Article de méthode

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l'analyse des lymphocytes infiltrant

DOI :

10.3791/52392

⸱

6 décembre 2014

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1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la dissociation rapide non enzymatique de fragments de tissus humains frais pour l’évaluation qualitative et quantitative des cellules CD45+ (lymphocytes/leucocytes) présentes dans divers tissus humains normaux et malins. De plus, le surnageant obtenu à partir de l’homogénat de tissu primaire peut être collecté et stocké pour une analyse ou une expérimentation plus approfondie.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacité des cellules malignes à échapper au système immunitaire, caractérisé par l'échappement tumoral à partir des réponses immunitaires innées et adaptatives, est maintenant accepté comme une caractéristique importante de cancer. Notre recherche sur le cancer du sein se concentre sur le rôle actif que les lymphocytes infiltrant les tumeurs jouent dans la progression tumorale et les résultats des patients. Dans ce but, nous avons développé une méthodologie pour l'isolement rapide des cellules lymphoïdes intacts de tissus normaux et anormaux dans un effort pour les évaluer à proximité de leur état natif. Homogénats préparés en utilisant un spectacle de dissociateur mécanique à la fois la viabilité accrue et la cellule de récupération tout en préservant l'expression du récepteur de surface par rapport aux tissus digéré par une enzyme. En outre, la digestion enzymatique de la matière insoluble restante n'a pas récupéré CD45 + cellules supplémentaires indiquant que les mesures quantitatives et qualitatives dans l'homogénat primaire susceptibles reflètent véritablement sous-populations infiltrant dans le fragm de tissusent. Les cellules lymphoïdes dans les homogénats peuvent être facilement caractérisées en utilisant immunologique (phénotype, la prolifération, etc.) ou moléculaire (ADN, ARN et / ou protéine) approches. les cellules CD45 + peuvent également être utilisés pour la purification de la sous-population, l'expansion in vitro ou cryoconservation. Un autre avantage de cette approche est que le surnageant de tissu primaire à partir des homogénats peut être utilisée pour caractériser et de comparer des cytokines, des chimiokines, des immunoglobulines et des antigènes présents dans les tissus normaux et malins. Cette fonction de protocole extrêmement bien pour les tissus mammaires humains et doivent être applicables à une grande variété de tissus normaux et anormaux.

Introduction

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Le microenvironnement tumoral est composé de différents types de cellules, de nombreuses études montrant qu’elles jouent chacune un rôle distinct et important dans la tumorigenèse1,2. Il s’agit, sans s’y limiter, des cellules immunitaires infiltrantes, des cellules stromales, des cellules endothéliales et des cellules tumorales3. Des études ex vivo de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL ; CD45+ ou leucocytes, qui sont principalement des lymphocytes dans les tumeurs du sein) provenant d’échantillons de tissus humains frais est rendue difficile par leur faible fréquence, la petite taille des échantillons souvent disponibles pour la recherche et le risque de perte de viabilité lors de l’extraction. Parce que les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs sont généralement présentes en tant que passagers plutôt que résidents permanents, elles sont généralement plus faciles à libérer de la matrice tissulaire.

La dissociation du tissu tumoral tout en maintenant l’intégrité cellulaire est techniquement difficile et a traditionnellement été réalisée en utilisant une combinaison d’étapes mécaniques et enzymatiques pour préparer des suspensions de cellules uniques4-8. Cette approche implique de longues périodes d’incubation et est associée à une réduction significative de la viabilité cellulaire ainsi qu’à la perte de récepteurs de surface cellulaire par clivage enzymatique. Il est plus difficile de réaliser des études de cytométrie en flux de haute qualité caractérisant la TIL dans le microenvironnement tumoral ainsi que des purifications propres des sous-populations CD45+ par cytométrie en flux ou des billes enrobées d’anticorps à partir de tissus tumoraux digérés par des enzymes. De plus, le surnageant (SN) de l’homogénat tumoral résultant ne se prête pas à une analyse plus approfondie, y compris la quantification des protéines sécrétées (cytokines, chimiokines, immunoglobulines ou antigènes tumoraux) ou le traitement expérimental de cellules normales, en raison du potentiel de dégradation des protéines dans les digestions enzymatiques.

