Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

Résumé

Des analyses approfondies des protéomes de cellules cancéreuses facilitent l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses et de biomarqueurs diagnostiques. Nous décrivons un flux de travail expérimental pour l’analyse quantitative des (phospho-)protéomes dans des sous-populations de cellules cancéreuses dérivées de tumeurs liquides et solides. Ceci est réalisé en combinant des stratégies d’enrichissement cellulaire avec la spectrométrie de masse quantitative basée sur Super-SILAC.

Résumé

Des analyses approfondies des protéomes cellulaires de cancer sont nécessaires pour élucider pathomécanismes oncogènes, ainsi que d'identifier des cibles potentielles de médicaments et de biomarqueurs de diagnostic. Cependant, les méthodes de caractérisation protéomique quantitative des tumeurs provenant de patients et en particulier leurs sous-populations cellulaires font largement défaut. Nous décrivons ici un montage expérimental qui permet l'analyse quantitative des protéomes de sous-populations de cellules cancéreuses dérivées de soit des tumeurs liquides ou solides. Ceci est réalisé par la combinaison des stratégies d'enrichissement cellulaire avec la spectrométrie de masse à base de Super-SILAC quantitative suivie d'analyse bioinformatique des données. Pour enrichir sous-ensembles cellulaires spécifiques, tumeurs liquides sont d'abord immunophénotypés par cytométrie de flux suivie par FACS-tri; des tumeurs solides, microdissection par capture laser est utilisé pour purifier des sous-populations cellulaires spécifiques. Dans une deuxième étape, les protéines sont extraites à partir des cellules purifiées et ensuite combinés avec un spécifique d'une tumeur,SILAC marqué norme de pic-in qui permet la quantification des protéines. Le mélange de protéine ainsi obtenu est soumis à une électrophorèse sur gel ou l'autre filtre ou assistée Préparation d'échantillons (FASP) suivie d'une digestion trypsique. Enfin, les peptides tryptiques sont analysés en utilisant un spectromètre de masse quadripolaire Orbitrap-hybride, et les données obtenues sont traitées avec des suites de logiciels bioinformatiques y compris MaxQuant. Par le biais du flux de production présentée ici, jusqu'à 8000 protéines peuvent être identifiés et quantifiés dans les échantillons de patients dérivés, et les profils d'expression de protéines qui en résultent peuvent être comparés chez les patients pour identifier les signatures protéomiques de diagnostic ou de cibles potentielles de médicaments.

Introduction

Protéomique par spectrométrie de masse a vu le jour et est maintenant une discipline largement utilisé en biologie cellulaire et de la recherche biomédicale translationnelle. Les progrès techniques dans le domaine ont permis d'étudier les processus cellulaires complexes dans des lignées cellulaires et des modèles animaux, que des milliers de protéines peuvent être identifiées dans une seule expérience de spectrométrie de masse ^1,2. Des progrès similaires ont été réalisés pour l'analyse de nombreuses modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation ou ubiquitination, bien que cela nécessite généralement workflows sur mesure pour l'enrichissement et l'analyse de données pour chaque type de modification ^2,3. En outre, la participation des stratégies d'étiquetage chimiques et métaboliques, y compris SILAC, permet une quantification précise et relative de protéines et de PTM, ce qui rend cette méthode particulièrement intéressante pour la découverte des processus cellulaires de base, biomarqueurs diagnostiques et cibles potentielles de médicaments dans le cancer humain ^4.

Cependant,plusieurs défis doivent être surmontés à l'égard de l'analyse protéomique des cancers humains primaires ^5. Tout d'abord, des échantillons de cancer humain présentent souvent un degré élevé d'hétérogénéité cellulaire qui est due à la présence de divers types de cellules appartenant au micro-environnement de la tumeur, y compris les cellules immunitaires et les fibroblastes. Deuxièmement, l'évolution clonale conduit à la diversité génétique dans les tumeurs elles-mêmes, ce qui entraîne l'existence de plusieurs sous-populations cellulaires ayant des propriétés fonctionnelles distinctes. Selon le concept actuel de quelques cellules souches du cancer étant les forces motrices derrière le développement du cancer et la progression, analyse protéomique de ces sous-populations cellulaires (fonctionnellement très pertinents) devrait être d'une importance majeure pour une meilleure compréhension des mécanismes oncogéniques pertinentes pour l'application clinique ^6. En troisième lieu, les profils d'expression de protéines quantitatives de grandes séries d'échantillons sont souvent nécessaires pour l'identification du solide clinique BiomarKERS; cela ne peut être accompli par l'étiquetage des produits chimiques tels que iTRAQ ^7, tandis que les stratégies de marquage métabolique - se appuyant, comme ils le font, sur la prolifération cellulaire ⁴ - sont également inapplicable. En quatrième lieu, la plupart des échantillons de tumeurs solides disponibles sont fixés à la formaline, ce qui complique l'analyse spectrométrique de masse du protéome due à la formation de reticulations de protéines ^8. Enfin, la plupart des workflows existants protéomique nécessitent des quantités importantes de traitement des échantillons et d'acquisition de données, ce qui rend l'analyse des numéros d'échantillons pertinents pour la recherche clinique difficile, et appelant à nouveau workflow paradigmes de ^9,10.

