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Article de méthode

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans

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DOI :

10.3791/52431

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5 février 2015

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1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

Dans cet article

Résumé

La co-expression des protéines est une alternative puissante à la reconstitution in vitro de complexes protéiques, et est d’une aide pour réaliser des tests biochimiques et génétiques in vivo. Ici, nous rapportons l’utilisation de la co-expression protéique chez Escherichia coli pour obtenir des complexes protéiques et pour ajuster la fréquence de mutation des cellules.

Résumé

Nous rapportons ici que l’expression de complexes protéiques in vivo chez Escherichia coli peut être plus pratique que les expériences traditionnelles de reconstitution in vitro. En particulier, nous montrons que la faible solubilité de la sous-unité ε de l’ADN polymérase III d’Escherichia coli (avec une activité exonucléase 3'-5') est fortement améliorée lorsque la même protéine est co-exprimée avec les sous-unités α et θ (présentant respectivement l’activité de l’ADN polymérase et la stabilisation ε). Nous montrons également que la co-expression protéique chez E. coli peut être utilisée pour tester efficacement la capacité des sous-unités de différentes espèces bactériennes à s’associer dans un complexe protéique fonctionnel. Nous montrons en effet que la sous-unité α de l’ADN polymérase III de Deinococcus radiodurans peut être co-exprimée in vivo avec la sous-unité ε d’E. coli. De plus, nous rapportons l’utilisation de la co-expression des protéines pour moduler la fréquence des mutations chez E. coli. En exprimant la sous-unité ε de type sauvage sous le contrôle du promoteur araBAD (inductible par l’arabinose), et en co-exprimant le variant D12A mutagène de la même protéine, sous le contrôle du promoteur lac (inductible par l’isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), nous avons pu modifier la fréquence de mutation d’E. coli en utilisant des concentrations appropriées des inducteurs arabinose et IPTG. Enfin, nous discutons des avancées récentes et des défis futurs de la co-expression des protéines chez E. coli.

Introduction

L'introduction des technologies de surexpression soit stimulé les études biochimiques du faible nombre de copies enzymes et la production industrielle de protéines pharmacologiquement actives (par exemple, l'insuline). Depuis l'avènement de ces technologies, des progrès significatifs ont été réalisés pour augmenter le rendement et la qualité des protéines recombinantes. En outre, 1,2 procaryotes et eucaryotes 3 ​​systèmes de surexpression ont été développés au cours des années, offrant des alternatives utiles à la "cheval de travail" de la biotechnologie de la protéine, ce est à dire, Escherichia coli. En particulier, la disponibilité des plates-formes alternatives à E. coli conduit à la production de peptides ou de protéines portant des modifications post-traductionnelles de recombinaison. Toutefois, il convient de mentionner que E. coli représente encore l'organisme de choix pour la production de protéines recombinantes. Cela est dû à plusieurs facteurs, parmi lesquels peuvent être les plus pertinentsconsidéré: i) la disponibilité d'un certain nombre de systèmes de surexpression (vecteurs d'expression et souches) pour E. coli 1,2; ii) fois le court de production, et des rendements élevés de la biomasse, de E. coli dans une variété de médias riche et synthétique; iii) la manipulation facile, soit à la substance biochimique et génétique au niveau de ce micro-organisme; iv) l'isolement de souches capables de produire des protéines toxiques 4; v) la construction de souches présentant induction homogène au niveau de la population 5,6. En outre, il a été récemment montré que des systèmes d'expression appropriés pour la production dans E. coli de protéines modifications post-traductionnelles peut être conçu et construit deux.

À l'heure actuelle, surexpression de la protéine est principalement utilisé pour obtenir des protéines monomères ou homo-oligomères, dont hypersynthése peut être réalisée avec un seul gène cloné dans un plasmide approprié. Toutefois, l'attention a récemment étéversée à la construction de E. systèmes protéines co-expression coli, contestant la production, in vivo, de complexes hétéro-oligomères 2. Fait intéressant, les premières expériences de protéines co-expression adressé à l'Assemblée inter-espèces de grands et de petits sous-unités de carboxylase cyanobactéries ribulose-1,5-bisphosphate / oxygénase 7,8, et l'association des formes tronquées et pleine longueur du VIH-1 transcriptase inverse neuf. Ces études pionnières ont démontré que la protéine co-expression représente une alternative puissante et traditionnelles dans la reconstitution in vitro. En outre, la protéine co-expression dans E. coli a été utilisée pour produire différentes protéines portant des modifications post-traductionnelles 2, pour obtenir des protéines contenant des acides aminés non naturels 2, et d'augmenter le rendement des protéines membranaires surexprimés 2. En outre, le potentiel de la protéine co-expression en tant qu'outil de conférer à E. coli concurrencence dans la sécrétion de protéines est sous enquête active 2.

