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Article de méthode

Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

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DOI :

10.3791/52370

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12 mars 2015

 , 
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole sur la façon de déterminer la quantité et la distribution des métaux dans un échantillon à l’aide de la fluorescence X synchrotron. Nous nous concentrons sur les cellules adhérentes et décrivons la méthode de fixation chimique pour préparer cet échantillon. Nous décrivons ensuite comment monter et imager l’échantillon à l’aide de rayons X synchrotron.

Résumé

L’imagerie par fluorescence X nous permet de mesurer de manière non destructive la distribution spatiale et la concentration de plusieurs éléments simultanément sur de grandes ou petites zones d’échantillons. Il a été appliqué dans de nombreux domaines scientifiques, notamment la science des matériaux, les géosciences, l’étude des œuvres du patrimoine culturel et la biologie chimique. Dans le cas de la biologie chimique, par exemple, la visualisation de la distribution des métaux à l’intérieur des cellules nous permet d’étudier à la fois les ions métalliques naturels dans les cellules, ainsi que les métaux introduits de manière exogène tels que les médicaments et les nanoparticules. En raison de la nature entièrement hydratée de presque tous les échantillons biologiques, la cryofixation suivie d’une imagerie sous température cryogénique représente la modalité d’imagerie idéale actuellement disponible. Cependant, dans les circonstances où une telle combinaison n’est pas facilement accessible ou pratique, la fixation chimique à base d’aldéhyde reste utile et parfois inévitable. Cet article décrit avec autant de détails que possible la préparation de cellules de mammifères adhérents par fixation chimique pour l’imagerie par fluorescence X.

Introduction

X-ray imagerie de fluorescence permet à la fois l'identité et la quantité des éléments présents dans un échantillon à spatialement résolue. Rayons X incidents, d'une énergie choisie pour être supérieure à l'énergie de l'élément le plus lourd d'intérêt liaison électronique, surmonter l'énergie de liaison des électrons intérieure-shell pour le noyau 1. Cela crée un «trou» dans la couche électronique. Comme les électrons de haute énergie tombent dans ces trous, les rayons X fluorescents sont émis, dont la longueur d'onde dépend de l'énergie de séparation de ces orbitales. Étant donné que l'espacement en énergie des orbitales est caractéristique d'un élément donné, la fluorescence de rayons X a également émission longueurs d'onde caractéristiques, dépendantes de l'élément. Ce est cette émission à une longueur d'onde caractéristique qui permet d'identifier les éléments présents. L'étalonnage de l'intensité de fluorescence permet la quantification des éléments présents.

Fluorescence X microscopy (XFM) est devenu de plus en plus utilisé, en partie grâce au développement de sources de rayonnement synchrotron à rayons X très brillants, tels que ceux à Spring-8 au Japon, la Facilité européenne de rayonnement synchrotron (ESRF) en France, et l'Advanced Photon Source ( APS) aux États-Unis 2. Ces sources fournissent de très haute intensité faisceaux de rayons X. Dans le même temps, des améliorations dans l'optique X-ray, comme la technologie de plaque de la zone, a permis la mise au point de ces faisceaux à taches sous-micron, mais plutôt inefficace 3. Avec mêmes faisceaux de haute intensité, même relativement petite quantité de lumière qui peut être concentrée est suffisante pour exciter les métaux endogènes dans les cellules, produisant un signal qui peut être mesurée avec la technologie de détection actuellement disponibles. Ainsi, l'étude de la biologie chimique des métaux dans la cellule est une application en particulier qui rend l'utilisation de la plupart des développements récents dans cette technique 4-10.

