Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T

Summary

Nous décrivons un protocole pour surveiller la mobilité radiale des cellules immunitaires non adhérentes in vitro à l’aide d’un appareil de sédimentation cellulaire. La migration cellulaire est suivie sur des monocouches de cellules tumorales ou sur des protéines de la matrice extracellulaire. L’examen par microscopie optique et à fluorescence permet d’observer la mobilité cellulaire et la fonctionnalité cytotoxique.

Abstract

Nous rapportons une nouvelle adaptation du dosage Cell Migration radiale monocouche, d'abord rapporté pour mesurer la migration radiale des cellules tumorales adhérentes sur les protéines de la matrice extracellulaire, pour la mesure de la motilité de cellules immunitaires marquées par fluorescence, les droits non adhérente ou effectrices murin. Cette technique utilise un collecteur en acier inoxydable et lame de Téflon 10 puits à déposer focalement cellules T non adhérentes dans des puits préparés soit avec des monocouches de cellules tumorales confluentes ou des protéines de la matrice extracellulaire. La microscopie par fluorescence de lumière et / ou multi-canal est utilisé pour suivre le mouvement et le comportement des cellules effectrices dans le temps. Les colorants fluorescents et / ou des vecteurs viraux qui codent pour des transgènes fluorescents sont utilisés pour marquer de manière différentielle les types de cellules pour l'imagerie. Cette méthode est distincte de type semblable dans des essais in vitro qui suivent horizontale ou verticale migration / invasion utilisant des chambres de diapositives, l'agar ou transwell plaques. Le test permet aux données d'imagerie détaillées à Be recueillies avec différents types de cellules qui se distinguent par des marqueurs fluorescents spécifiques; même sous-populations spécifiques de cellules (ce est à dire, une transduction / nontransduced) peuvent être surveillés. Surface parcelles de fluorescence d'intensité sont générées en utilisant des canaux de fluorescence spécifiques qui correspondent au type de cellule en cours de migration. Cela permet une meilleure visualisation de la mobilité immunitaire non-adhérent cellulaire à des moments précis. Il est possible de recueillir des preuves d'autres fonctions des cellules effectrices, telles que la cytotoxicité ou le transfert des vecteurs viraux de l'effecteur aux cellules cibles, aussi bien. Ainsi, le procédé permet aux chercheurs de documenter les interactions de microscope marqués de façon différentielle, non adhérente de cellule à cellule avec les cellules adhérentes de différents types. Ces informations peuvent être particulièrement pertinent dans l'évaluation de types de cellules immunitaires biologiquement actif ou manipulées, où une preuve visuelle de la fonctionnalité est recherchée avec les cellules cibles de tumeur avant leur utilisation pour le traitement du cancer.

Introduction

Le dosage migration cellulaire Radial monocouche a été initialement développé pour mesurer les propriétés d'infiltration de cellules tumorales adhérentes ^1-4 sur des lames revêtues de la matrice extracellulaire (ECM) protéines ^5-7 ou avec des composants ECM individuelles, telles que la fibronectine ou la laminine ^1,2. La technique implique l'ensemencement d'une suspension cellulaire unique de cellules tumorales dans le centre du puits en utilisant un collecteur de cellules sédimentation en acier inoxydable (CSM). Après sédimentation, les cellules tumorales se conformer au fond du puits et de la variation dans le diamètre de la population initiale de cellules au cours du temps a été utilisée pour établir un taux de mobilité horizontale. Le dosage migration cellulaire Radial monocouche fourni un avantage visuel sur les autres méthodes existantes qui emploient transwell plaques pour doser les capacités migratoires in vitro de cellules; ces tests sont non-propice à l'imagerie ^8. En outre, il a également fourni une grande liberté dans le choix du timepoints lorsque la migration est évalué, sans aucune limite sur le nombre de points dans le temps un chercheur pourrait choisir d'image après la sédimentation.

Étant donné que la capacité de migrer est une fonctionnalité importante pour les cellules non adhérentes, en particulier dans le domaine de l'immunothérapie ou où ils peuvent être utilisés comme véhicules de délivrance de vecteurs viraux, nous avons adapté l'utilisation du CSM afin d'évaluer la migration des cellules non-adhérentes types sur des monocouches de cellules tumorales, en plus des protéines de la MEC. L'avantage supplémentaire de la visualisation au microscope la migration de cellules non-adhérentes sur des monocouches de cellules viables de la tumeur, sur ECM complexe isolé de la tumeur, ou sur des composants individuels de l'ECM rend ce test polyvalent. Les dosages qui utilisent des puits revêtus avec une seule protéine extracellulaire ne reflètent pas de façon précise le substrat de tissu ou de tumeur ECM les cellules migrer à travers seraient in vivo.