Deux principales stratégies de protéines co-expression dans E. coli peut être poursuivi: i) l'utilisation d'un seul plasmide d'accueillir les différents gènes pour être surexprimé; ii) l'utilisation de plusieurs plasmides dans des cellules individuelles pour co-exprimer les protéines cibles. Dans le premier cas, les critères pour le choix du plasmide ne diffèrent pas de ceux des expériences traditionnelles protéines de surexpression simples, bien que particulier des plasmides contenant des éléments promoteur / opérateur en tandem ont été construits pour la co-expression 10. Cette première approche est donc très simple. Toutefois, il convient de mentionner que l'utilisation d'un seul plasmide de co-exprimer des protéines différentes se heurte à deux difficultés majeures: i) la masse moléculaire du vecteur augmente avec le nombre de gènes hébergés, ce qui limite le nombre de protéines co-exprimées; ii) lorsque plusieurs gènes sont clones sous le contrôle d'un promoteur unique, la polarité peut dimienvoyer l'expression des gènes à partir du promoteur distal. L'utilisation de plasmides double ou multiple unique dans E. cellules coli doit accomplir la compatibilité des vecteurs de choix, donc imposer des contraintes aux combinaisons admissibles de plasmides. Toutefois, cette deuxième stratégie de co-expression comporte l'avantage de contenir la masse moléculaire de vecteurs, et limite la polarité. Nous avons récemment construit un système de co-expression de protéines conçu pour faciliter le mouvement alternatif de gènes entre les plasmides co-expression 11. En particulier, nous avons construit la série de vecteurs de pgood, les éléments pertinents qui sont: i) une origine de p15A de réplication, pour assurer la compatibilité des plasmides pgood avec les vecteurs commerciaux contenant l'origine ColE1 (par exemple, la série pBAD 12); ii) une cassette de résistance à la tetracycline; iii) la présence du lac -derived éléments de régulation, ce est à dire, le promoteur-opérateur (O 1) En couple et la LACI q gène. Utiliser un couple pBAD-pgood appropriée, nous avons pu surexpriment le noyau catalytique de E. coli DNA polymerase III, composé de trois sous-unités différentes, ce est-α (la polymerase, ε (3'-5'-3 '5)' exonucléase) et θ (ε stabilisant) 13. En particulier, nous avons démontré que la co-expression du complexe de αεθ était strictement dépendante de l'ajout de la E. coli milieu de culture à la fois de l'IPTG et arabinose, le déclenchement et la surexpression de pgood pBAD, respectivement (figure 1A).

Dans le présent rapport, nous illustrons comment des protéines co-expression peut résoudre efficacement les difficultés liées à la faible solubilité d'une protéine sous-unité complexe. En outre, nous montrons comment dans des tests de complémentation de protéines in vivo peut être effectuée, et nous rapportons enfin sur l'utilisation de protéines co-expression de régler la fréquence de mutation dans E. coli. Dans ce but, nous avons utilisé les couples pgood-PBAD appropriés pour illustrer des exemples pertinents de chaque étude de cas.

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Protocole

1. Isolement de E. coli co-transformants

  1. Préparer des cellules électro-compétentes du E. appropriée coli souche à transformer. Transfert à 1 ml de milieu LB (tryptone, extrait de levure, NaCl à 10, 5 et 10 g / l, respectivement) d'une seule colonie de la souche de choix, et incuber à 37 ° C dans des conditions de secousse, 180 tours par minute. Diluer la pré-culture 1: 500 dans 25 ml de milieu LB frais et on incube la culture à 37 ° C.
  2. Au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 minutes), et remettre en suspension le culot dans 10%, v / v glacée eau-glycérol stérile dans la moitié du volume de la culture d'origine. Répétez cette étape 4 fois, de réduire de moitié chaque fois le volume de la remise en suspension. Enfin, remettre le culot dans du glycérol / eau et diviser la suspension des cellules dans 50 aliquotes. Stocker les aliquots à -80 ° C jusqu'à 6 mois.
  3. Dissoudre le plasmide désiré dans l'eau stérile supplémenté avec 0,5 mM d'EDTA. Thaw sur ice une aliquote de cellules électro-compétentes et mélanger avec une quantité appropriée (2,5-5 ng) du vecteur. Verser le mélange dans une cuvette de 0,1 cm convient pour l'électroporation, et appliquer 1,8 kV.
  4. Transférer immédiatement les cellules électroporées dans 1 ml de milieu SOC (milieu LB complété avec 0,2% p / v de glucose, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl), incuber pendant 1 h sous agitation, et enfin le transfert des aliquotes de 100 ul à des boîtes de Pétri contenant agar LB avec l'antibiotique approprié. Incuber O / N à 37 ° C.
  5. Purifier les transformants en stries des colonies isolées sur des boîtes de Pétri.
  6. Préparer des cellules électro-compétentes des transformants primaires et répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour transformer avec d'autres plasmides.
  7. Préparer des stocks de glycerol des co-transformants. Transfert d'une seule colonie dans LB supplémenté avec les antibiotiques appropriés, incuber à 37 ° C sous agitation, et au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 min. Resuspend le culot dans du milieu LB contenant les antibiotiques-support 15% v / v glycérol. Répartir en aliquotes et stocker à - 80 ° C.

