Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Résumé

Nous présentons ici une méthode rentable pour définir les interactions chimico-génétiques chez les levures bourgeonnantes. L’approche s’appuie sur des techniques fondamentales de biologie moléculaire de la levure et est bien adaptée à l’interrogation mécaniste de petites et moyennes collections de produits chimiques et d’autres environnements de milieux.

Résumé

Déterminer le mode d'action des produits chimiques bioactifs est d'intérêt pour un large éventail d'universitaires, pharmaceutiques, et les scientifiques industriels. Saccharomyces cerevisiae, ou levure bourgeonnante, est un eucaryote modèle pour lequel une collection complète de ~ 6000 mutants de délétion du gène et gène essentiel hypomorphic mutants sont disponibles dans le commerce. Ces collections de mutants peuvent être utilisés pour détecter systématiquement des interactions chimiques de gènes, à savoir les gènes nécessaires pour tolérer un produit chimique. Cette information, à son tour, des rapports sur le mode d'action probable du composé. Ici, nous décrivons un protocole pour l'identification rapide des interactions chimiques-génétiques dans la levure bourgeonnante. Nous démontrons le procédé utilisant l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU), qui possède un mécanisme bien défini de l'action. Nos résultats montrent que l'ARN nucléaire TRAMP exosomes réparation de l'ADN et les enzymes sont nécessaires pour la prolifération en présence de 5-FU, qui est compatible avec m précédenteicroarray approches génétiques basés codes barres chimiques et la connaissance que le 5-FU néfaste à la fois l'ARN et l'ADN métabolisme. Les protocoles de validation requis de ces écrans à haut débit sont également décrits.

Introduction

Les outils et les ressources disponibles dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae génétiques ont permis à grande échelle de génomique fonctionnelle études qui fournissent collectivement un nouvel éclairage sur la façon dont les gènes fonctionnent comme des réseaux pour répondre aux exigences des systèmes biologiques. La pierre angulaire de ces outils a été la création en collaboration d'un ensemble complet de délétions de gènes non-essentiels de tous les cadres de lecture ouverts dans la levure ^1,2. Une observation frappante était que seulement environ 20% des gènes de levure sont nécessaires pour la viabilité lorsqu'il est cul....

Protocole

NOTE: Le flux de travail général de cette procédure est décrite dans la figure 2.

1. Détermination de la croissance inhibitrice Dose

1. Préparation de levure culture d'une nuit
   NOTE: Les médias de croissance extrait de levure-peptone-dextrose (YEPD) utilisé dans ce protocole est une recette standard ^13.
   1. Streak sur BY4741 (Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 de Mata) cellules sur une plaque de gélose YEPD et incuber pendant 48 heures à 30 ° C ou jusqu'à ce que des colonies visibles forment.
   2. Préparer cultures d'une nuit en inoculant 5 ml de YEPD milieux liquides dans un....

Résultats

En tant que validation de cette approche nous avons effectué un écran d'interaction chimique génétique représentant de l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU) en suivant le protocole décrit ci-dessus. 5-FU est connu de perturber la thymidylate synthase, ainsi que le métabolisme de l'ADN et de l'ARN ^18. Les interactions génétiques chimiques de 5-FU sont bien étudiés et ont été étudiés par des techniques de levure code à barres de puces à ADN en utilisant les deux collections de suppr.......

Discussion

Décrit ici est une approche pour générer des profils d'interaction chimiques génétique. La méthode est simple: en comparant les tailles des colonies de chacune des souches dans des collections complètes de deletion de gène en présence et en absence d'un produit chimique, tous les gènes nécessaires pour tolérer une insulte chimique sont identifiés. analyse de l'enrichissement d'annotation de la liste résultant de souches sensibles peut alors être utilisé pour fournir un aperçu d'un mode d'action d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extrait de levure	BioBasic	G0961	Pour les milieux liquides/solides YEPD, ajouter à 1 % de concentration finale (p/v)
Tyrptone Powder	BD Biosciences	211820	Pour les milieux liquides/solides YEPD, ajouter à 2 % de concentration finale (w/v)
Dextrose	Anachemia	31096-380	Pour les milieux liquides/solides YEPD, ajouter à 2 % de concentration finale (p/v) — ; Ne pas autoclave. Préparez une solution mère à 20 %, filtrez, stérilisez et ajoutez-la au média après l’autoclavage.
Agar A	Bio Basic	FB0010	Pour les milieux solides YEPD, ajouter à 2 % de concentration finale (p/v)
G418	A.G. Scientific Inc.	G-1033	Préparez 1 000x le stock à 200  ; mg/ml dans dH2O et filtrer la stérilisation.
Plaque 12 puits	Greiner Bio One	655180
5 ml Tubes de culture	Evergreen Scientific	222-2376-080
10 cm Boîte de Pétri	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments  ;	ROT-001	robot d’épinglage à réseau microbien à haut débit
PLUSPLATE© ; Boîte de Pétri	Singer Instruments  ;	PLU-001	Boite de 200 plats
384 Short-Pin RePad	Singer Instruments  ;	RP-MP-384	Boite de 1 000 pads
1536 Short-Pin RePad	Singer Instruments  ;	RP-MP-1536	Boîte de 1 000 tampons
Outils de goupillage alternatifs :
Entièrement automatisé Robtic Systems	S& P robotics	http://www.sprobotics.com	Plusieurs systèmes automatisés de manipulation de colonies, robotiques et d’imagination disponibles.
Outils d’épinglage manuels	V& P Scientific	http://www.vp-scientific.com	Outils et accessoires de réplication portables.