Article de méthode

Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l'immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

DOI :

10.3791/52351

⸱

10 janvier 2015

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À l’aide d’essais ex vivo optimisés sur cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC), nous avons montré qu’une préparation de produit du tabac combustible supprime de manière marquée les cytokines sécrétées par voie intracellulaire médiées par les récepteurs et la capacité cytolytique des PBMC effecteurs. Ces tests rapides peuvent être utiles pour évaluer les produits et comprendre les effets potentiels à long terme de l’exposition au tabac.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parmi les autres modifications physiopathologiques, l'exposition chronique à la fumée de cigarette provoque une inflammation et une suppression immunitaire, qui ont été liés à une sensibilité accrue des fumeurs à des infections microbiennes et l'incidence des tumeurs. Ex vivo suppression des réponses immunitaires médiés par les récepteurs dans les cellules mononucléaires périphériques humaines du sang (PBMC) traité avec constituants de la fumée est une approche intéressante pour étudier les mécanismes et d'évaluer les effets probables à long terme de l'exposition aux produits du tabac. Ici, nous avons optimisé méthodes pour effectuer des dosages ex vivo en utilisant des PBMC stimulés par un lipopolysaccharide bactérien, un récepteur de ligand-4 de type Toll. Les effets de milieu de la fumée conditionné ensemble (WS-CM), une préparation de produits du tabac combustible (TPP), et la nicotine ont été étudiés sur la sécrétion de cytokines et de destruction des cellules cible par les PBMC dans les tests ex vivo. Nous montrons que des cytokines sécrétées IFN-γ, le TNF, l'IL-10, IL-6 et IL-8 et des cytokines intracellulaires IFN47 ;, TNF-α, MIP-1α et ont été supprimées dans les CMSP WS-CM-exposées. La fonction cytolytique des PBMC effectrices, telle que déterminée par un dosage de cellules cibles K562 tuant a également été réduite par exposition à WS-CM; la nicotine est très peu efficace dans ces essais. En résumé, nous présentons un ensemble de tests améliorés pour évaluer les effets du PPT en essais ex vivo, et ces méthodes pourraient être facilement adaptés pour tester d'autres produits d'intérêt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un ensemble considérable de points de connaissances sur les effets néfastes sur la santé du tabagisme chronique, notamment les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et le cancer 1,2. Chronique tabagisme a été connu pour causer l'inflammation et l'immunosuppression, et ces modifications sont signalés à contribuer à un risque accru d'infection microbienne et le cancer chez les fumeurs 3. In vitro et ex vivo techniques sont utiles pour élucider la base moléculaire des effets physiopathologiques de la fumée de cigarette 4-9 (tableau 1) et sont reconnus comme des outils importants pour guider la réglementation émergent de différents produits du tabac 10,11.

Par exemple, nous avons démontré que les préparatifs combustibles de produits du tabac (PPT) comme milieu complet de fumée conditionné (WS-CM) et la matière particulaire totale (TPM) sont beaucoup plus cytotoxique et dommageable pourADN que PPT non combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, il a été récemment rapporté que PPT combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, nous avons récemment signalé que PPT combustibles causés immunosuppression marquée. Ceci a été démontré par la suppression de Toll Like Receptor (TLR) -ligands, stimulé la sécrétion de cytokines, et la cellule ciblée (K562) tuer par les PBMC dans un modèle ex vivo 14. Étant donné l'importance de l'inflammation dans les processus de la maladie induite fumée cigarettes, poursuite de l'optimisation des conditions d'essai pour évaluer les effets immunomodulateurs de la fumée de cigarette est présenté dans ce rapport.

Les essais ex vivo typiquement mesurés et intracellulaire des cytokines ainsi que la fonction cytolytique de cellules NK et T cytotoxiques dans la cellule K562 tuant des dosages 14 sécrétées. Les dosages impliqués pré-incubation avec WS-CM et la nicotine et la stimulation ultérieure de PBMCs avec agonistes de TLR pendant une période de 3 jours; les lectures finales sont effectuées en utilisant des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et / ou la cytométrie de flux. Nous avons utilisé le lipopolysaccharide bactérien (LPS), qui se lie à des récepteurs TLR-4 stimule les PBMC et conduisant à la production de cytokines intracellulaires et la sécrétion de cytokines. En plus de l'optimisation des différentes étapes essai pour l'évaluation des effets immunomodulateurs de PPT, nous avons également présents procédés pour isoler les PBMC, des dosages de mort cellulaire et de l'IL-8 quantification. Ces méthodes peuvent être appliquées pour aborder d'autres questions de recherche et affinés pour évaluer les produits du tabac dans le contexte réglementaire.