Il ya beaucoup de facteurs essentiels à prendre en considération tout appcouché XFM pour enquêter sur la répartition des éléments et la quantification des cellules de mammifères cultivées ou d'autres échantillons biologiques. Tout d'abord, l'échantillon doit être conservé intact, à la fois structurellement et par rapport à sa composition élémentaire, pour que la mesure ait un sens. En second lieu, l'échantillon doit également être conservée en quelque sorte de sorte qu'il est robuste aux dégâts d'irradiation qui peut être provoquée par un faisceau de rayons X focalisé. Une façon qu'un échantillon peut répondre à ces deux critères à la fois à congeler rapidement dans une glace amorphe vitreuse 11,12. Congélation rapide est souvent réalisée grâce à diverses techniques de cryoconservation telles que le gel de plongée ou à haute pression de congélation 13-16. Il est généralement admis que la cryoconservation préserve architecture cellulaire globale et des compositions chimiques dans des échantillons biologiques aussi près que possible l'état natif. Fixation chimique, d'autre part, à cause de la pénétration lente et sélective des fixateurs dans des cellules et des tissus en well modifications ultérieures de perméabilité de la membrane, peuvent permettre divers ions cellulaires en particulier les ions diffusibles tels que Cl, Ca et K pour être lessivés, perdus ou déplacés, ce qui rend l'enquête de ces éléments sous-optimaux 17-19. Malgré l'avantage évident de cryo-fixation sur la fixation chimique en général, pour les cellules mammifères adhérentes en particulier, la cryoconservation a diverses limitations 20-23. La plus évidente est que chaque laboratoire de recherche offre un accès facile aux instruments de cryoconservation. La plupart des congélateurs à haute pression ou même des courants plongent les congélateurs sont coûteux et détenue uniquement par un sous-ensemble d'installations cryogéniques, qui peut être loin de l'endroit où les cellules sont incubées. L'avantage de la cryoconservation pourrait être échangé contre l'inconvénient de stress Voyage placé sur les cellules. Ainsi, alors que la cryoconservation est certainement la façon la plus rigoureuse pour préserver des échantillons pour l'analyse par fluorescence de rayons X, il ne est certainement pas le plus accessible à tous les chercheurs dans toutes les circonstances;il ne est pas toujours indispensable - si les métaux d'intérêt sont étroitement liés à des macromolécules corrigeables, et la résolution à laquelle l'échantillon sera imagée est plus grande que les dommages à l'ultra-microstructure qui pourrait se produire au cours du séchage. Consciente des réserves 24, fixation chimique et le séchage peuvent être un choix approprié.

D'autres facteurs dans un X-ray expérience d'imagerie de fluorescence succès comprennent une analyse appropriée. X-ray imagerie de fluorescence est fondamentalement X-ray spectroscopie d'émission de fluorescence combinée avec raster-numérisation pour fournir une résolution spatiale. Les spectres émission de fluorescence à rayons X recueillies contiennent une combinaison de chevauchement des pics d'émission, de fond, et les pics de diffusion élastique et inélastique du faisceau incident. Logiciel qui permet la dé-convolution de ces contributions, et le montage des pics d'émission, est un développement important de ce domaine 25. En outre, le développement commercial et distribution normes de couches minces de composition connue, utilisée pour étalonner l'intensité de fluorescence par rapport à la quantité matière, est également très importante.

Ce protocole fournit une description de la préparation de cellules adhérentes par fixation chimique et séchage à l'air. Une étape cruciale dans ce processus est la croissance des cellules sur les fenêtres de nitrure de silicium, qui souvent ne adhèrent pas bien, ce qui rend le rinçage doux dans une clé de manière particulière à la réussite.