2. Co-expression des sous-unités α et ε de E. coli DNA polymerase III

  1. Transfert avec une boucle stérile une petite quantité du stock de glycérol de souche appropriée (par exemple, TOP10 / pgood-ε243 et TOP10 / pgood-ε243-θ / pBADα1160, voir la figure 1) dans une boîte de Pétri contenant le milieu LB et des antibiotiques. Laissez le suspension de cellules sec sur la boîte de Pétri, et série les cellules gouttelettes. Incuber à 37 ° CO / N.
  2. Transfert, en utilisant un cure-dents stérile, une colonie unique de 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber 8 h à 37 ° C. Diluer la pré-culture 1: 500 dans du milieu frais et on incube à 30 ° C pendant 15 heures.
  3. Ajouter IPTG, l'arabinose, ou l'arabinose et IPTG, 1 mM chacun. Incuber à 30 ° C pendant 2,5 heures. Recueillir les cellules, et de stocker les granulés à -20 ° C.
  4. Décongeler les pastilles sur de la glace et remettre en suspension dans du tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 2,5 mM de dithiothréitol, du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM (PMSF), pH 8). Homogénéiser doucement la suspension de cellules avec un potier de verre à froid.
  5. Soniquer à 15 W pendant 15 secondes, suivie de 15 sec temps de refroidissement (4 cycles).
  6. Centrifuger les extraits de protéines totales à 10 000 xg pendant 20 min, à 4 ° C pour récupérer la fraction soluble.
  7. Analyse par SDS-PAGE (12,5% d'acrylamide) des fractions aliquotes de chaque extrait protéique soluble. Dans ce but, transférer 20 pi de chaque extrait protéique soluble dans des tubes Eppendorf contenant 60 ul de H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) SDS, 50% (v / v) de glycerol, 0,25% (p / v) de bleu de bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h.

3. Co-expression de α sous-unité de Deinococradiodurans cus ADN polymérase III et ε sous-unité de E. coli DNA polymerase III

  1. Préparer un pré-culture de l'E. coli souche TOP10 / Dr pBAD-α / pgood-ε243 dans 1 ml de milieu LB-ampicilline tétracycline et incuber 8 h à 37 ° C. Diluer 1: 1000 dans un milieu frais et incuber O / N à 37 ° C.
  2. Diluer 1: 100 dans 200 ml de milieu frais, incuber à 37 ° C pendant 3 heures, puis induire pendant 3 heures avec l'arabinose et IPTG, 1 mM de chacun. Récolter les cellules, et de stocker le culot à -20 ° C.
  3. Reprendre le culot dans 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogénéiser et perturber les cellules comme décrit dans 2.4 et 2.5.
  4. Centrifuger immédiatement les cellules lysat à 10 000 g pendant 20 min. Jeter le culot. Filtrer le surnageant avec un entonnoir Büchner équipé avec trois couches de papier filtre. Appliquer une dépression douce. Pour éviter un excès de mousse, garder le vide erlenmeyer sur la glace lors de la filtration.
  5. Déterminer la concentration en protéine selon Bradford 14.

4. Filtration sur gel Une Chromatographie

  1. Equilibrer un 16x70 chemise d'eau (200) colonne de filtration sur gel avec 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, pH 8. charge sur la colonne de l'extrait protéique soluble. Pour une résolution optimale, utiliser une boucle échantillon de 1 ml. Effectuer la chromatographie à 0,6 ml / min. Maintenir la température de la colonne à 4 ° C tout au long.
  2. Récupérer 0,9 ml des fractions et de les analyser par SDS-PAGE. Transférer 20 pl de chaque fraction en rapport avec des tubes Eppendorf contenant 60 ul de H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) de SDS, 50% ( v / v) de glycérol, 0,25% (p / v) bleu bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h.
  3. Déterminer l'exonucléase 3'-5 et de l'activité d'ADN polymérase de chaque fraction dans 96 nousll microplaques. Doser l'activité d'exonucléase en utilisant la thymidine 5'-monophosphate ester de p-nitrophényle (p NP-TMP) comme substrat 15. Estimer une activité de polymerase d'ADN en utilisant le PPX (Pyrophosphatase, la purine nucléoside phosphorylase, la xanthine oxydase) enzyme couplé à essai 16 et de 2- (4-iodo-phényl) -3- (4-nitrophényl) de chlorure -5-phényl-2H-tétrazolium (INT) comme accepteur 16 d'électrons.