Tableau 1. Publié rapports de in vitro et ex vivo méthodes utilisées pour étudier les effets physiopathologiques Varilux de préparations de produits du tabac CS, le milieu de la fumée de cigarette. SCC, la fumée de cigarette condensat; CST, cigarette extrait de fumée; ELISA, enzyme dosage immunoenzymatique; GADPH, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; qPCR, réaction quantitative en chaîne par polymérase; RT en temps réel réaction en chaîne par polymérase quantitative; TS, la fumée de tabac.

Auteur (Année de l'étude) Laan et al. (2004) Moodie et al. (2004) Oltmanns et al. (2005) Vayssier (1998) Witherden et al. (2004) Birrell et al. (2008)
Les cellules utilisées Cellules bronchiques humaines de l'endothélium (BEAS-2B), les neutrophiles humains Cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) Les cellules musculaires lisses des voies respiratoires humaines (HASMC) Cellules U937 prémonocytique humaines, des monocytes humains Alvéolaires de type II cellules épithéliales (ATII) Monocytaire humainelignée cellulaire (THP-1), les macrophages pulmonaires humaines
TPP utilisé CST SCC CST TS CST CS
Méthode utilisée ELISA, qPCR, la migration, l'électromobilité changement Immuno-chimie, électrophorèse, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, PCR quantitative, l'électrophorèse Gel-décalage de mobilité La microscopie optique, la microscopie électronique, l'électrophorèse, ELISA qPCR, ELISA, kit E-TOXATE (Sigma), plaque de p65 dosage (TransAM), électrophorèse, diverses trousses d'immunoessais
Mesure IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migration histones acétyltransférases, les histones désacétylases, NF-kB, IL-8, pI-kB α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, l'éotaxine Heat Shock / protéines de stress (HSP / Hsp70), HF facteur de transcription NF-kB,TNF-α Protéine tensioactif (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, le TNF-α, IL-1β, l'IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, α-MIP1, GRO-α, MAPK / JNK / phosphorylation de ERK, cJun: liaison à l'ADN, le glutathion, p65: liaison à l'ADN
Résultat final CST régule à la baisse la production de cytokines par la suppression de l'AP-1 activation. H 2 O 2 et SCC améliorer acétylation des histones, diminuer l'activité histone déacétylase, différentielle régulent la libération de cytokines pro-inflammatoires. La fumée de cigarette peut causer la libération d'IL-8 de HASMC, renforcée par le TNF-α, 20% moins CST IL-8 libération, inhibition de l'éotaxine et RANTES par la fumée de cigarette. TS HF activés facteur de transcription qui a été associée à la surexpression de la Hsp70 et l'inhibition de l'activité NFkB et de TNF-α libération de liaison. Réduction ATII niveaux de chimiokines dérivées de cellules compromis alveolar réparation, contribuant à la cigarette induit fumée lésions alvéolaires et l'emphysème. Données fournissent explication mécaniste pour les infections respiratoires pourquoi les fumeurs ont augmenté. Suppression de la réponse innée se accompagne d'une augmentation de l'IL-8.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTE: le consentement éclairé de faire cette étude a été obtenue à une unité clinique locale de recherche sous approbation de l'IRB, par les bonnes pratiques cliniques. Traitement du sang, l'isolement des PBMC et d'autres expériences de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles, l'utilisation de consommables et réactifs microbiologiquement stérile.

1. Préparation WS-CM

  1. Générer WS-CM comme décrit précédemment 12.
    1. Préparer WS-CM en passant la fumée de quatre 3R4F cigarettes de référence grâce à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640 milieu sans rouge de phénol, avec un schéma de fumer suivante: 35-60-2, volume de bouffée en ml, intervalle entre chaque bouffée en sec, et la durée feuilletée en sec, respectivement. Chaque préparation génère un échantillon de 20 ml.
  2. tube (s) de l'étiquette avec la date, l'heure d'achèvement, et le nom et le numéro de cigarette. Conserver les 500 ul aliquotes à -80 ° C immédiatement après le tabagisme est terminée.
  3. Analyser aliquotes de WS congelés-CM Pour déterminer les niveaux de nicotine, les nitrosamines spécifiques du tabac, et les hydrocarbures aromatiques polycycliques comme décrit précédemment 12.