Pour surmonter ces obstacles, nous avons développé un dispositif expérimental qui combine soit cellule de cytométrie en flux de tri ¹¹ ou laser capture microdissection ^12,13 pour l'enrichissement cellulaire avec une stratégie Super-SILAC ¹⁴ d'introduire une norme globale interne pour l'analyse par spectrométrie de masse globale. En utilisant le procédé décrit ici, il est possible de quantifier jusqu'à 8000 protéines dans des échantillons de tumeurs humaines simples dérivées de cancers solides ou liquides.

Protocole

Toutes les expériences sur des échantillons de tissus ou de sang humain doivent être approuvés par un comité d'éthique et menées selon des directives données dans le vote d'éthique.

1. Enrichissement Cellulaire

1. Tumeurs liquides / tri cellulaire activé par fluorescence.
   1. Isoler les cellules mononucléaires de la moelle osseuse ou de sang en effectuant la lyse des érythrocytes en utilisant du chlorure d'ammonium ou par gradient de densité Ficoll centrifugation.
      1. Pour la lyse des érythrocytes, mélanger 1 ml d'échantillon avec 4 ml de solution de chlorure d'ammonium. Incuber la solution sur la glace pendant 5 à 10 min. Ajouter 40 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 2% de sérum de veau foetal (FCS) et centrifuger pendant 5 min à 400 x g et 4 ° C.
      2. Pour gradient de Ficoll centrifugation, la couche 10 ml d'échantillon sur 15 ml de Ficoll-Hypaque pour former deux couches distinctes (attention à ne pas déranger les couches). Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante (15-25 ° C) avec précaution et récolter le mononucléairecellules qui se accumulent à l'interphase.
      3. Isoler les cellules et de les prendre en PBS + 2% de FCS. Centrifuger à 400 g pendant 5 min et prélever dans 1 ml de PBS + 2% FCS. Prendre une aliquote comme contrôle négatif et une aliquote pour chaque colorant fluorescent utilisé dans la tache finale.
   2. Incuber avec des anticorps utiles pour isoler la population de cellules leucémiques dans la dilution selon les instructions du fabricant sur de la glace pendant 30 min marquées par fluorescence. Tacher également les aliquotes utilisées pour la compensation avec chaque anticorps individuellement. Laver deux fois avec du PBS + 2% de FCS.
      REMARQUE: Les anticorps utilisés étaient de souris anti-humain contre CD117-PE (Clone 95C3), CD34-FITC (Clone 8G12) et CD33-PE (Clone P67.6).
   3. cellules de filtre à travers 35 um tamis cellulaire, en utilisant idéalement tubes avec tamis cellulaire intégrés dans le bouchon.
   4. Ajouter la viabilité cellulaire tache (par exemple, 7-AAD). Trier les cellules en utilisant un trieur de cellules approprié ¹¹ (Figure 2). Recueillir cellules Isc Moyen (l'IMDM) de modification de Dulbecco ove contenant 10% de FCS.
2. Les tumeurs solides / Laser-microdissection.
   1. Pour les expériences décrites, les échantillons FFPE échantillon de cancer du poumon ont été utilisés. Pour ce but tissu de cancer du poumon a été immédiatement fixée dans du formol tamponné à 4% après résection chirurgicale et des morceaux de 3 x 2 cm x 1 où incorporé dans de la paraffine pour une analyse ultérieure.
   2. Couper des sections de 5 à 10 um d'épaisseur de la paraffine (FFPE) échantillon fixé au formol avec un microtome. Sections de montage sur des lames de membrane film couverte et sèche à 37 ° C pendant 1 heure. Déparaffiner et réhydrater les sections montées par incubation successive dans le xylène, l'éthanol absolu, 70% et de l'eau, chacun pendant 1 min.
   3. Colorer les sections avec hématoxyline pendant 20 secondes, puis rincer à l'eau du robinet. Recueillir la population de cellules d'intérêt en utilisant un système de microdissection laser capture (voir aussi ^12).

titre "Extraction des protéines> 2.