Dans notre recherche d’une méthode pour préparer des homogénats unicellulaires à partir de tissus mammaires [y compris les tissus tumoraux, non tumoraux non adjacents (NANT) et normaux (issus de réductions mammaires)) sans digestion enzymatique, nous avons testé une variété de techniques d’homogénéisation mécanique. Les homogénats préparés à l’aide d’un dissociateur mécanique ont augmenté la viabilité cellulaire (2 fois) et la récupération cellulaire totale (2 fois) tout en préservant l’expression des récepteurs de surface. La digestion enzymatique du matériel insoluble restant n’a pas permis de récupérer d’autres cellules CD45+, ce qui suggère qu’elles ont toutes été libérées dans l’homogénat initial. Ainsi, cette approche simple et rapide permet une évaluation à la fois qualitative et quantitative des sous-populations de CD45+ présentes dans divers tissus humains normaux et malins. Un avantage supplémentaire de cette approche est que le SN de l’homogénat initial (SN de tissu primaire) peut être collecté et stocké pour une analyse ou une expérimentation ultérieure.

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Protocole

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REMARQUE: Tous les spécimens ont été acquis au moyen d'un protocole approuvé par le comité d'éthique médicale de l'Institut Jules Bordet avec le consentement éclairé écrit obtenu de chaque patient.

1. Préparation de l'homogénat de tissu

  1. Disséquer les tissus (résection de tissus malins et normal résection de la salle d'opération) sont dans le laboratoire de pathologie par du personnel qualifié pour la collecte immédiate. Tumeur, NANT (prise la plus grande distance de la tumeur que possible) et des fragments de tissus normaux sont régulièrement traitées dans 1-3 h de l'excision chirurgicale dans un laboratoire de BSL2 en utilisant des procédures de biosécurité standard pour les tissus humains. Un diagramme de flux du protocole est illustré sur la figure 1.
  2. Peser tous les fragments de tissus (normales, NANT et tumorales) et mesurer la longueur, la largeur et la hauteur (longueur x largeur x hauteur). Ce est une étape importante pour la normalisation ultérieure de sous-populations de cellules, l'ARN extrait, etc.
    NOTE: La gamme de taille de l'échantillon est de 100 à 10 000 mm 3 sans gras si possible.
  3. Imprimer le fragment de la tumeur sur une lamelle de verre de coloration H & E afin de vérifier que le tissu est en fait une partie de la tumeur.
    1. Pour ce faire, en appuyant sur une lame de microscope en verre sur le fragment de la tumeur et appliquant une légère pression avec les doigts pendant quelques secondes.
    2. Fixer la lame avec de l'isopropanol pendant 2 min, suivie d'une étape de lavage dans l'eau. Counterstain le tissu pendant 30 secondes avec l'hématoxyline de Mayer.
    3. Laver la lame dans six bains d'eau. Colorer dans la phloxine B 2% pendant 15 sec.
    4. Laver à un bain d'eau suivie de quatre salles de bains de l'isopropanol et la finition avec une salle de bain de l'eau.
    5. Incuber dans l'isopropanol pendant 1 min et le drain. Effacer dans deux bains de xylène.
    6. Montez avec un milieu de montage à base de xylène. Examinez pour cellularité tumorale (Figure 2).
      REMARQUE: Principalement, les cellules tumorales collent à la diapositive impressionStylos - les cellules stromales, lymphoïde ou adipose cellules restent rarement, laissant des espaces entre les cellules tumorales (Figure 2).
  4. Placez le fragment de tissu dans une petite boîte de culture contenant 1 ml de, milieu de cellules hématopoïétiques sans sérum chimiquement défini (ci-après dénommé milieu) à la température ambiante et couper en petits morceaux (~ 1 à 2 mm 2) en utilisant une solution stérile scalpel.
  5. Transférez tout (fragments de tissus + moyenne) à un tube mécanique dissociateur C.
  6. Rincer la boîte de Pétri et scalpel avec 2 ml de milieu à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter ceci à tube C (volume du milieu de dissociation = 3 ml).
  7. Utilisez le A.01 de programme de dissociateur mécanique pour tubes C (le programme le plus doux) pour homogénéiser les fragments de tissus dans une suspension cellulaire unique. Placer le tube de C dans l'appareil et exécuter le programme deux fois de suite (un cycle = 25 sec).
    NOTE: Cette procédure d'homogénéisation a été établi et validé pour le tissu mammaire humain, autre tumou tissus ou types peuvent avoir besoin d'utiliser un autre programme et devraient être testés en premier.
  8. Retirer le tube de l'appareil C et l'homogénat décanter directement dans un tamis cellulaire de 40 pm assis sur un tube de 50 ml. En utilisant la même pipette Pasteur comme à l'étape 1.6, transférer le liquide restant dans le tube de C au tamis cellulaire.
  9. Transférer le liquide filtré dans un tube de 15 ml en utilisant une pointe de micropipette 1 ml. Temporairement maintenir le tamis cellulaire et son tube de 50 ml.
  10. Rincer le tube de C avec un 3 ml supplémentaires de milieu et transférer ce, encore une fois en utilisant la même pipette Pasteur comme à l'étape 1.6, à l'tamis cellulaire encore assis sur le tube de 50 ml. Pressez un montant maximum de liquide résiduel piégé dans le tissu non homogénéisé dans le tube de 50 ml en déplaçant doucement autour de la crépine avec une pipette Pasteur propre ou une pointe ml qui est ensuite jeté pour éviter de contaminer l'éluat.
  11. Placez le filtre cellulaire à l'envers sur til tube d'origine C et rinçage avec 3 ml de milieu de sorte que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C.
  12. Re-homogénéiser comme à l'étape 1.7 pour deux cycles du programme A.01.
  13. Pour cette deuxième homogénat à travers le tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml, rincer le tube de C de nouveau avec 3 ml de milieu (comme à l'étape 1.10) et transférer à la pipette Pasteur au tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml à nouveau serrant au maximum quantité de liquide à partir du tissu conjonctif résiduel piégé dans le filtre à cellule.
  14. À ce stade, un volume de ~ 2,5 ml est dans le tube de 15 ml et ~ 9 ml dans le tube de 50 ml.