2. Isolement de PBMC

  1. Prélever le sang frais provenant de donneurs sains (qui sont des non-consommateurs de produits du tabac) Isoler PBMC de sang frais comme décrit ci-dessous sous une approbation distincte du Wake Forest Baptist Health CISR 15.
    1. Avant l'arrivée de la poche de sang, une bouteille de 500 ml, des ciseaux, un tampon d'isolement et tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (DPBS) (RT) prêt à un niveau de biosécurité 2 (BSL-2) culture de cellules capot. tampon d'isolement doit être protégé de la lumière.
    2. Tenir le sac de sang à l'envers et couper le tube juste au-dessous où il a été serré laissant au moins 3 cm de tube.
    3. Retirez le bouchon de la bouteille de 500 ml et de maintenir le tube dessus de l'ouverture de la bouteille. Ramassez le sac de sang et l'inverser pour permettre au sang de circuler librement dans le sac dans til bouteille jusqu'à ce que le sac est vide. Laisser le sang de circuler sur le mur intérieur de la bouteille vers le bas par rapport à éviter la formation de bulles.
    4. Verser le tampon d'isolement dans la bouteille à un rapport de 1: 5 de tampon d'isolement de sang. Boucher le flacon et inverser doucement, fin-over-end, 10 fois. Laisser le flacon dans la hotte de culture de cellules à incuber avec des lumières, pour une heure à température ambiante.
    5. Une couche de lumière, couleur paille va construire au-dessus du sang. Enlever cette couche à l'aide d'un 25 ml pipette sérologique dans 50 ml tubes coniques. Le montant perçu peut varier de 50 à 300 ml, en fonction du sujet qui a fait don de sang.
    6. Centrifuger les tubes à 200 xg pendant 10 min à température ambiante.
    7. Aspirer le surnageant translucide, laissant le sang-pastille de couleur sombre. Le culot sera en vrac, mais visqueux.
    8. Pipette 3 ml de tampon d'isolement dans 15 ml tubes coniques.
    9. Pour remettre en suspension le culot, ajouter 20 ml de DPBS pour tous les 50 ml de liquide de couleur paille recueillies dans sTep 2.1.5. Vortex pour bien mélanger, et de consolider le liquide remis en suspension à partir de tubes multiples. Ce liquide contient en suspension des cellules sanguines.
    10. Avec une pipette de transfert, le transfert de 5 ml de globules en suspension sur 3 ml de tampon d'isolement dans l'étape 2.1.8. Incliner le tube conique de 15 ml contenant la suspension de cellules doucement et lentement pour créer deux couches séparées. Centrifuger les tubes à 400 xg pendant 40 min à température ambiante avec une accélération minimale et sans frein.
    11. Utilisez une pipette de transfert pour enlever la couche résultant trouble du milieu (buffy coat) contenant PBMC dans un tube conique de 50 ml. Éviter de tirer d'autres couches claires en dessous. Transfert pas plus de 25 ml dans chaque 50 ml tube conique.
    12. Ajouter 25 ml de tampon froide (ou plus pour remplir la totalité du volume restant de la 50 ml tube conique) pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    13. Reprendre le culot avec 10 ml de tampon en cours d'exécution. Celui-ci contient des PBMC. Compter les cellules et utiliser immédiatement ou placer sur la glace pour la congélation.