1. Tumeurs liquides.
   1. Centrifuger la suspension cellulaire de l'étape 1.1.5 à 400 xg, 4 ° C pendant 4 minutes et éliminer le surnageant. Laver deux fois avec 500 ul de PBS froid et centrifugation pendant 5 min à 400 x g et 4 ° C
   2. Ajouter 40 ul de tampon de lyse par 10 ⁶ cellules et incuber pendant 15 min sur de la glace (10 ⁵ cellules (env. 10 ug de protéine totale) doit être le nombre minimum de cellules). Centrifuger le lysat à 14 000 xg, 4 ° C pendant 10 min et transférer le surnageant (lysat cellulaire de effacée) dans un nouveau tube de réaction. Jeter le culot.
2. Les tumeurs solides.
   1. Ajouter 60 ul de tampon de lyse de tissu au tissu microdissection et incuber pendant 15 min sur de la glace, de recueillir le fluide par centrifugation courte et transférer la suspension dans un nouveau tube de réaction. Soniquer le lysat sur la glace pendant 3 min.
   2. Ajouter 15 ul de 20% de dodécylsulfate de sodium (SDS) à une co atteindre une finale de SDSncentration de 4%. Incuber le tissu microdissection à 99 ° C dans un bloc chauffant pendant 1 heure et agité à 600 tours par minute. Centrifuger le lysat à 16 000 x g, 18 ° C pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube.

3. Création d'un SILAC Spike-Quantification en standard (Super-SILAC standard)

NOTE: La norme de quantification se compose d'un mélange de protéines SILAC marqué dérivé 4-6 lignées cellulaires qui correspondent au type d'intérêt de la tumeur. Pour réaliser le chevauchement maximal entre le protéome de référence SILAC marqué et le protéome dérivée d'une tumeur, une analyse en composantes principales doit être effectuée avant que les lignées cellulaires sont sélectionnés pour la norme de ¹⁴ quantification.

1. Analyse en composantes principales (ACP).
   1. Afin de déterminer les profils d'expression des protéines de lignées cellulaires, de cultiver une dizaine de différentes lignées cellulaires dans un milieu de culture cellulaire approprié. Lyse des cellules telles que décritesà l'étape 2.1. Préparer lysats cellulaires pour la spectrométrie de masse comme décrit dans l'étape 6.1.
   2. Analyser le profil d'expression protéique de chaque lignée cellulaire sur une haute résolution, chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse (nanoLC-MS / MS).
   3. Analyser les données brutes résultant en utilisant un logiciel libre et MaxQuant effectuer une analyse en composantes principales en utilisant le logiciel associé, comme Persée ^16,17.
   4. Sélectionnez 4-6 lignées cellulaires qui montrent la plus grande diversité entre leurs profils protéines expression et les utilisent pour générer la norme de pic-à Super-SILAC.
2. SILAC-étiquetage et le contrôle de l'étiquette.
   1. Cultiver les lignées cellulaires sélectionnées pendant au moins cinq cycles cellulaires dans un milieu de culture de cellules approprié SILAC, dans laquelle l'arginine et la lysine sont marqués avec des isotopes stables du carbone et de l'azote (milieu SILAC) ^4.
   2. Lyse des cellules comme décrit dans l'étape 3.1 et préparer lysats cellulaires pour la spectrométrie de masse comme décrit dans l'étape 6.1.Mesurer l'efficacité d'incorporation de l'étiquetage SILAC par nanoLC-MS / MS. Analyser les données brutes de SM résultant avec MaxQuant et de déterminer l'efficacité de SILAC-étiquetage. Ce résultat est obtenu en comptant le nombre de peptides identifiés dans leur marqué (lourde) et leurs formes endogènes (lumière), et le calcul du ratio (lourd) / (+ la lumière lourde). l'efficacité de l'étiquetage devrait dépasser 98%.
3. Combinaison de protéomes de SILAC et validation.
   1. Cultiver et développer des lignées cellulaires sélectionnées selon les instructions du fabricant dans un milieu de SILAC appropriée. Lyse des cellules, comme décrit à l'étape 2.1 pour les tumeurs liquides ou comme décrit dans l'étape 3.2 de tumeurs solides et de déterminer la concentration en protéine de chaque lysat cellulaire.
   2. Mélanger des quantités de protéines équimolaires de chaque lignée cellulaire et diviser le mélange dans aliquote. Snap-congeler les aliquotes et conserver à -80 ° C jusqu'à la mesure. Pour une expérience dont vous avez besoin de 20 à 50 ug de la norme Super-SILAC. Prenez soin de préparer le standard en excès que de changer le standard dans une série d'expériences doit être évitée.