Ici, nous avons utilisé alloréactives lymphocytes T cytotoxiques (alloCTL), sensibilisés aux histocomp majeureatibility complexe (MHC) des protéines en utilisant des réactions de cellules tumorales de lymphocytes mixtes à une voie (MLTR) ou des réactions lymphocytaires mixtes (RLM) ^9, comme notre type cellulaire non adhérente représentant. Nous avons testé les cellules d'origine tant humaine et murine. Lorsque la migration a été mesurée sur des monocouches tumorales, les cellules tumorales employées étaient des cibles partiellement pertinentes, l'affichage de certaines des mêmes protéines CMH trouvés sur la population de cellules utilisé pour sensibiliser les effecteurs, ou des cibles totalement pertinentes, avec un ensemble complet de molécules du CMH que le effecteurs avaient été sensibilisés envers. Dans certaines expériences, nous avons utilisé CellTracker fluorescent ou un colorant rouge CMPTX de prolifération cellulaire eFluor 670 pour différencier entre les cellules effectrices et cibles. Nous avons également utilisé transduction avec des vecteurs viraux codant pour des protéines fluorescentes comme un moyen supplémentaire pour visualiser les cellules. Pour certains essais, nous transduites l'alloCTL avec des vecteurs de réplication rétroviraux (VRR) de codant pour Emerald Green (EMD) de la protéine fluorescente ^10,11; pour OTHteurs, les cellules tumorales ont été transduites avec les vecteurs lentiviraux codant pour mStrawberry.

Le alloCTL ont été ensemencées à travers un canal du collecteur dans le centre de soit des monocouches de cellules tumorales ou ECM récoltées à partir de monocouches de cellules tumorales. Les interactions des cellules adhérentes et non adhérentes ont été visualisées par lumière et / ou par microscopie de fluorescence au cours du temps. Perturbation dans la monocouche de cellules tumorales à faible puissance, ou les cellules tumorales avec des noyaux fragmentés à forte puissance étaient indicateurs de dommage cellulaire par lyse et l'apoptose, respectivement. Nous numériquement créé cartes fluorescentes d'intensité de surface montrant la migration des cellules T fluorescent non-adhérentes sur les cultures en monocouche. Nous avons également noté la cytotoxicité engendré à la monocouche cellulaire de gliome adhérente après la formation du groupe de l'alloCTL non adhérente superposée. En outre, la transduction horizontal de RRV-EMD de la alloCTL à la monocouche de gliome a été observée.

Protocol

1. Préparation de la lame

1. Insérer des diapositives de Manifold cellule de sédimentation dans des sachets de stérilisation et sceller avec du ruban autoclave. La face avec revêtement téflon de la lame du côté papier de la poche pour éviter les dépôts de plastique sur les puits.
2. Sachets autoclave pendant 15 min à 121 ° C.
3. Sortir les lames du sachet de stérilisation à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique et placer dans un 150 x 15 mm boîte de Petri stériles. Jusqu'à quatre diapositives peut se adapter par plat. Placez un plat de 35 x 10 mm Petri à côté des diapositives. Ajouter 2-3 ml de H ₂ O stérile pour procurer une humidification.
4. Diapositives pré-enduire les poly-D-lysine à 100 pg / ml en utilisant un volume suffisant pour bien couvrir l'ensemble. Après une heure à température ambiante, aspirer la solution et rincer la surface du puits deux fois par du PBS 1x pipetage sur la surface des puits.
5. Eventuellement, ajoutez la fibronectine ou d'autres composants de l'ECM pour assurer plus forte adhésion des cellules tumorales. Ajouter à la fibronectine 5 ug / ml dans tha assez de volumet les puits ne sèche pas dans un court laps de temps à la température ambiante.
   1. Après 1 h, aspirer la solution restes et laver deux fois par pipetage de haut en bas avec 1x PBS.
6. Gardez PBS sur les puits jusqu'à ce que la tumeur est prêt pour le placage. Utilisation glisse le même jour.
7. Récolter un flacon confluent du type de cellules tumorales adhérentes souhaitée. Compter les cellules viables à l'aide de bleu Trypan exclusion de colorant par microscopie optique et remettre en suspension à 5 x 10 ⁶ cellules / ml en croissance par exemple de taille de manière adéquate tamponnée, milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), L- glutamine et pyruvate de sodium.
8. Si l'imagerie de fluorescence de la population de cellules adhérentes est souhaitée, l'étiquette de la population de cellules adhérentes avec un colorant fluorescent ou un colorant vital de prolifération de cellules en suivant les protocoles fournis par le fabricant.
9. Pipette en douceur 10 pi de milieu complet dans chaque puits de la prise en charge de diapositives prendre pour éviter la formation de bulles dans le wells, car ils peuvent empêcher l'adhérence uniforme des cellules tumorales.
10. Ajouter 2,5 à 5,0 x 10 ⁴ cellules (5-10 ul de suspension cellulaire) dans le milieu dans chaque puits (figure 1A). Ajuster le nombre optimal selon le type de cellule tumorale et le nombre de jours de croissance souhaités. Cellules tumorales ou des cellules plus grandes croissance rapide peuvent exiger moins de cellules initialement. Amener le volume du puits à 40 pi par addition de milieu et de la pipette de haut en bas pour assurer une distribution uniforme de cellules.
11. Après tous les puits sont ensemencées, permettre aux cellules tumorales d'adhérer à la température ambiante, puis placez le couvercle sur le plat 150 x 15 mm Petri et soigneusement déplacer le plat à un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant au moins 24 h.
12. Changer le milieu de culture quotidienne. Pipetter prudemment une partie du milieu usé de la monocouche et le remplacer par un milieu complet frais.
    NOTE: En raison de l'évaporation, plus de volume devra être ajouté que ce qui était sorti. Wells sera prêt pour le dosage lorsqu'un même, confluent couche de cellules est présent. Ce est typiquement de 1 à 3 jours après l'ensemencement initial.
13. Lavez délicatement monocouche une fois avec PBS comme décrit dans l'étape 1.4 et soit passer à l'étape 2 si monocouches sont souhaitées, ou à l'étape 1.13 ci-dessous pour extraire les protéines d'ECM de la monocouche.
14. Ajouter un Triton-X (v / v) solution à 0,5% dans du milieu complet et ajouter 30 ul à chaque puits. Soit en monocouche digérer hotte pendant 2 min, puis laver deux fois avec du milieu complet par pipetage tel que décrit ci-dessus.
    NOTE: La couche d'ECM peut être visible par microscopie optique (figure 2). Utilisez diapositives tout de suite, ou de garder dans un milieu complet dans le humidifié incubateur à CO ₂ pendant 1-2 jours. Ne pas laisser sécher les puits.