3. congélation et la décongélation de la CMSP

  1. Centrifugeuse les PBMC qui ont été recueillies à l'étape 2.1.13 pendant 10 min à 400 x g.
  2. Remplir le récipient de congélation avec de l'alcool isopropylique selon les instructions du fabricant. ATTENTION: L'alcool isopropylique est inflammable et très toxique.
  3. Remettre en suspension le culot avec du milieu RPMI 1640 (4 ° C) contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS) et 10% de sulfoxyde de diméthyle (DMSO). Ce est un milieu RPMI 1640 de congélation. Reprendre le culot avec une quantité de milieu de congélation qui se traduira par une suspension ayant environ 5 x 10 7 cellules / ml. Le nombre de cellules disponibles pour la congélation peut varier.
  4. Distribuer des aliquotes de 1 ml de suspension de cellules dans des cryotubes de 2 ml et placer les cryotubes dans le récipient de congélation. Placer le récipient de congélation avec cryotubes dans un congélateur à -80 ° C pour stocker O / N puis retirez les cryotubes et transfert à stocker dans unCongélateur cryogénique entre -150 ° C à -190 ° C.
  5. Retirer le cryotube de stockage cryogénique et décongeler rapidement sous agitation douce dans un bain d'eau à 37 ° C.
  6. Transférer immédiatement les PBMC décongelées dans le cryotube dans un tube conique de 15 ml avec 10 ml du milieu RPMI 1640 complet (4 ° C) contenant 10% de FBS, 1% de Pen / Strep et 1% de L-glutamine. Le contenu du cryotube décongelés doivent être transférés dès que possible pour obtenir la viabilité cellulaire maximale 15.
  7. Centrifuger les PBMC à 400 xg pendant 10 min.
  8. Reprendre le culot avec 5 ml du milieu RPMI 1640 complet et compter les cellules.
  9. Mesurer la viabilité des cellules par des méthodes établies, telles que la méthode d'exclusion au bleu trypan. Généralement, la viabilité des cellules avec cette méthode est d'environ 90 - 95%. Les PBMC sont maintenant prêts à utiliser dans des expériences.

Mort cellulaire 4. Détermination

NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette study. Les dilutions peuvent être modifiés en conséquence.

  1. Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits, comme indiqué ci-dessous.
  2. Diluer WS-CM aux concentrations suivantes: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, et 5 pg / ml d'unités d'équi-nicotine (sur la base de la teneur en nicotine dans WS-CM) 12.
  3. Diluer nicotine dans du milieu RPMI aux concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l'environnement.
  4. Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits.
  5. Aux fins de cette étude, préparer deux jeux de plaques comme ci-dessus. Couvrir les plaques et incuber une plaque pendant 24 heures et une plaque pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Ajuster les points de temps que nécessaire.
  6. Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 g pendant 3 min, l'aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
  7. Ajouter 95 ul de tampon suivie par 5 ul de 7-aminoactinomycine D (7AAD) à chaque puits pour un volume total de 100 ul / puits en cours d'exécution. Incuber la plaque à l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
  8. Ajouter 100 pi de tampon pour courir tubes de munitions. Transférer tout le volume de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d'acquérir les échantillons sur cytomètre de flux.
  9. Déterminer le pourcentage de cellules 7AAD positif en utilisant la cytométrie de flux logiciel d'analyse.

5. CE 50 Détermination

  1. Les valeurs de CE 50 de WS-CM et la nicotine sont déterminées par 7AAD-coloration positive des PBMC.
  2. La valeur EC 50 est définie comme la concntration à laquelle 50% des cellules ne était plus viable dans un dosage de 24 heures, et les valeurs sont exprimées en pg d'équi-nicotine unités / ml.
  3. Pour les fins de cette étude, les valeurs CE 50 ont été jugées 1,56 pg / ml et 1 650 pg / ml pour WS-CM et la nicotine, respectivement.

6. cytokines sécrétées

NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence.

  1. Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d'unités d'équi-nicotine.
  2. Diluer nicotine pour les concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l'environnement.
  3. Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits.Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits.
  4. Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Laver les cellules par centrifugation à la température ambiante à 300 x g pendant 3 min, aspiration du surnageant, le vortex inférieure de la plaque à plaque recouverte et finalement les cellules en suspension avec 200 ul de la glace froide courante tampon et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
  6. Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
  7. Ajouter 200 ul de 10 ug / ml de LPS milieu à chaque puits.
  8. Couvrir la plaque et incuber pendant 4 h, 24 h, 48 h, 72 h ou à 37 ° C et 5% de CO 2. Régler des temps d'incubation nécessaire.
  9. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 3 min.
  10. Prenez 175 pi de surnageant de chaque puits et de stocker dans un congélateur à -80 ° C pour effectuer les tests dans les étapes 7 et 8.

7. cytométrie Bead Assay tableau

  1. Décongeler les surnageants cellulaires préparés à partir de l'étape 6.10 et l'utilisation dans le dosage de l'ABC. Effectuez le test réseau de billes cytométrique (ABC) selon les instructions du fabricant.

8. ELISA IL-8

  1. Décongeler les surnageants de cellules de l'étape 6.10 et l'utilisation dans l'IL-8 ELISA. Effectuer le test ELISA selon les instructions du fabricant.

9. intracellulaire coloration et cytométrie de flux

NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence.