4. Mesure de la concentration de protéines et Spike-in

1. Tumeurs liquides.
   1. Utilisation essai de quantification de protéine déterminer les concentrations protéiques des lysats cellulaires les respectives et la norme Super-SILAC.
   2. Mélanger des quantités égales de lysat cellulaire et le niveau autorisé, Super-SILAC et ensuite ajouter du dodécylsulfate de lithium (LDS) tampon (25% du volume de l'échantillon) et l'agent réducteur (10% du volume de l'échantillon).
   3. Chauffer la solution résultante dans un bloc chauffant à 72 ° C pendant 10 min. Eventuellement, stocker les protéines dénaturées résultant à -80 ° C.
2. Les tumeurs solides.
   1. Pour la mesure de la concentration de protéine sur un lecteur de plaques, un mélange de sérum-albumine bovine standard (BSA) série de solution de dilution, et le lysat la norme Super-SILAC approprié avec une protéine disponible dans le commerce unéssayé dans une plaque de 96 puits et agiter pendant 1 min, incuber pendant le temps indiqué et mesurer l'absorbance comme indiqué par le fabricant.
      REMARQUE: La forte concentration de SDS et de dithiothréitol (DTT) dans le lysat est un problème pour la plupart des dosages disponibles pour la détermination de la concentration en protéines.
   2. Mélanger des quantités égales de lysat clarifié et la norme Super-SILAC avec 200 ul d'urée dans l'unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 30 min à 20 ° C. Ne pas utiliser plus de 50 pi de lysat clarifié et la norme Super-SILAC. Eviter des températures inférieures à 15 ° C, de sorte que l'urée ne cristallise pas.

5. La séparation des échantillons et protéines Digest

1. Tumeurs liquides.
   1. Séparée de 30 à 100 ug de protéine totale par voie sur une 4 - gradient gel SDS-PAGE à 12%. protéines de tache avec du bleu de Coomassie O / N. Retirer l'excès de coloration Coomassie par deux lavages ultérieurs avec de l'eau.
   2. Couper chaque voie du gel et diviseren 23 tranches de taille égale, quel que soit le motif de coloration de gel. Traiter les tranches de gel séparément, chacun dans 0,6 ml dans un flacon de polypropylene.
   3. Laver les tranches de gel avec de l'eau et du méthanol / eau (50:50, v / v), de réduire de 10 mM de DTT par incubation pendant 30 min à 56 ° C. Alkyler les tranches de gel avec 55 mM d'iodoacétamide (IAA) par incubation à 60 min à température ambiante dans l'obscurité.
   4. Entre les étapes d'échantillonnage-manipulation, se laver avec de l'acétonitrile tranches pendant 15 min et sec dans un SpeedVac pour enlever l'excès de solvant et d'améliorer l'absorption de la solution de réactif.
   5. Effectuer une protease de clivage en réhydratant tranches de gel séchées avec la quantité minimale de solution de trypsine porcine (12,5 ng / ul dans 0,025 M de bicarbonate d'ammonium aqueux) pendant 16 heures à 37 ° C.
   6. Ajouter de l'eau de 10 pi de tranche de gel et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Ajouter 80 ul d'acétonitrile et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Centrifuger à 15 800 xg, pendant 1 min. Recueillir surnageant et conserver dans un séparées 0,6 mltube.
   7. Ajouter 65 pi de 5% d'acide formique solution, vortex et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Ajouter 65 ul d'acétonitrile et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Centrifuger à 15 800 g pendant 1 min. Récupérer le surnageant et ajouter au surnageant provenant de l'étape précédente. On évapore le produit surnageant combiné à siccité dans un concentrateur sous vide.
2. Les tumeurs solides.
   1. Pour éliminer le SDS de lysat de tissu utiliser le protocole FASP suivante, également décrit comme dans la référence ^15.
   2. Après la première centrifugation décrit dans l'étape 5.2.3 ajouter encore 200 ul d'urée 8 M sur le filtre, et en outre centrifuger à 14 000 xg pendant 20 min à 20 ° C. Jeter le filtrat de accréditives.
   3. Ajouter 100 ul IAA et mélanger dans un thermomixer à 600 rpm pendant 1 min. Incuber le filtre pendant 20 min à 20 ° C dans l'obscurité. Centrifuger le filtre à 14 000 xg pendant 10 min à 20 ° C.
   4. Ajouter 100 ul d'urée au filtre et centrifuge à 14 000 x g, pendant 15 min à 20 ° C. Répétez cette étape une fois de plus.
   5. Ajouter 100 ul de NH ₄ HCO ₃ pour le filtrage et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min à 20 ° C. Répéter deux fois cette étape.
   6. Ajouter 40 ul NH ₄ HCO ₃ + 1 pi (= 0,4 ug) trypsine et mélanger dans thermomixer à 20 ° C pendant 600 tours, 1 min. Incuber le filtre O / N dans une chambre humide à 37 ° C. Transférer le filtre à de nouveaux tubes de prélèvement.
   7. Centrifuger le filtre à 14 000 xg pendant 10 min à 20 ° C. Ajouter 50 pi de NH ₄ HCO ₃ et centrifuger les filtres à 14000 g pendant 10 min à 20 ° C. Conserver les peptides résultant à -20 ° C jusqu'à la mesure de spectrométrie de masse.
   8. Pour la mesure de la concentration de peptide, 50 ul de distribuer le flux continu résultante et une série de dilutions appropriées de tryptophane pur dans une plaque à 96 puits. Mesurer la fluorescence du tryptophane. Convertir la concentration résultante detryptophane à la concentration de peptide, comme 0,1 pg de tryptophane correspond à 9 ug de protéine.