2. La sédimentation des cellules T non adhérentes sur la glissière

1. Si l'imagerie de fluorescence de la population de cellules non-adhérentes est souhaitée, étiqueter les populations de cellules non-adhérentes avec un colorant fluorescent vitale, comme CFSE, Cell Tracker Rouge CMPTX ou eFluor670 en suivant les protocoles fournis par le fabricant au moins 1 heure avant l'essai. Alternativement, manipuler des cellules pour exprimer des protéines fluorescentes codées par des vecteurs viraux.
2. Autoclave le collecteur de sédimentation des cellules dans un sachet en autoclave comme décrit au point 1.2 ci-dessus.
3. Retirer la chambre humidifié contenant des lamelles recouvertes de Teflon de l'incubateur et le placer dans une enceinte de sécurité biologique.
4. Laver les puits avec PBS 1x par pipetage de haut en bas, puis ajouter 45 ul de milieu complet contenant au moins 10% de sérum.
5. Enlever le collecteur de l'enveloppe de stérilisation et soigneusement coulisser dans les puits au cours jusqu'à ce que le «crochet» à la fin de la rampe touche le fond de la glissière (figure 1B).
6. Se assurer que le milieu de culture est visible dans chacun des canaux. Si aucun ne est considéré, enlever le collecteur et ajouter plus de support pour le bien correspondant, puis remplacer et vérifier de nouveau.
7. Répétez l'étape 2.5 pour chaque channel du collecteur, ou pour autant de puits désiré.
8. Compter les cellules non-adhérentes et remettre à pas moins de 1,0 à 2,0 x 10 ⁵ / ul. Dresser une pi de cellules et de les introduire à la pipette dans le canal (figure 1C) lentement. Pour ce faire, pour chaque puits désiré.
9. Laisser l'ensemble du dispositif chargé de la cellule, ce est-collecteur et glissière, l'intérieur de la bio-hotte pendant 20-30 minutes pour permettre aux cellules dans le canal de se déposer.
10. Déposer le collecteur en touchant deux extrémités et doucement la soulevant de la lame afin de ne pas déranger les cellules focalement ensemencées dans le centre des puits (figure 1D).
11. Inspecter chaque puits pour se assurer que les cellules non adhérentes ont été ensemencées avec succès au centre du puits en respectant la circonférence du canal collecteur. Les cellules non adhérentes seront idéalement légèrement adhérer à la monocouche ou ECM et à l'autre, donc déplacer doucement autour de la glissière ne entraînera pas la pelle cellulairet se disperser. Ne pas bousculer la diapositive.