  1. Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d'unités d'équi-nicotine.
  2. De la même plaque, diluer la nicotine aux concentrations suivantes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, et 4000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et Hazar environnementdous.
  3. Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1 × 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits.
  4. Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 x g pendant 3 min, l'aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
  6. Ajouter 200 pi de milieu RPMI complet à la plaque, et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
  7. Préparer les concentrations de travail de 2 ul / ml GolgiPlug et 10 ug / ml de LPS en utilisant un milieu RPMI complet et ajouter 200 ul dans chaque puits.
  8. Incuber la plaque pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  9. A la fin de l'étape 9.8, laver les cellules avec un tampon en cours d'exécution (4 ° C) et tournant à 300g pendant 3 min à 4 ° C.
  10. Ajouter 100 ul de Cytofix à chaque puits et incuber pendant 20 min à 4 ° C.
  11. Laver les cellules trois fois comme décrit dans l'étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) à 300 g pendant 3 min à 4 ° C.
  12. Ajouter 45 ul de 1 x Cytoperm à chaque puits suivi par 5 ul de chacun de l'un des anticorps suivants dans chaque puits: TNF-α-Alexa Fluor 488, l'IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.
  13. Laver les cellules deux fois comme décrit à l'étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) et une fois avec du tampon (4 ° C) fonctionnant à 300 x g pendant 3 min à 4 ° C.
  14. Remettre en suspension les cellules avec 200 pi de paraformaldehyde à 2% (4 ° C). Transférer les cellules dans 12 × 75 mm tubes, et analyser les échantillons sur cytomètre de flux. ATTENTION: Paraformaldéhyde est corrosive, très toxique et dangereux pour la santé.

10. K562 Assay Tuer

REMARQUE: les cellules K562 doivent être cultivéesen culture à 37 ° C et 5% de CO 2 avec un milieu RPMI complet jusqu'à ce qu'elles atteignent 80% de confluence avant l'essai.

  1. Préparer une solution 5 mM carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) du stock en ajoutant 18 pi de DMSO dans le flacon.
  2. Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits pour atteindre les unités d'équi-nicotine ou les concentrations souhaitées de nicotine pour chaque puits. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l'environnement.
  3. Ajouter 100 ul de PBMC dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1,5 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules avec ou WS-CM nicotine sera de 200 pl / puits.
  4. Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Laver les cellules K562 en ajoutant 10 ml de DPBS et centrifuger à 400 g pendant 8 min à température ambiante.
  6. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de DPBS et compter les cellules K562.
  7. Préparer CFSE working solution en ajoutant 1 pl de CFSE solution stock à 1 ml DPBS.
  8. Ajouter 1 ml de la solution de travail CFSE à 1 ml de la suspension de cellules K562 contenant 1 à 2 x 10 7 cellules. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante.
  9. Immédiatement ajouter 200 pi de FBS. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante.
  10. Ajouter 10 ml de milieu RPMI complet et centrifuger le tube à 400 g pendant 8 min à température ambiante.
  11. Eliminer le surnageant RPMI et de briser le culot et remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu RPMI complet et compter les cellules K562 CFSE-étiquetés.
  12. Laver les PBMC par centrifugation de la plaque à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant par décantation le liquide. Replacer le couvercle et Vortex bas de la plaque. Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet et répéter l'étape de lavage une fois de plus.
  13. Ajouter des cellules K562 marquées au CFSE dans un rapport de 1:15 (100,000 K562s: 1,5 x 10 6 CMSP) à chaque puits d'échantillon de la plaque et en outre i PBMCncubate pendant 5 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  14. Laver le mélange de cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant en éliminant le liquide. Placer le couvercle et vortexer le bas de la plaque.
  15. Ajouter 200 ul de tampon de migration et répéter l'étape de lavage décrit dans l'étape 10,14 une fois de plus.
  16. Ajouter 95 ul de tampon de migration suivi par 5 ul de 7AAD à chaque puits pour un volume total de 100 pl / puits. Incuber la plaque à l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
  17. Ajouter 100 ul de tampon en cours d'exécution à chaque puits et transférer la totalité du volume de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d'acquérir les échantillons sur cytomètre de flux.
  18. Déterminer le pourcentage de cellules positives et 7AAD CFSE-positifs en utilisant la cytométrie de flux logiciel d'analyse.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (quatre échantillons de donneurs). T-test de Student entre les échantillons de contrôle traités et non traités a été réalisée en utilisant le logiciel Excel ainsi que des comparaisons t-test pour tous les traitements avec leurs contrôles correspondants. La signification statistique est indiquée par: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.