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Protocole

1. Préparation des instruments, des substrats, Culture Media et Plats

  1. Manipulation de nitrure de silicium (Si 3 N 4) fenêtres.
    1. Ouvrir la capsule légèrement en serrant une extrémité portant la fenêtre de manière à ne pas serrer la fenêtre elle-même, tout en faisant tourner l'autre extrémité de la capsule avec l'autre main.
    2. Vérifiez une paire de revers, pinces à pointe fine sous stéréomicroscope pour se assurer qu'il n'y a pas de colle, des lacunes ou des coudes à la pointe. Sinon, les fenêtres peuvent être brisés par la pince à épiler ou se envolent d'entre eux au cours des étapes subséquentes.
    3. Retirer la fenêtre de la capsule en saisissant soigneusement le châssis de la fenêtre avec une pince, tout en serrant doucement la capsule à proximité de l'extrémité ouverte en appliquant une pression dans une direction de manière à rendre la capsule plus large où les bords de la fenêtre doivent sortir.
  2. Fenêtre de pré-lavage (en option).
    1. Si vous le souhaitez, des fenêtres pré-lavage en les plongeant doucementdans de l'eau distillée pendant 5 secondes, suivie par 2 min lavage dans 70% d'éthanol et 2 min lavage dans 100% d'éthanol.
  3. Apposition et la stérilisation fenêtres sur la boîte de culture.
    1. Pour fixer les fenêtres, régler la fenêtre avec le côté plat vers le haut au bas de la boîte de culture, placez un morceau de ruban adhésif sur une lame de verre propre. Couper environ une bande quart de pouce descendre la côté long de la bande. Prendre une tranche de la bande sur le côté court (à ⅛ "de ¾") avec une lame de rasoir propre.
    2. Utiliser des pinces pour appliquer la tranche de la bande au bord de la grille ou de la fenêtre. Utiliser suffisamment pour la faire adhérer en toute sécurité sans couvrir l'ouverture de la fenêtre elle-même. Manipulation du ruban collé avec des pincettes, régler la fenêtre vers le bas sur le fond de la boîte de culture. Utilisez la pointe de la pince à adhérer bande au bas de la boîte de culture fermement.
    3. Appliquer une autre bande de ruban à l'autre bord et respecter ce au fond fermement avec le bout de la pince à épiler.
    4. Une fois que toutes les fenêtres sontenregistrée, stériliser fenêtres dans des boîtes de culture avec les rayons ultraviolets (UV). Accomplir cela en plaçant la capsule sous la lampe UV dans une hotte à flux laminaire pendant environ 1 h.
    5. (Facultatif) Si les fenêtres doivent être pré-revêtu de poly-lysine, faire la fenêtre suivante stérilisation. Enduire la fenêtre avec 10 pi de solution pendant 1 heure stérile 0,01% de poly-L-lysine dans un incubateur à 37 ° C, puis rincer la solution restante hors avec le milieu de culture.
  4. Préparation des tampons pour lavage final avant XFM.
    1. Préparer soit un tampon Tris-glucose ou pipérazine N, N '-bis (acide éthanesulfonique) (PIPES) -saccharose tampon exempt de tous métaux en traces, par l'osmolalité et le pH équivalent de tampon de phosphate de la solution saline de Dulbecco (D-PBS) sans calcium et magnésium. Utilisez l'un de ces tampons pour rincer les cellules après que les cellules sont fixés chimiquement.
      1. Pour préparer la solution de Tris-glucose (Tris 10 mM, glucose 260 mM, acide acétique 9 mM), ajouter 1,4 g de glucose, 36 mg de base Tris et16 ul d'acide acétique à 20 ml d'eau ultrapure. Ensuite, régler le volume final à 30 ml avec de l'eau ultra-pure. Aucun ajustement de pH ne est nécessaire. Stocker à température ambiante jusqu'à une semaine.
      2. Pour faire les pipes-saccharose (20 TUYAUX mM, saccharose 200 mM) ajouter 0,18 g de tuyaux et de 2,0 g de saccharose à 20 ml d'eau ultra pure et ajuster le pH à 7,4 avec de petites quantités d'acide acétique concentré. Ensuite, régler le volume final à 30 ml avec de l'eau ultra-pure. Stocker à température ambiante jusqu'à une semaine.
        REMARQUE: La raison d'éviter l'utilisation de PBS dans le rinçage final est que les concentrations de phosphate, chlorure et de potassium dans du PBS sont si élevés qu'il ne peut interférer avec XFM si elle ne est pas complètement éliminé avant séchage à l'air.
  5. Préparation des tampons pour le placage des cellules.
    1. Élaborer ou sur tous les médias, tel que le milieu RPMI 1640, 1x solution de trypsine-EDTA, D-PBS, et tous les autres réactifs que nécessaire pour la ligne de cellules adhérentes particulier qui normalement seraient fait pour repiquage des cellules adhérentes of intérêt, et les chauffer à 37 ° C.

2. Placage des cellules

  1. Dans la boîte de culture stérilisé contenant les fenêtres, dans la hotte à flux laminaire, ajouter doucement les supports (10 ml pour une boîte de culture de 100 mm), le long du côté de la boîte de culture avec elle selon un angle incliné. Éviter de créer la tension de surface inutiles ou de faire tomber les médias directement sur la surface des fenêtres de nitrure de silicium. Comme les médias est ajouté, soulager lentement l'angle d'inclinaison pour enrober la grille et la fenêtre avec les médias.
  2. Préparer la ligne de cellules adhérentes d'intérêt appropriée, trypsinisation ou gratter les cellules hors des plaques comme d'habitude pour repiquage de la lignée cellulaire. Effectuez l'une numération cellulaire, ou autre préparation nécessaire avant d'appliquer les cellules à la plaque frais.
  3. Ajouter les cellules de la boîte de culture avec des fenêtres à une densité cellulaire qui est nécessaire pour atteindre typiquement 50% à 70% de confluence au sein de 24 à 72 h, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.
  4. Observer la croissance de cellules de temps en temps, en utilisant un microscope optique inversé, jusqu'à ce que la densité cellulaire souhaitée (généralement de 50% à 70% de confluence) est atteinte.