3. Fluorescence Microscopy

1. Avec un équipement expérimental approprié, effectuer l'imagerie après la sédimentation est confirmée. Idéalement, utiliser un microscope équipé d'une chambre de CO ₂ et de l'humidité. L'image à faible puissance, ce est-4X ou 10X, afin de permettre plusieurs images à prendre une plus grande surface de telle sorte que la totalité du puits peut être vu.
2. Acquérir des images numériques en utilisant un logiciel de capture d'image. Effectuer clair et / ou l'imagerie de fluorescence multi-canal.
3. Si vous le souhaitez, mettre en place un time-lapse pour enregistrer des images de différents canaux sur une zone donnée, ou garder la diapositive humidifié et dans un / 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C et manuellement prendre à l'image aux points de temps souhaités (Figure 1E & F, recommandée pour les points de temps plus longues).

4. Analyse et affichage

1. En utilisant le logiciel de retouche d'image, de fusionner la lumière et flimages fluorescents en types de cellules une couche de sorte que plusieurs marqueurs et peut être vu dans la même image. Glissez et déposez les fichiers d'image pour chaque couleur dans le programme et, lorsque vous êtes invité, sélectionnez l'option «Ajouter un calque" pour créer un fichier d'image avec de multiples couches.
   1. A plus fort grossissement, prendre, aligner et assembler des images sur le bien numérique. Alignez fichiers en regardant les régions conservées entre deux images et de superposer une image sur le dessus de l'autre jusqu'à ce qu'une image complète est générée.
2. Ajouter des barres de micron aux images lors de l'acquisition en utilisant le logiciel de capture pour déterminer la distance des cellules individuelles ont migré.
3. Pour déterminer la migration des cellules à différents moments, faire des cartes de fluorescence d'intensité de surface avec le logiciel d'image, ce est à dire, ImageJ, de quantifier l'agrégation des cellules T fluorescent ou étalée dans le temps.
   1. Pour générer des parcelles de surface, prendre une image en couches généré à l'étape 4.1 et sous la fenêtre Calques,décochez toutes les couches sauf ceux correspondant à la chaîne souhaitée. Par exemple, si une parcelle de surface on souhaite visualiser l'expression EMD, seules les couches «verts» correspondant au filtre utilisé pour ce marqueur doit être visible.
   2. Aplatir l'image et l'enregistrer dans un format de fichier reconnu (par exemple, .png) et charger l'image dans le programme. Pour générer le tracé de la surface, changer le type d'image à 8 bits, modifier la luminosité / contraste nécessaire pour réduire fond, et sélectionnez l'option «Analyser Terrain / Surface. Les images de la figure 5 ont été générés par la vérification de la 'Ombre', 'Dessiner Axe »,« un polygone par ligne », et des cases à cocher« lisse ».
   3. Sinon, prendre des mesures en utilisant le rayon ou le diamètre du dépôt de la cellule focale au temps zéro et comparer aux cellules au point le plus extérieur à des moments différents. Le diamètre du puits est de Teflon 6,0 mm.

Results

Les vecteurs viraux codant pour des protéines fluorescentes peuvent être utilisées en plus ou à la place de, un colorant fluorescent. Transduction virale doit être effectuée à l'avance de l'essai de motilité. Les deux types de cellules adhérentes et non adhérentes peuvent être différentiellement étiquetés. Le protocole de transduction dépendra du type de vecteur utilisé. Ici, nous transduites l'alloCTL dans les figures 3, 5 et 6 avec RRV-EMD au moins deux jours à l'avance de l'essai uti...

Discussion

Les cellules tumorales dans une suspension de cellules uniques ont été introduits à la pipette dans les puits d'une lame de téflon masqué. Les cellules ont été laissées à adhérer et ensuite formé des monocouches dans un humidifiée à 5% _de CO2, 37 ° C incubateur (figure 1A). Monocouches établies ou des protéines de la MEC dérivés de la monocouche peuvent être récoltées pour ces dosages (figure 1B). Lymphocytes T effecteurs marqués avec des colorants fluorescents vitaux ou ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lames de microscope masquées en téflon	Scientific Methods	CSM002
Collecteur de sédimentation cellulaire	Creative Scientific Methods	CSM001
de Pétri Corning 430597		150 mm
	Corning		35
	mmMediatech	21-040
20 &mu ; l Pipetman	Gilson	F123600
200 &mu ; l Pipetman	Gilson	F123601
200 &mu ; l pointes de pipette	VWR	89003-060
Eau distillée, déminéralisée (stérile)	Mediatech	25-055
Trypsine	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (en option)	Gibco	12604
Milieux de culture de cellules tumorales (par exemple DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V milieu sans sérum	Invitrogen	12055-083
Sérum de veau fœtal	Omega Scientific	FB-02
Microscope
SPOT	Advanced Diagnostic Instruments
	Millipore	A-003-E
Fibronectine	BD	354008
31/2 x 51/4 Pochettes autoclaves	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Prolifération cellulaire eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH