Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Chaînes et transporteurs

Résumé

Les protéoliposomes sont utilisés pour étudier les canaux purifiés et les transporteurs reconstitués dans un environnement biochimique bien défini. Une procédure expérimentale pour mesurer l’efflux médié par ces protéines est illustrée. Les étapes de préparation des protéoliposomes, d’enregistrement et d’analyse des données pour déterminer quantitativement les propriétés fonctionnelles de la protéine reconstituée sont décrites.

Résumé

Les 15 dernières années ont été caractérisées par une explosion de la capacité à surexprimer et à purifier les protéines membranaires des organismes procaryotes ainsi que des eucaryotes. Cette augmentation a été largement motivée par la poussée réussie pour obtenir des informations structurelles sur les protéines membranaires. Cependant, la capacité d’interroger fonctionnellement ces protéines n’a pas progressé au même rythme et est souvent limitée à des tests qualitatifs de valeur quantitative limitée, limitant ainsi les informations mécanistes qu’elles peuvent fournir. Un test permettant d’étudier quantitativement l’activité de transport des canaux ou transporteurs de Cl^- reconstitués est décrit. Le dosage est basé sur la mesure du taux d’efflux de Cl^- des protéoliposomes suite à l’ajout de l’ionophore K⁺ valinomycine pour shunter le potentiel membranaire. Une électrode sensible aux ions est utilisée pour suivre l’évolution temporelle de l’efflux d’ions à partir de protéoliposomes reconstitués avec la protéine souhaitée. La méthode est très adaptée aux études mécanistes, car elle permet de déterminer quantitativement les propriétés clés de la protéine reconstituée, telles que son taux de transport unitaire, la fraction de protéine active et la masse moléculaire de l’unité fonctionnelle. Le test peut également être utilisé pour déterminer l’effet de composés à petites molécules qui inhibent/activent directement la protéine reconstituée, ainsi que pour tester les effets modulateurs de la composition membranaire ou des réactifs modifiant les lipides. Dans la mesure du possible, la comparaison directe entre les résultats obtenus à l’aide de cette méthode s’est avérée être en bon accord avec ceux obtenus à l’aide d’approches électrophysiologiques. La technique est illustrée à l’aide de CLC-ec1, un échangeur H⁺/Cl^- de type CLC, comme système modèle. Le test d’efflux peut être utilisé pour étudier n’importe quel canal/transporteur conducteur de Cl et, avec des changements minimes, peut être adapté pour étudier n’importe quelle protéine transporteuse d’ions.

Introduction

Dans les deux dernières décennies, la capacité de surexprimer et purifier des protéines de transport membranaire a considérablement augmenté: les canaux ioniques, les transporteurs primaires et secondaires sont maintenant couramment purifiés à partir de systèmes d'expression hétérologues, ainsi que des sources naturelles. De nouvelles approches pour surveiller l'expression, améliorer et faciliter l'extraction et à améliorer la stabilité de ces protéines sont constamment mises au point ^1-5. Ces avancées technologiques ont joué un rôle dans le déclenchement de l'explosion de l'information structurelle niveau atomique de protéines membrana....

Protocole

1. Préparation des lipides

1. Aliquoter les lipides quantité désirée dans un tube de verre clair. Tu Vois. coli extrait lipidique polaire, mais la plupart des compositions lipidiques peuvent être utilisés. Si les lipides sont sous forme de poudre, les remettre en suspension dans du chloroforme à une concentration de 20 mg / ml. Sécher les lipides à température ambiante sous _N2 gaz jusqu'à ce que tout le solvant se est évaporé.
2. Reprendre les lipides dans le pentane et le sécher à nouveau un flux régulier de gaz N ₂ pour éliminer les traces de restes de chloroforme. Sec jusqu'à ce que tout le solvant se ....

Résultats

Nous décrivons un protocole détaillé et robuste pour mesurer Cl ^- le transport médié par la SIC-ec1 purifiée, un type CTC procaryote H ⁺ / Cl ^- échangeur, reconstituée dans des liposomes. Une représentation schématique de l'expérience est illustré à la figure 3 protéoliposomes reconstituées avec la SIC-ec1 purifié et contenant haute Cl interne ^-. Sont immergés dans une solution de bain contenant faible Cl ^-. Dans ces conditions Cl net ^-

Discussion

Nous avons décrit un protocole détaillé pour mesurer Cl ^- le transport médié par les canaux ou transporteurs reconstitués dans des liposomes anioniques sélectif purifiés. L'exemple utilisé était le procaryote H ⁺ / Cl ^- Échangeur CLC-CE1. Toutefois, la méthode peut être facilement adapté à l'étude canaux gated par des ligands ^{12,13,15, 11,12} tension, ou de sport différente sélectivité anionique ^15,16 en remplaçant le Ag: AgCl par celle adaptée pour l'ion.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Liposomicateur, Avanti Polar Lipids Inc.	; Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Compteur			Ceux-ci peuvent être trouvés sur Ebay.
Sonde de pH non fonctionnelle N’importe			quelle sonde de pH-mètre avec des fils d’argent fonctionnera. Le revêtement en verre/plastique doit être enlevé et les fils nettoyés.
DI-710 Enregistreur de données	DATAQ instruments
Logiciel d’acquisition WinDAQ Instruments	DATAQ Colonnes
en plastique jetables Pierce, écoulement par gravité, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
Tubes de culture KIMAX, jetables, verre borosilicaté	Kimble Chase	73500-13100
Set d’extrudeuse avec support/bloc	chauffantAvanti Polar Lipids Inc.	610000
Ordinateur

numérique pH-mV