2. Séparation du surnageant de cellules et de tissus

  1. Centrifuger les homogénats à 15 ml et les tubes de 50 ml pendant 15 min à 600 x g à température ambiante.
  2. Décanter le SN du tube de 15 ml dans un tube propre et stocker temporairement à 4 ° C. Ce surnageant = tumeur primaire, NANT ou ti normalessu SN (de volume final de 2,5 ml) est ensuite clarifié et aliquotée avant le stockage à -80 ° C pour les analyses futures (voir ci-dessous).
  3. Jeter le surnageant à partir du tube de 50 ml.
  4. Resuspendre doucement les deux culots de cellules dans un volume final de 1 ml de milieu. En bref, la première briser doucement le culot cellulaire dans les deux tubes (en appuyant sur le tube sur une surface dure). Remettre en suspension le culot cellulaire en vrac dans les 50 ml avec 500 ul de milieu et transférer cette suspension de cellules dans le tube de 15 ml pour remettre en suspension le culot secondes. Répétez cette étape une fois avec les secondes 500 pi de milieu pour une récupération maximale des cellules.
  5. Transfert 10 ul de la suspension cellulaire dans un petit tube, mélanger avec 10 pi de bleu trypan (dilution 1: 1) et compter le nombre de cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre.
    REMARQUE: À ce stade une fraction de la suspension de cellules peut également être analysée par cytométrie de flux pour évaluer la taille de la cellule, la granularité et si on le désire un nombre limité de marqueurs de sous-populations de plus precise évaluation de la distribution des cellules par rapport à l'homogénat avant l'analyse ou expérimentation extensive. Toutes les analyses par cytométrie flux intègrent étiquetage CD45 pour la normalisation des sous-populations.
  6. Pellet les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Les cellules de la tumeur, NANT, ou un tissu normal sont maintenant prêts pour une autre purification ou d'analyse. Ces étapes supplémentaires sont les mieux lorsqu'elles sont effectuées le même jour que la chirurgie.
    NOTE: Pour l'analyse par cytométrie de flux mais pas le tri cellulaire des globules rouges résiduels doivent être lysées après marquage de l'anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse de globules rouges au culot cellulaire, vortex immédiatement pendant 1 seconde et l'incubation d'un minimum de 10 min à manger température (abri de la lumière) avant l'analyse.

3. Clarification du surnageant tissulaire

  1. Centrifuger les tubes de 1,5 ml avec SN tissulaire à 15 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
  2. Retirez délicatement til surnageant sans toucher ni déranger le culot. Transférer dans un tube propre (ou tubes) selon le nombre et le volume des aliquotes souhaités.
  3. Stocker le surnageant à -80 ° C pour une utilisation future.

4. sang du patient

  1. Prélever un échantillon de sang de chaque patient, en tant que témoin par ponction veineuse dans des tubes héparinisés le jour avant la chirurgie. Centrifuger le sang à 400 g pendant 10 min à 20 ° C avec le frein, pour obtenir le plasma et une couenne.
  2. Retirez le plasma et la clarifier par centrifugation à 10 000 g pendant 15 min à 20 ºC. Aliquoter et magasin plasma à -80 ° C pour une utilisation future. Diluer la couche leuco-plaquettaire en milieu
  3. Séparer les cellules mononucléaires en utilisant la centrifugation en gradient de Ficoll-Hypaque norme avant l'analyse immédiate, l'isolement des sous-populations, / ARN / extraction de protéines ou d'ADN cryoconservation.