Pour mesurer l'effet de l'exposition à WS-CM et la nicotin...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous et d'autres avons précédemment démontré que le traitement des PBMC avec PPT inhibe plusieurs réponses, y compris l'expression et la sécrétion de cytokines et les mesures fonctionnelles telles que la cellule cible 14 tuant. Les méthodes expérimentales décrites dans l'ouvrage précédent nécessitent des périodes d'incubation plus longues et ont été modestes en amplitude 14. Étant donné les applications potentielles de cette jolie modèle ex vivo pour la recherche fondamenta...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est financé par RJ Reynolds Tobacco Company (de RJRT) en vertu d'un accord de collaboration de recherche avec l'École de médecine Wake Forest University. GL Prasad est un employé à temps plein de la RJRT.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
12 tubes de 75 mmBD Falcon352058
tubes coniques de 15 mlCorning430790
Microtubes de 2 mlAxygenMCT-150-C-S
3R4F cigarettes de référenceUniv. of Kentucky, College of Agriculture3R4F
Tubes coniques de 50 mlCorning430828
flaconde 500 mlCorning430282
7AADBD Pharmingen559925
Plaque à fond plat à 96 puitsTermo Nunc439454
Plaques à fond rond à 96 puitsBD Falcon 353077
Hotte de culture cellulaireThermo Scientific1300 Series A2
Centrifugeuse Eppendorf58110R
CFSESondes moléculaires Life TechnologiesC34554
Tubes en grappeCorning4401Nocif en cas d’ingestion, cancérigène
Cytofix/Cytoperm (Permwash)BD Biosciences555028Inflammable
DMSO (diméthylsulfoxyde)Sigma-AldrichD8418
DPBSLonza17-512F
FBSSigma-AldrichF2442
FCAP ArrayBD Biosciences652099Le logiciel analyse les données CBA
Unité de filtrageNalgene156-4020
Cytomètre en fluxBD BiosciencesFACS Canto II8 couleurs, à Ex 405 et Em 785.
Cytomètre en fluxBD BiosciencesFACS Calibur4 couleurs à Ex 495 et Em 785.
Logiciel d’analyse par cytométrie en fluxTree StarFlowJo
Conteneur de congélationNalgene5100-0001Contient du DMSO, irritant
GogliPlugBD Biosciences555029Cancérogène, irritant, corrosif
H2SO<>4Sigma-Aldrich339741
Kitde cytokines inflammatoires humainesBD Biosciences551811
IFN-&gamma ; V-500 AnticorpsBD Horizon561980Sensibilisant cutané
IL-8 ELISA KitR and D SystemsDY208
Tampon d’isolementIsolymph, CTL Scientific Corp.1114868Liquide inflammable, irritant
Alcool isopropyliqueSigma-AldrichW292907
L-GlutamineGibco Life Technologies25030-081
LPSSigma-AldrichL2630
MIP1-&alpha ; PE AnticorpsBD Pharmingen554730Toxicité aiguë, orale
MonensinSigma-AldrichM5273
NaClSigma-AldrichS7653
NicotineSigma-AldrichN3876Toxicité aiguë, danger pour l’environnement
ParafilmBemis" M"
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148Inflammable, irritation cutanée
Pen/streptocoqueGibco Life Technologies15140-122
RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
Tampon defonctionnement MACS Tampon de fonctionnement, Miltenyi Biotech130-091-221
Th1/Th2 CBA KitBD Biosciences551809
TNF-&alpha ; Alexa Fluor 488 AnticorpsBioLegend502915
Pipette de transfertFisher Scientific13-711-20
Tris BaseSigma-AldrichT1503

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
  2. Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
  3. Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
  4. Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
  5. Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
  6. Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
  7. Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74(2005).
  8. Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
  9. Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
  10. Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
  11. Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
  12. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
  13. Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
  14. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
  15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
  16. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
  17. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
  18. Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Pr paration de produits du tabaccellules mononucl es du sang p riph riques cr tion de cytokinescytotoxicit envers les cellules ciblescytom trie en fluxmilieu conditionn par la fum e enti reessai de cytotoxicit sur cellules K562marquage intracellulairemarquage au CFSEstimulation au LPS

Articles connexes