Article de méthode

Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

DOI :

10.3791/52385

⸱

28 février 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les moustiques transmettant le paludisme présentent un certain nombre de caractéristiques épidémiologiquement importantes qui ne peuvent être détectées qu’à l’aide de techniques moléculaires. À l’aide d’une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF, nous avons mis au point un test permettant de détecter simultanément plusieurs traits clés (espèce, résistance aux insecticides, infection parasitaire et choix de l’hôte) des vecteurs du paludisme.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le complexe d'espèces Anopheles gambiae comprend le principal moustiques transmettent le paludisme en Afrique. Parce que ces espèces sont d'une telle importance médicale, plusieurs traits sont généralement caractérisés par des tests moléculaires pour aider dans les études épidémiologiques. Ces caractéristiques comprennent l'identification des espèces, la résistance aux insecticides, l'état de l'infection par le parasite, et de préférence d'hôte. Comme les populations du complexe Anopheles gambiae sont morphologiquement indiscernables, une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est traditionnellement utilisée pour identifier les espèces. Une fois l'espèce est connue, plusieurs essais sont régulièrement effectuées en aval pour élucider d'autres caractéristiques. Par exemple, des mutations connues sous le nom de KDR dans un gène par confèrent une résistance contre le DDT et les pyréthrinoïdes. En outre, les dosages d'enzyme-linked immunosorbent (ELISA) ou Plasmodium essais de PCR de détection de l'ADN du parasite sont utilisés pour détecter les parasites présents dans les tissus de moustiques. Enfin, une combination de la PCR et digestion de l'enzyme de restriction peut être utilisée pour élucider préférence de l'hôte (par exemple, humain contre le sang animal) par criblage de la farine de sang de moustique pour l'ADN spécifique à l'hôte. Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous les tests mentionnés ci-dessus dans un seul multiplex 33SNPs réaction de génotypage pour 96 ou 384 échantillons à la fois. Parce que le MDA comprend de multiples marqueurs pour les espèces, Plasmodium détection, l'identification et de l'hôte dans le sang, la probabilité de générer des faux positifs ou négatifs est fortement réduite à partir de dosages précédentes comprenant un seul marqueur par trait. Ce test robuste et simple peut détecter ces traits de moustiques clés rentable et en une fraction du temps de tests existants.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii et Anopheles gambiae sont les principaux vecteurs responsables de la transmission du paludisme en Afrique 1. Ces trois espèces sont morphologiquement indiscernables 2 et ne peuvent être distingués par des analyses moléculaires 9.3. En outre, il existe de nombreux tests en aval régulièrement menées pour faciliter les études de génétique épidémiologique et de la population. Il se agit notamment (1) un test de génotypage pour les îles de spéciation 10-12, (2) un test de génotypage reconnaissant SNP non synonymes dans le 1014 ème acide aminé en position de codon du gène par (la résistance knock-down, ou KDR, SNP) 13 -18, (3) la détection des parasites PCR 19-23, et (4) le dépistage de l'ADN spécifique de l'hôte dans estomacs de moustiques 24,25.

Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous ces essais dans une réaction multiplex unique avec l'objectif d'unealyzing caractéristiques épidémiologiques importantes de vecteurs du paludisme en Afrique. Le dosage MDA comprend plusieurs marqueurs de détection (1) espèce (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou autres (aucun des trois)), (2) la résistance aux insecticides représentés dans kdr SNP (deux L1014F et L1014S) , (3) la présence de deux grandes parasites du paludisme, Plasmodium falciparum et P. vivax, et (4) une source aviaire et six sang des hôtes mammifères.

Traditionnellement, ces essais ont été réalisés dans des réactions en chaîne par polymérase séparées. Lorsque tous ces essais sont effectués en utilisant une plate-forme PCR conventionnelle, il faut mener 8-10 dosages PCR de réaction et l'accompagnement des mesures d'électrophorèse en gel. Chaque réaction individuelle PCR de la préparation à la documentation des résultats prend 4-5 h, alors que la méthode MDA présenté ici prend environ 5 heures en totalité. Ceci est équivalent à un 90% d'économies sur les seuls coûts de main-d'œuvre. Le MDA présentée ici coûte 5 $par échantillon pour génotyper les 33 SNP. Ce est beaucoup moins cher que les tests à base de gel agarose simples, qui coûte environ 1,50 $ par échantillon. Dosages de détection toutes les caractéristiques couvertes par le MDA exigerait un minimum de 8 à 10 essais à base de gel agarose distincts à un coût de 12 à 15 $ par échantillon. En outre, le MDA diminue considérablement le risque de génération d'un faux positif ou négatif par l'utilisation d'au moins trois marqueurs pour chaque détection de parasite ou de la source hôte.