5. cytométrie en flux

  1. cellules d'étiquetage selon la fabricationles instructions r à 4 ° C à l'abri de la lumière. Lyser les globules rouges dans les suspensions cellulaires à partir de fragments de tissus après le marquage de l'anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse cellulaire au culot cellulaire.
  2. Vortexer immédiatement une seconde et incuber un minimum de 10 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Passez les cellules marquées dans un cytomètre de flux pour l'acquisition de données sans lavage.

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Résultats

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La digestion enzymatique de fragments de tissus disponibles dans le commerce avec des solutions de dissociation des tissus ou divers mélanges de laboratoire de la collagénase, la DNase et / ou des inhibiteurs de la hyaluronidase, cliver une large gamme de récepteurs à la surface des cellules. Nos études, d'abord axées sur les cellules T CD4 + infiltrant les tumeurs du sein, ont été rapidement présentés à un problème technique majeur dû au clivage des récepteurs CD4 de surface en utilisant des protocoles de di...

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Discussion

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Cette étude décrit un procédé optimisé pour la préparation rapide d'homogénats de tissus du sein normaux et malins sans digestion enzymatique pour le tri ultérieur de la cellule, l'extraction, la cryoconservation et / ou l'analyse phénotypique de CD45 + sous-populations. L'objectif de cette approche expérimentale est de produire des images de la TIL qui reflètent étroitement leur état ​​in vivo et de les comparer aux tissus normaux avec une manipulation minimale des tissus frais de la...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’il n’existe aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions fromthe Fonds belge pour la recherche scientifique (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Plan Cancer de la Belgique, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson et le Fonds Barsy.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GentleMacs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine est quelque peu équivalent
Centrifugeuse 5810 REppendorfou autre centrifugeuse de table standard
Centrifugeuse 5417 REppendorfou autre microcentrifugeuse standard
Esco Classe II A2 Biosafety CabinetESCO globalou autre standard BSL2 hotte
Microscope inverséNikon eclipse TS100ou autre microscope compatible pour un hémacytomètre
Bü ; Chambre de chambreMarienfield  ;640210ou autre hémacytomètre standard
Navios Cytomètre en fluxBeckman Coulterou autre cytomètre en flux (8-10 couleur recommandée)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine utilise Filcon
Cell Culture DishSarstedt72,710ou d’autres objets en plastique apyrogènes
Scalpel jetableSwann-Morton0510ou scalpel stérile standard à usage unique
BD Cell Strainer 40 & micro ; mBecton Dickinson734-0002ou autre objet en plastique apyrogène
BD Falcon Tube 50 mlBecton Dickinson352070ou autre objet en plastique apyrogène
BD Falcon Tube 15 mlBecton Dickinson352097ou autre objet en plastique apyrogène
BD FACS Tube 5 mlBecton Dickinson352008ou autre objet en plastique apyrogène
Pasteur stérile Pipette 5 mlVWR612-1685ou autre plastique apyrogène
Tube à microfuge 1,5 mlEppendorf7805-00ou autre plastique apyrogène
X-Vivo 20LonzaBE04-448Qsans sérum moyen recommandé
Solution saline tamponnée au phosphateLonzaBE17-516Fphysiologique standard PBS
Bleu trypanVWR17942Eou autre tache vitale
VersaLyseBeckman CoulterA09777pour les expériences de cytométrie en flux
Viabilité fixable Dye eFluor 780eBioscience65-0865-14pour les expériences de cytométrie
en flux anti-CD3 FITCBD Biosciences345763pour les expériences de cytométrie en flux
anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363pour les expériences
de cytométrie en fluxanti-CD4 PEBD Biosciences345769pour les expériences de cytométrie en flux
anti-CD4 APCMiltenyi Biotec130-091-232pour les expériences de cytométrie en flux
anti-CD8 ECDBeckman Coulter737659pour les expériences de cytométrie
en flux anti-CD8 PerCPBD Biosciences345774pour les expériences de cytométrie en flux
anti-CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643pour les expériences de cytométrie
en flux anti-CD45 VioGreen MiltenyiBiotec130-096-906pour les expériences de cytométrie en flux

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Tissue HomogenizationMechanical DissociationLymphocyte IsolationFlow CytometryCell ViabilityCD45 Positive CellsTissue SupernatantCytokine AnalysisBreast TissueCell Recovery

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