3. Fixation de cellules

  1. Préparer une solution fraîche de paraformaldehyde à 4% dans du D-PBS en diluant un stock acheté (tel que 25% de paraformaldehyde) et en ajustant le pH à 7,4 avec de l'acide acétique (pour éviter d'ajouter un excès de sodium à l'échantillon).
  2. Lorsque les cellules ont été cultivées comme souhaité, et les taches vitales (comme Hoescht) ont été appliquées et imagé, retirez le support par aspiration douce, l'inclinaison du plat à un angle de 45 ° avec une seule main, et aspirer à la pipette à la main avec l'autre .
    Remarque: au lieu des médias de pipetage passé, une alternative est de choisir la fenêtre jusqu'à, tremper la fenêtre dans des microtubes avec D-PBS deux fois, puis placez-le dans un nouveau récipient de culture avec des solutions de fixateur pendant 20 min suivie par deux fois de PBS lavage pour éliminer les fixateurs résiduelles. Si ce est choisi, allez dirtement à l'étape 3.5.
  3. Rincer le plat doucement avec D-PBS et remplacer immédiatement le liquide retiré en ajoutant doucement le frais 4% PFA / PBS tout en maintenant le plat à un angle de 45 °, pipetage vers le côté de la boîte, et relaxant lentement l'angle d'inclinaison pour permettre la solution de fixation pour couvrir les fenêtres. Maintenir les cellules recouvertes de le fixatif pendant 20 min à température ambiante.
  4. Retirez le liquide par aspiration douce, encore une fois comme ci-dessus, en inclinant légèrement la parabole et aspirer à la main.
  5. Remplacez le liquide retiré en ajoutant délicatement une partie des tuyaux / solution de saccharose, en utilisant la méthode de basculement et de pipetage décrit dans l'étape 3.3.
  6. Répétez les étapes 3.4 et 3.5.
  7. Préparer le matériel pour le séchage.
    1. Rassemblez serviettes non pelucheux tels que Kimwipes, et tirez une sortie de la boîte de sorte qu'il est à portée de main très rapidement et facilement.
    2. Préparer un, non niveau endroit propre pour définir la fenêtre de sécher. Situé sur un tapis de grille de caoutchouc du type utilisé en microscopie électronique, qui comporte des nervures de sortela fenêtre peut être calé sur une extrémité tout en séchant. Cela permet de garder la fenêtre de se coincer à la surface de séchage en séchant, et vidanger tout tampon restant à bord de l'échantillon.
  8. Tweeze délicatement la bande attaché à la fenêtre de tenir jusqu'à la fenêtre du liquide. Récupérer fenêtres qui se détachent de la bande en appliquant une petite quantité de tubes / saccharose de les amener à flotter, puis les ramasser avec les pincettes inverse.
  9. Soigneusement (sans toucher à la fenêtre elle-même) et bien barbouiller tout excès TUYAUX / saccharose à partir du bord de la fenêtre avec un Kimwipe. Barbouiller également la zone en retrait de retour en utilisant un pli arrondi d'un Kimwipe.
    NOTE: Le but est d'avoir aussi peu cristallisation des sels ou des tampons sur la surface de la fenêtre que possible.
  10. Placez la fenêtre sur le tapis de la grille. Assurez-vous que la fenêtre ne est pas à plat sur le tapis de grille, mais calé sur un bord (en utilisant les crêtes de la nappe de treillis) et toucher aussi peu de la grillemat que possible. Laissez la fenêtre sec.