La plate-forme nous avons utilisé est pas limitée aux vecteurs du paludisme, mais peut être utilisé dans une grande variété d'applications telles que la médecine, de la médecine vétérinaire et de la biologie de base de 26 à 28. Des études approfondies d'association ou la génétique des populations études impliquant un grand nombre (dans l'ordre de 100s) des échantillons nécessitent des essais rentables dépistage de marqueurs multiples simultanément. La plupart des études qui utilisent deux ou plusieurs tests de PCR séparées puissent appliquer la MDA pour des résultats plus rapides à un coût moindre.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Amplification par PCR

  1. Mélanger tous les amorces de PCR (Voir Tableau supplémentaire S1) dans un microtube de 1,5 ml. Chaque SNP a deux amorces (avant et arrière). Assurez-vous que la concentration de l'action de chaque amorce PCR est maintenue à 100 um. Faire assez mélange d'amorces pour les réactions 500-1000 pour réduire pipetage erreur et le temps sur le banc (Voir Tableau supplémentaire S2). Si vous le souhaitez, pour préparer des aliquotes de 100 à 200 réactions par tube et conserver à -20 ° C.
  2. Préparer cocktail de PCR tel que décrit dans le protocole du fabricant (tableau 1). Le volume de réaction 96 comprend un surplomb de 20%. Vortex le tube contenant le cocktail PCR légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g.
  3. Distribuer 3 ul du cocktail PCR dans chaque puits d'une non-jupe plaque de 96 puits. Une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus.
  4. Ajouter 2 ul de l'ADN génomique appropriée de moustiques dans chaque puits.
    Note: Le processus d'obtention de l'ADN génomique de m tissus osquito (tête / thorax, l'abdomen ou corps entier) est décrite dans les autres littératures 29-32. Choisir un protocole d'extraction d'ADN appropriée pour différencier ceux avec Plasmodium dans le sang (abdomen) à partir de moustiques infectieux (Plasmodium dans la tête / thorax). Nous utilisons généralement l'ADN extrait des parties du corps (tête / thorax ou de l'abdomen) de moustiques, donc la concentration de l'ADN varie de 0.05-2ng / ul. Bien que l'entrée de l'ADN total est inférieur à la recommandation du constructeur (5-10ng / rxn), nous obtenons généralement robuste SNP appelle à partir de 98% des échantillons d'ADN sans amplification du génome entier.
  5. Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g.
  6. Utiliser le protocole de cyclage thermique suivant pour effectuer l'amplification par PCR: (1) 94 ° C pendant 2 min, (2) 94 ° C pendant 30 secondes, (3) 56 ° C pendant 30 secondes, (4) 72 ° C pendant 1 min (5) répéter l'étape (2) - (4) pendant 45 cycles, (6) 72 ° C pendant 1 min et 4 ° C en attente.
_title "> 2. Traitement SAP

  1. Préparer la solution d'enzyme SAP dans une plaque à 96 puits (voir le tableau 2). Traiter 96 échantillons en une plaque. Le volume de réaction 96 comprend un surplomb de 20%.
  2. Vortex le tube de solution enzymatique SAP légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g. Distribuer 2 pi de la solution d'enzyme SAP dans chaque puits. Encore une fois, une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus.
  3. Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g. Incuber la plaque comme suit: (1) 37 ° C pendant 40 min, (2) 85 ° C pendant 5 minutes pour inactiver l'enzyme, (3) 4 ° C en attente. A l'achèvement de cette étape, la plaque stocker à -20 ° C avant de poursuivre. Traitement de la plaque stockée dans les 2 semaines.

3. SNP Extension

  1. Si la plaque d'échantillon est gelé après le traitement SAP, lui permettre de dégeler à la température ambiante avant de procéder.
  2. Préparer le mélange extension d'amorce (tableau supplémentaire S2). Chaque SNP a une exteamorce nsion. Maintenir la concentration de l'action de chaque amorce d'extension à 500 um. Eventuellement, aliquote de 100 à 200 réactions par tube et conserver à -20 ° C.
  3. Préparer prolongement mélange comme décrit dans le tableau 3. Le volume 96 de réaction comprend un surplomb de 20%.
  4. Vortex le tube de l'extension cocktail légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g. Distribuer 2 pl du cocktail d'extension dans chaque puits. Encore une fois, une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus.
  5. Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g. Thermocycle la plaque, comme le montre la figure 1. À ce stade, procéder à la spectrométrie de masse ou de stocker la plaque à -20 ° C jusqu'à deux semaines.