Analyse 6. chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse

1. Reprendre peptides dans un tampon de charge 30 pi de 5 min dans un bain de sonication. Isoler dans une centrifugeuse à 15 800 g pendant 1 min et pipette la solution claire dans un flacon de MS échantillonneur automatique.
2. Injecter 5 ul d'échantillon par analyse à l'aide de l'échantillonneur automatique du système nanoLC-MS / MS. Concentrer et dessaler peptides en ligne sur une phase inversée C18 pré-colonne (0,15 mm ID x 20 mm avec 5 um taille des pores matériau C18) soit monté dans une configuration de colonne ventilé ou une configuration de pré-colonne de commutation.
3. Peptides séparés sur un C18 microcolonne en phase inverse (0,075 mm de DI x 200 mm auto-garnie de 3 pm ou plus petit pore matériau taille de C18 dans une colonne de nanospray auto-paquet comme PicoFrit, en utilisant un gradient de 90 min de 5> 35% d'acétonitrile vs . acide formique aqueux à 0,1% à 300 nl /min. Transfert éluant en un hybride quadripôle / spectromètre de masse Orbitrap par une source nanospray d'ions.
4. Analyser peptides en utilisant une méthode Top15 des données dépend d'acquisition (MS m / z de gamme 350 -. 1600, la résolution cible 70,000 FWHM, AGC cible 1 x 10 ^6, max temps de remplissage de 60 msec MS / MS départ de masse 100, la résolution cible 17,500 FWHM, AGC cibler 2 x 10 ^5, temps de remplissage max 60 ms MS / MS seuil 3 x 10 ^4, comprennent des états facturer 2 -. 5, normalisé énergie de collision NCE 25%, dynamique exclusion 15 sec).

7. Analyse des données

1. Pour l'analyse de données d'utiliser le logiciel MaxQuant ¹⁶ disponible gratuitement. Un protocole détaillé pour l'analyse de données bioinformatique est décrite dans ^16,17. Pour l'analyse, de combiner des fichiers de données brutes de toutes les tranches à partir d'un SDS-PAGE voies en une seule expérience ^17.

Résultats

Profilage protéomique des tumeurs liquides et solides provenant de patients est une approche prometteuse pour la découverte de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et prédictives. Toutefois, la procédure de préparation d'échantillon et l'analyse par spectrométrie de masse sont difficiles en raison de la complexité des échantillons, et la nécessité d'une quantification précise de la protéine en grandes séries d'échantillons. Le procédé expérimental décrit ci-dessus commence avec l'isolement de cellules d'intérêt, soit par tri cellulaire activé par fluorescence ou par microdissection par capture laser.