4. Montage de l'échantillon et d'imagerie

  1. Une fois que l'échantillon a séché, vérifier la présence de cellules sur les fenêtres en utilisant un microscope optique. Effectuer cette vérification, avant de préparer les échantillons pour le transport vers un synchrotron.
  2. Emballez les fenêtres pour le transport à la ligne de lumière synchrotron hébergement de votre expérience. Apposer doucement les fenêtres avec du ruban adhésif sur les deux côtés sur une lame de verre, puis apposer la lame de verre avec du ruban adhésif au fond d'une boîte de Petri en plastique. Collez le plat arrêt Petri.
    NOTE: Avant ce point, ces étapes peut être effectuée dans ne importe quel laboratoire typique. Les étapes suivantes seraient mieux fait à une ligne de lumière synchrotron.
  3. Retirer le ruban de la fenêtre doucement avec des pincettes. Utilisez le vernis à ongles, dans une mince couche uniforme le long du bord de la fenêtre, pour sécuriser les fenêtres à un support en aluminium fourni par les collaborateurs de lignes de lumière au synchrotron.
  4. Insérez le support d'aluminium dansune cinématique de montage, puis placez-le en position dans le microscope à rayons X. Monter l'échantillon sur un support le raccordant à platines motorisées, à l'intérieur de la chambre de mesure à la ligne de lumière.
  5. Après avoir quitté la zone des rayons X de l'appareil de microscope de l'échantillon (une cage faite de parois de plomb-remplie), la configuration du balayage. Grâce à un logiciel spécifique ligne de lumière, choisir la zone appropriée de l'échantillon à analyser, tout en visualisant la position du faisceau de rayons X sur l'échantillon en utilisant une caméra équipée d'une vidéo croix et pré-alignés avec un appareil photo de scintillateur aval.
  6. Choisir la résolution appropriée pour l'échantillon, basé sur une estimation de la taille du plus petit élément caractéristique d'intérêt. Pour l'imagerie des cellules de mammifères simples (~ 20-40 um), utilisez une résolution de 0,25 à 0,5 um. Pour imager les zones de tissus, et de distinguer les couches de cellules de l'autre, utiliser une résolution de 2-20 um.
  7. Choisir le temps de séjour approprié pour l'échantillon, basé sur une estimation de la quantité de la respectéesal d'intérêt présent. Pour une analyse aperçu rapide, ou si de grandes quantités de métaux sont présentes, utiliser scans de voler avec des temps de séjour de 30 à 300 ms par pixel. Si peu de matériel est présent, ou pour mesurer les métaux de faible abondance relative, utiliser scans étape avec des temps de séjour de 1 à 2 secondes par pixel.
  8. Programmer les scans dans le logiciel spécifique ligne de lumière. Acquérir une image raster-scan. Travailler en collaboration avec les collaborateurs de lignes de lumière pour analyser les données avec un logiciel qui permettra d'identifier les pics d'énergie caractéristiques pour chaque élément.

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Résultats

La capacité de l'imagerie par fluorescence des rayons X pour fournir des informations sur les échantillons biologiques est subordonnée à ces échantillons préparés d'une manière telle qu'ils résistent à dégâts d'irradiation sur l'échelle de temps de l'expérience, et encore leurs caractéristiques chimiques et structurelles sont bien préservé. Dans l'affichage le résultat d'un échantillon qui a été préparé comme décrit ci-dessus et imagé, il est possible de voir qu'il existe des variatio...

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Discussion

X-ray imagerie de fluorescence est utile dans de nombreux domaines, y compris les sciences de la terre, la science des matériaux et la biologie chimique 26-34. Les progrès dans les rayons X synchrotron, et leur mise au point, ont produit de très faisceaux de haute intensité. Focused X-faisceaux de rayons suffisante pour exciter les métaux endogènes dans les cellules exister maintenant, de production de signal qui peut être mesurée avec la technologie actuelle silicium détecteur de dérive. Et l'étude de la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Stefan Vogt pour son aide dans l’ajustement des données représentatives présentées dans cet article, et pour les discussions utiles. Les auteurs remercient également Chris Jacobsen pour son soutien à Q. J.

L’utilisation de la source de photons avancée, lignes de faisceau 2-ID-E et 8-BM-B, au Laboratoire national d’Argonne, a été soutenue par le Département de l’énergie des États-Unis, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, dans le cadre du contrat n°. DE-AC02-06CH11357.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fenêtres en nitrure de siliciumSilson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW,Royaume-Uni SiRN-5.0-200-2.0-200. Trier par taille. Taille de la membrane : 1,5 mm x 1,5 mm. Épaisseur : 200 Nm. Taille du cadre : 5 mm x 5 mm. Épaisseur du cadre : 200 & micro ;m.Autre source : SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, Pennsylvanie.
Pince à épiler inverséeElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tél. : 215-412-8400, Sans frais : 800-523-5874, Fax : 215-412-845078520-5XEMS 5X, NC &ndash ; Pince à épiler ultra fine
Tapis de grille en caoutchoucElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tél. : 215-412-8400, Sans frais : 800-523-5874, Télécopieur : 215-412-845071170Tapis de grille ronde
Acide acétiqueSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tél. : 800-325-3010, Télécopieur : 800-325-5052338826métal trace grade acide acétique concentré
PIPEStamponSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tél. : 800-325-3010, Fax : 800-325-5052P6757Solid PIPES
buffer Formaldehyde stocksolution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tél. : 215-412-8400, Sans frais : 800-523-5874, Fax : 215-412-8450RT 1711310 ampoules de 10 ml de paraformaldéhyde aqueux à 20 %

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