fournir un aperçu d'un mode d'action d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Recherche dans le laboratoire CJN est soutenu par des subventions de fonctionnement du CRSNG, l'Institut de recherche Société canadienne du cancer (IRSCC), et la Fondation du cancer (Direction BC-Yukon) Canadian Breast.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Extrait de levureBioBasicG0961Pour les milieux liquides/solides YEPD, ajouter à 1 % de concentration finale (p/v)
Tyrptone PowderBD Biosciences211820Pour les milieux liquides/solides YEPD, ajouter à 2 % de concentration finale (w/v)
DextroseAnachemia31096-380Pour les milieux liquides/solides YEPD, ajouter à 2 % de concentration finale (p/v) — ; Ne pas autoclave. Préparez une solution mère à 20 %, filtrez, stérilisez et ajoutez-la au média après l’autoclavage.
Agar ABio BasicFB0010Pour les milieux solides YEPD, ajouter à 2 % de concentration finale (p/v)
G418A.G. Scientific Inc.G-1033Préparez 1 000x le stock à 200  ; mg/ml dans dH2O et filtrer la stérilisation.
Plaque 12 puitsGreiner Bio One655180
5 ml Tubes de cultureEvergreen Scientific222-2376-080
10 cm Boîte de PétriVWR25384-302
ROTOR HDASinger Instruments  ;ROT-001robot d’épinglage à réseau microbien à haut débit
PLUSPLATE© ; Boîte de PétriSinger Instruments  ;PLU-001Boite de 200 plats
384 Short-Pin RePadSinger Instruments  ;RP-MP-384Boite de 1 000 pads
1536 Short-Pin RePadSinger Instruments  ;RP-MP-1536Boîte de 1 000 tampons
Outils de goupillage alternatifs :
Entièrement automatisé Robtic SystemsS& P roboticshttp://www.sprobotics.comPlusieurs systèmes automatisés de manipulation de colonies, robotiques et d’imagination disponibles.
Outils d’épinglage manuelsV& P Scientifichttp://www.vp-scientific.comOutils et accessoires de réplication portables.

Références

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Réimpressions et autorisations

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