4. Conditionnement du produit Extension SNP pour optimiser l'analyse de spectrométrie de masse

  1. Si la plaque d'échantillon est gelé après l'extension SNP, lui permettre de dégeler à la température ambiante avant de procéder.
  2. Transférer 15 mg de résine à partir de son contaINER sur la plaque en utilisant une cuillère fossette allongée. Utilisez le grattoir pour répandre la résine dans les puits de la plaque fossette. Balayer le racleur de gauche à droite à travers la plaque fossette de répandre la résine. Assurez-vous qu'il est de la résine dans chaque puits.
  3. Grattez l'excédent de résine de la plaque fossette d'utiliser le racloir. Laisser reposer la résine dans la coupelle de fossette pendant au moins 20 min. Tout en laissant reposer la résine dans la coupelle de fossette, ajouter 41 ul d'eau de qualité HPLC à chaque puits de la plaque d'échantillons.
  4. Placez délicatement la plaque d'échantillon à l'envers, sur la plaque fossette. Assurez-vous que les réinitialisations de plaques échantillons contre le petit poste arrondie de la plaque fossette, qui aligne les puits dans la plaque de l'échantillon avec les puits de la plaque fossette.
  5. Tenir la plaque de l'échantillon et la plaque fossette ensemble, retournez-les délicatement sur tant la résine se situe hors de la plaque fossette dans les puits de la plaque de l'échantillon. Appuyez sur la plaque fossette donc la résine tombe dans la plaque de l'échantillon. Assurez-vous que toute la résine dans le diplaque de mple tombe dans les puits de la plaque d'échantillon. Centrifuger la plaque à 3200 g pendant 30 sec.
  6. Faire tourner la plaque d'échantillons sur un agitateur pendant 5 min à température ambiante. Rotateur doit tourner la plaque d'échantillons 360 ° autour de l'axe de temps.
  7. Centrifuger la plaque d'échantillon à 3200 g pendant 5 min. Après cette étape, mémoriser la plaque d'échantillons à -20 ° C jusqu'à 2 semaines avant de procéder à l'étape suivante.

5. MALDI-TOF spectrométrie de masse

  1. Transférer le produit d'extension SNP conditionné sur un BioArray comme SpectroCHIP selon les instructions du fabricant. Nous utilisons MassARRAY Nanodispenser pour cette étape.
  2. Une fois le transfert terminé, définir comment essais et plaques doivent être mis en place dans la base de données de test. Nommez le dosage et les plaques de telle sorte que chaque plaque a identificateur unique qui relie à la conception de test spécifique (tableau supplémentaire S3).
  3. Après analyse et la plaque ont été définis, d'acquérir des spectres en utilisant un spectromètre de masse.

6. Analyse des données

  1. Effectuer l'analyse des données en utilisant une analyse PCR logiciels d'interprétation de données en temps réel telles que typer Analyzer ou TyperViewer (Sequenom). Obtenir des données dans le format .xml qui contient la disposition de l'échantillon, spectrogramme de masse pour chaque puits, les informations de marqueur y compris le nom, la masse attendue pour chaque variante du SNP correspondant, et toute erreur ou des messages d'avertissement associés à chaque réaction. Voir Figure 2 pour le spectrogramme de masse résultante.
  2. Procéder à une analyse de clustering SNP génotype en fixant le seuil de détection (de magnitude ou rapport signal sur bruit) et la tolérance / variance autorisé pour chaque génotype. La figure 3 montre un exemple de 04707-KDR # 2 SNP grappes génotypiques.
  3. Exporter les appels résultant SNP génotype dans un tableur.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'identification des espèces:

Les cinq SNP suivants ensemble identifient trois espèces (A. arabiensis, A. et A. gambiae coluzzii) (tableau 4). Si un échantillon ne est pas l'une des trois espèces, les trois SNP (01073-213, 04679-157 et 10313 -052) ne parviennent pas à amplifier.

kdr génotype pour déduire la résistance aux insecticides:

Le 1014 ème codon du canal ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le MDA est composé de cinq étapes principales: amplification PCR, phosphatase alcaline de crevette (SAP) réaction, vulgarisation SNP, produit d'extension conditionnement et laser assistée par matrice de désorption / ionisation - temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse 33-37. La première étape d'amplification PCR amplifie l'ADN flanquant chaque SNP sorte que l'ADN matrice assez sera disponible à l'étape d'extension SNP. La réaction de SAP neutralise dNTP non utilisées qui peuven...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions les Drs. Anthony Cornel et Laura Norris à l'UC Davis et le Dr Katharina Kreppel à l'Université de Glasgow pour fournir des spécimens de moustiques de la Tanzanie. Nous remercions Mme Smita Das et le Dr Douglas Norris de la Johns Hopkins School of Public Health de partager des échantillons de moustiques de la Zambie. Nous remercions également M. Lee V. Millon au Laboratoire de génétique vétérinaire de formation sur la conception de l'essai. Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé et accorder R01AI 078183 R21AI062929.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Spectrométriemasse MALDI-TOF pour les applications génomiques afin d’analyser les acides nucléiques.
MassARRAY NanodispenserSequenomRS1000Transfère les produits de réaction iPLEX terminés vers le SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping ReagentSet Sequenom10158Réactifs utilisés pour le test iPLEX, y compris le kit SAP.
de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215(2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163(2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112(2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285(2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Anopheles gambiaetransmission du paludismeessai PCR multiplexeg notypage des SNPidentification des esp cesr sistance aux insecticidesd tection des parasitesanalyse des pr f rences de l h tecriblage des repas sanguinsdigestion par enzyme de restriction

Articles connexes