5. Mutation analyse des populations co-exprimant le type sauvage ε sous-unité de E. coli ADN polymérase III et l'mutagènes εD12A Variant

  1. Transférer une seule colonie de E. coli TOP10 contenant le pBAD-ε et les pGOOD1-εD12A 11 vecteurs à 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber O / N à 37 ° C.
  2. Diluer la pré-culture 1: 250 dans des flacons contenant du milieu frais 3 (10 ml), ajouter les inducteurs appropriés (arabinose, de l'IPTG, et de l'arabinose ou de l'IPTG 1 mM chacun) et incuber à 37 ° Cpendant 8 heures. Préparation de cultures parallèles non induit.
  3. Recueillir des aliquotes de 1 ml, puis diluer 1: 500 dans de nouveaux flacons contenant du milieu frais (10 ml) supplémenté ou non avec les inducteurs appropriés. Incuber O / N à 37 ° C.
  4. Répétez les étapes 5.2 et 5.3 et de recueillir des aliquotes de 1 ml.
  5. Déterminer le nombre de générations est produit dans chaque culture. Transfert sur des plaques LB, 100 pi de dilutions en série appropriées d'inoculum et de la culture. Incuber O / N à 37 ° C. Compter les colonies sur des plaques LB, et calculer le logarithme du nombre de cellules présentes dans l'inoculum (log I) et dans la culture à la fin de la croissance (log C). Pour déterminer le nombre de générations, utiliser la formule: (log C - log I) /0.301.
  6. Centrifuger à 5000 xg pendant 20 min et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM de NaCl. Pour perméabiliser les cellules, ajouter 2 à 3 gouttes de chloroforme et vortex pendant 20 s.
  7. Déterminer la β-glucosidase de chaque aliquote dans une microplaque à 96 puits, en utilisant du p-nitrophényl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) comme substrat. Ajouter à chaque puits 100 pi de cellules perméabilisées et 100 pi de substrat (16 mg / ml solution mère dans H 2 O). Prenez soin d'éviter les bulles d'air dans les puits. Lire l'absorbance à 420 nm, en utilisant un lecteur de microplaques et le filtre approprié.

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Résultats

La sous-unité ε de E. coli l'ADN polymérase III se compose de 243 acides aminés et dispose d'une faible solubilité 17,18, à moins que les résidus 187 à 243 sont supprimés 17. Cependant, nous avons précédemment montré 11 que la co-expression de α-métrages, ε, et sous-unités θ donne soluble ADN polymérase III noyau catalytique (figure 1). En particulier, en utilisant le système pBAD-pgood co-expression, nous avons démontré que: i) la surexpression de sous-...

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Discussion

Les protéines peuvent être intrinsèquement désordonnée, avec des régions dont la structure tertiaire ne est pas restreinte à un nombre limité de conformations 25. Ces protéines désordonnées sont généralement sujettes à l'agrégation 25, et de leur isolement et la caractérisation pourraient représenter une tâche difficile. La sous-unité ε de E. coli DNA polymerase III possède deux domaines distincts 26,27, à savoir: i) le domaine N-ter, portant la 'activité 3'-5' e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

L'autorisation par Springer et Elsevier réimprimer chiffres est grandement reconnu.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgarSigma-AldrichA1296
AmpicillineSigma-AldrichA9518
ChloroformeSigma-Aldrich288306
EDTASigma-AldrichEDS
GlycérolSigma-AldrichG5516
INTSigma-AldrichI8377
IPTGSigma-AldrichI5502
KClSigma-AldrichP9541
L-ArabinoseSigma-AldrichA3256
MgCl2Sigma-AldrichM2670
NaClSigma-Aldrich31434
PMSFSigma-AldrichP7626
PNP-glucSigma-AldrichN7006
pNP-TMPSigma-AldrichT0251
TétracyclineSigma-Aldrich87128
Trizma base  ;Sigma-AldrichT1503
TryptoneSigma-Aldrich95039
Extrait de levureFluka70161
Solution d’acrylamide 30 %BioRad161-0158Pour l’électrophorèse sur gel
Perphorate d’ammoniumBioRad161-0700Pour l’électrophorèse
sur gel GlycineBioRad161-0718Pour le gel électrophorèse
SDSBioRad161-0302Pour électrophorèse
sur gel TEMEDBioRad161-0800Pour électrophorèse sur gel
TrisBioRad161-0719Pour électrophorèse sur gel
Cuvettes 0,1 cmBioRad1652089Pour électrophorèse
Centrifugeuse 5415REppendorf
Centrifugeuse Allegra 21RBeckman
Appareil de chromatographie GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II électroporationBioRad
Lecteur de microplaques 550Biorad
MiniProtean 3 cellulesBioRad
AlimentationBioRad
Sonicateur 3000Misonix

Références

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