A cette fin, des cellules provenant des aspirats de moelle osseuse provenant de patients ou d'échantillons de sang sont colorées avec des anticorps marqués par fluorescence contre des marqueurs de surface d'intérêt définies avant le triage FACS et à base de lyse des cellules.

Pour enrichir des sous-ensembles cellulaires provenant des coupes de tissus, ceux-ci doivent d'abord être monté sur des glissières appropriées pour permettre au laser capture microdissection. A cet effet, monter til coupes de tissus sur les lames de membranes appropriées et utilisent un laser capture microdissecteur selon les instructions du fabricant. Sélection des zones et des cellules d'intérêt exige une connaissance appropriée de la histomorphologie des tissus sains et néoplasiques. Les cellules extraites sont ensuite transférés dans un tube de collecte approprié. Des expériences initiales doivent être effectuées afin de définir la quantité de tissu nécessaire pour l'extraction de quantités suffisantes de protéine (10 ug de protéine totale minimale) pour chaque nouveau tissu d'intérêt. Chaque échantillon est traité par microdissection 60 ul de tampon de lyse tissulaire. Pour la lyse efficace des cellules provenant d'échantillons de tissus doivent être soumis à une sonication pendant 3 minutes et après addition de 15 ul de SDS échantillons sont incubés dans un Thermomixer à 99 ° C pendant 1 heure pour éliminer des reticulations de protéines induite par la formaline. Centrifugation va enfin faciliter la collecte du lysat cellulaire autorisé.

Pour chaque maladie de intérêt (liquide et tumeurs solides) une norme de quantification Super-SILAC approprié doit être mis en place ^14. Une norme appropriée devrait représenter plus de 90% des protéines exprimées dans les échantillons d'intérêt. Pour la préparation d'un étalon de quantification, les lignées cellulaires liés au type de cancer intérêt doivent d'abord être analysés par spectrométrie de masse pour déterminer leurs profils d'expression de protéine et ensuite analyse en composantes principales doivent être effectués. 4-6 lignes différentes de cellules avec des motifs d'expression de protéines différencié devraient être choisis et SILAC-étiquetés avec de l'arginine et la lysine "lourd". l'efficacité de l'étiquetage doit être vérifiée par nanoLC-MS / MS et doit être supérieure à 98%. Ensuite, les lignées cellulaires doivent être lysées de la même manière que l'échantillon dérivé du patient respectif et, par la suite, des quantités équimolaires de protéine de chaque échantillon et de l'étalon de pic-à SILAC doivent être mélangés. Une étape cruciale pour la quantification précise de protéines des échantillons cliniques ointérêt de f est le mélange précis des quantités de protéines équimolaires des échantillons provenant de patients et la norme de quantification de SILAC pic-in. Pour déterminer la concentration de protéine de lysats provenant de cellules triées, divers dosages de quantification de protéine peuvent être utilisés. Pour lysats cellulaires à partir de cellules dérivées de tissu un test est nécessaire, qui peut faire face à de fortes concentrations de SDS et DTT dans le lysat. Les concentrations de protéines des échantillons de patients dérivés et le niveau de pic en SILAC doivent être mesurés à chaque fois avant la combinaison avec les échantillons cliniques respectives afin d'assurer mélange correct, ce qui est crucial dans la fabrication même des centaines d'échantillons comparables.

Après que le mélange de quantités égales de pointe dans des échantillons standards et de lysat, obtenus à partir de tumeurs liquides sont mélangés avec des LDS, réchauffées dans un Thermomixer à 72 ° C pendant 10 min et ensuite soumis à 1D-PAGE et en gel de la digestion séparés les protéines avec de la trypsine. Les échantillons obtenus à partir detissus sont libérés du SDS et digérée par la trypsine en utilisant l'approche de FASP établi par Wisniewski et al. ¹⁵

Les peptides trypsiques obtenus peuvent être quantifiés en mesurant la fluorescence du tryptophane, ce qui est d'un intérêt particulier pour des échantillons de tissu que la quantité de peptides libérés à partir du filtre diffère entre 15% et 75% par rapport aux quantités de protéines initialement chargées sur le filtre. A cet effet, nous mesurons la fluorescence du tryptophane. La comparaison avec une série de dilutions de tryptophane permet approprié pour la quantification de peptides, comme 1,1 pg de tryptophane correspond à environ 100 ug de peptide. Si nécessaire, des échantillons provenant en particulier de la transformation du FASP peuvent être pré-purifiés soit sur ​​des conseils de la scène commerciale ou faits maison emballés avec (RP-C18) matériau à phase inversée C18 avant de charger sur le système nanoLC / MS / MS ^18.

