Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

Résumé

Ici, nous présentons un protocole sur la façon de déterminer la quantité et la distribution des métaux dans un échantillon à l’aide de la fluorescence X synchrotron. Nous nous concentrons sur les cellules adhérentes et décrivons la méthode de fixation chimique pour préparer cet échantillon. Nous décrivons ensuite comment monter et imager l’échantillon à l’aide de rayons X synchrotron.

Résumé

L’imagerie par fluorescence X nous permet de mesurer de manière non destructive la distribution spatiale et la concentration de plusieurs éléments simultanément sur de grandes ou petites zones d’échantillons. Il a été appliqué dans de nombreux domaines scientifiques, notamment la science des matériaux, les géosciences, l’étude des œuvres du patrimoine culturel et la biologie chimique. Dans le cas de la biologie chimique, par exemple, la visualisation de la distribution des métaux à l’intérieur des cellules nous permet d’étudier à la fois les ions métalliques naturels dans les cellules, ainsi que les métaux introduits de manière exogène tels que les médicaments et les nanoparticules. En raison de la nature entièrement hydratée de presque tous les échantillons biologiques, la cryofixation suivie d’une imagerie sous température cryogénique représente la modalité d’imagerie idéale actuellement disponible. Cependant, dans les circonstances où une telle combinaison n’est pas facilement accessible ou pratique, la fixation chimique à base d’aldéhyde reste utile et parfois inévitable. Cet article décrit avec autant de détails que possible la préparation de cellules de mammifères adhérents par fixation chimique pour l’imagerie par fluorescence X.

Introduction

X-ray imagerie de fluorescence permet à la fois l'identité et la quantité des éléments présents dans un échantillon à spatialement résolue. Rayons X incidents, d'une énergie choisie pour être supérieure à l'énergie de l'élément le plus lourd d'intérêt liaison électronique, surmonter l'énergie de liaison des électrons intérieure-shell pour le noyau ^1. Cela crée un «trou» dans la couche électronique. Comme les électrons de haute énergie tombent dans ces trous, les rayons X fluorescents sont émis, dont la longueur d'onde dépend de l'énergie de séparation de ces orbitales. Étant donné que l'espacement en énergie des orbitale....

Protocole

1. Préparation des instruments, des substrats, Culture Media et Plats

1. Manipulation de nitrure de silicium (Si ₃ N ₄₎ fenêtres.
   1. Ouvrir la capsule légèrement en serrant une extrémité portant la fenêtre de manière à ne pas serrer la fenêtre elle-même, tout en faisant tourner l'autre extrémité de la capsule avec l'autre main.
   2. Vérifiez une paire de revers, pinces à pointe fine sous stéréomicroscope pour se assurer qu'il n'y a pas de colle, des lacunes ou des coudes à la pointe. Sinon, les fenêtres peuvent être brisés par la pince à épiler ou se envolent d'entre eux au cours des étapes subséquentes.

Résultats

La capacité de l'imagerie par fluorescence des rayons X pour fournir des informations sur les échantillons biologiques est subordonnée à ces échantillons préparés d'une manière telle qu'ils résistent à dégâts d'irradiation sur l'échelle de temps de l'expérience, et encore leurs caractéristiques chimiques et structurelles sont bien préservé. Dans l'affichage le résultat d'un échantillon qui a été préparé comme décrit ci-dessus et imagé, il est possible de voir qu'il existe des variatio.......

Discussion

X-ray imagerie de fluorescence est utile dans de nombreux domaines, y compris les sciences de la terre, la science des matériaux et la biologie chimique ^26-34. Les progrès dans les rayons X synchrotron, et leur mise au point, ont produit de très faisceaux de haute intensité. Focused X-faisceaux de rayons suffisante pour exciter les métaux endogènes dans les cellules exister maintenant, de production de signal qui peut être mesurée avec la technologie actuelle silicium détecteur de dérive. Et l'étude de la.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fenêtres en nitrure de silicium	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW,	Royaume-Uni SiRN-5.0-200-2.0-200. Trier par taille. Taille de la membrane : 1,5 mm x 1,5 mm. Épaisseur : 200 Nm. Taille du cadre : 5 mm x 5 mm. Épaisseur du cadre : 200 & micro ;m.	Autre source : SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, Pennsylvanie.
Pince à épiler inversée	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tél. : 215-412-8400, Sans frais : 800-523-5874, Fax : 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC &ndash ; Pince à épiler ultra fine
Tapis de grille en caoutchouc	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tél. : 215-412-8400, Sans frais : 800-523-5874, Télécopieur : 215-412-8450	71170	Tapis de grille ronde
Acide acétique	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tél. : 800-325-3010, Télécopieur : 800-325-5052	338826	métal trace grade acide acétique concentré
PIPES	tamponSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tél. : 800-325-3010, Fax : 800-325-5052	P6757	Solid PIPES
buffer Formaldehyde stock	solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tél. : 215-412-8400, Sans frais : 800-523-5874, Fax : 215-412-8450	RT 17113	10 ampoules de 10 ml de paraformaldéhyde aqueux à 20 %