analyse par spectrométrie de masse est effectuée sur une grande-résolution, haute sensibilité système spectrométrie de masse. En bref, des échantillons de peptides sont dessalés et préconcentrées sur une pré-colonne RP-C18, et on les sépare sur une colonne analytique RP-C18 couplé directement au spectromètre de masse. Pour atteindre une profondeur suffisante de l'analyse, nous employons soit une combinaison de SDS-PAGE protéines préfractionnement 40 min gradients RP-C18 (pour les tumeurs liquides) ou des injections uniques avec de longues 2-3 h gradients RP-C18 (pour les tumeurs solides traitées par FASP ). MS spectres sont acquis avec une résolution de 70 000 FWHM ou mieux, pour permettre une quantification précise de paires SILAC par intégration des pics des profils chromatographiques. Pour l'identification de la protéine, un procédé d'acquisition de données dépendant Top15 est utilisée pour générer un grand nombre de peptide spectres MS / MS pour l'identification des peptides et des protéines.

A partir des données brutes résultant, l'identification et la quantification de protéines sont atteints par la base de données avec le logiciel recherche MaxQuant contre un UniProt Knowledgebase Human base de données de séquence complète du protéome ^17. Dans MaxQuant logiciel (version actuelle 1.5.0.25) peptides sont identifiés à partir de la spectres MS / MS acquis par fragment peptidique correspondant pas aux spectres dérivé in silico à partir de la base de données de séquences de protéines. Dans le même temps, ion précurseur profils isotopiques sont extraites autour de leurs temps de rétention chromatographiques et leurs domaines de pointe intégrées sont utilisées pour la quantification relative de la lumière: paires lourds peptidiques générés par étiquetage SILAC. Peptide identités et les intensités relatives sont ensuite affectés aux propriétés des protéines correspondantes. Logiciel Persée (version actuelle 1.5.0.15) est ensuite utilisé pour effectuer une évaluation plus approfondie statistiques aval des résultats de traitement de MaxQuant, y compris l'échantillon-à-échantillon comparaisons, PCA et classification hiérarchique.

Utilisation du dispositif expérimental décrit, nous avons identifié et quantifié jusqu'à 8000 protéines d'aussi peu que 30 ug de protéine totaledérivé de tumeurs liquides.

Jusqu'à 2500 protéines à partir d'échantillons solides tumorales peuvent être identifiés et quantifiés dans une approche protéomique fusil de chasse avec un gradient de LC de seulement 2 heures, ce qui permet l'analyse de centaines d'échantillons cliniques dans un temps relativement court.

Figure 1. de workflow expérimentale. Les principales étapes de l'enrichissement cellulaire sous-ensemble, l'isolement des protéines, pic-in de la norme de quantification et l'analyse par spectrométrie de masse sont indiqués pour les tumeurs liquides et solides. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. cellulaire enrichissement strategies. FACS tri et LCM. (A) Des exemples de stratégie de déclenchement représentant gating sur leucémique une population de cellules CD117 teinté acquis par un trieur de cellules. (B) microdissection par capture laser du tissu de tumeur solide. Les coupes de tissus de 5 à 10 um d'épaisseur ont été montées sur des lames de membrane film couverte avant la coloration. Région des intérêts a été sélectionnée manuellement pour microdissection laser. Affichés sont des sections avant microdissection avec la région d'intérêt marquée en jaune et après microdissection. Une barre d'échelle de 50 um est inclus dans le chiffre. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. L'analyse typologique des protéomes des cellules cancéreuses humaines. Unsupervised analyse typologique des prprofils d'expression otein de tumeurs solides et liquides a été réalisée en utilisant la plate-forme de calcul Persée. AC - adénocarcinome, SCC - Le carcinome épidermoïde, CSC-Met - squameuses métastases de carcinome de cellules de cancer de la tête et du cou, R - répétition technique.

Discussion

Spectrométrie de masse profilage des protéomes des cellules cancéreuses provenant de patients est nécessaire pour la découverte de nouveaux biomarqueurs de diagnostic / prédictifs ainsi que de donner une meilleure compréhension de la biologie des cellules cancéreuses, ce qui pourrait à son tour conduire à l'identification de nouvelles cibles potentielles de médicaments. Cependant, ces analyses spectrométrie de masse sont très difficile, notamment en raison de diverses questions pré-analytiques doivent être résolus, si l'on veut obtenir des résultats robustes et biologiquement pertinents.

Le flux de travail expérimental décrit ici permet la caractérisation protéomique quantitative des protéomes sous-populations cellulaires dérivées de tumeurs à la fois liquides et solides. L'enrichissement initial des cellules tumorales, soit par FACS sur la base de cellule de microdissection sortingor est nécessaire pour éviter la contamination par des cellules du micro-environnement de la tumeur. En outre, ces techniques permettent d'isoler les sous-populations cellulaires d'intérêt. Études de cellules biologiques récentes ont démontré que certaines sous-populations cellulaires ont des propriétés initiatrices de tumeurs et sont donc très pertinent pour la pathogenèse du cancer ^19,20. Comme la spectrométrie de masse est devenue plus sensible au cours des dernières années, des analyses quantitatives protéomiques sont réalisables pour les petites quantités de protéines qui peuvent être tirés de quelques milliers de cellules, ce qui permet de se concentrer sur des populations de cellules fonctionnellement pertinents.

Le set-up présenté ici peut être utilisé pour identifier et valider de nouveaux biomarqueurs de diagnostic dans des échantillons FFPE. Par conséquent, il promet à Bea outil utile pour l'amélioration des diagnostics cliniques, à ce jour, il ya encore un manque de biomarqueurs moléculaires en nombre et en qualité suffisante pour de nombreux types de cancer. Des exemples importants de diagnostics différentiels difficiles, pour lesquels biomarqueurs font défaut, sont la discrimination entre cancer du poumon primaire à partir de métastases dans le poumon, le carcinome cholangiocellulaires intrapancréatique et adénocarcinome pancréatique, ainsi que diffèrentciation du neurofibrome bénigne de tumeurs malignes périphériques très nerveux gaine. En outre, nous et d'autres avons montré que l'élucidation quantitative des signatures protéomiques peut être utile dans l'étude de biologie des cellules cancéreuses en général, et pour révéler biomarqueurs prédictifs de la réponse thérapeutique chez les patients cancéreux ^21.

Deux inconvénients actuels de la méthode présentée ici sont l'exigence d'une vaste traitement manuel de l'échantillon et la demande sur le nanoLC-MS / MS temps d'acquisition. Alors que le premier peut être adressée en déplaçant la préparation des échantillons à par exemple, les formats de 96 puits et en utilisant un traitement robotique, ce dernier exigera un changement dans la stratégie d'acquisition de spectrométrie de masse. Une fois que les sous-ensembles de protéines cibles ont été identifiés qui peuvent être associées avec, par exemple, la classification de la tumeur, nous envisageons la conception des procédés de spectrométrie de masse ciblés qui fournissent des lectures quantitatives pour ces sous-ensembles avec un effort de séparation fortement réduite, etdonc avec un temps d'acquisition réduit en conséquence. Si le temps d'acquisition requis requis pourrait être réduit de 24 à 36 h (tumeurs liquides) ou 3 heures (tumeurs solides) pour, par exemple, 1 heure par spectrométrie de masse et un simple séparation unidimensionnelle de peptides, le gain résultant du débit ciblé pourrait être utilisé pour augmenter de manière significative le nombre de répétitions biologiques et techniques examinés, avec des améliorations correspondantes dans la signification des résultats de quantification. Approches de spectrométrie de masse ciblées ont déjà été démontré être un outil approprié pour la vérification de cancer associé protéines biomarqueurs ^{candidats-22,} et ont été développés à un point où ils sont prometteurs pour la validation ou même comme un outil potentiel pour une utilisation clinique de routine ^{23 , 24.}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
660 nm Kit	Thermo scientific	22662
Milieu de culture cellulaire appauvri en arginine et en lysine	Thermo Scientific	88421
Coomassie Brilliant Blue R-250 solution de coloration	Bio Rad	161-0436
Sérum de veau fœtal dialysé (FCS)	PAA	A15-107
Capuchons diffuseurs pour microdissection	MMI	50202
FACS-sorter	BD	FACSAria III
Ionic Detergent Compatibility Réactif	Thermo scientific	22663
Microdissector à capture laser	MMI  ;	coupe cellulaire plus
tampon LDS  ;	Life Technologies	NP0009
Lames à membrane pour microdissection	MMI	50103
Microcon YM-30	Millipore	MRCF0R030
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Mini Gels	Life Technologies	NP0335PK2
Picofrit Self-Pack Columns	New Objective	PF360-75-15-N-5	Colonne de spectrométrie de masse/émetteur
Agent réducteur	Life Technologies	NP0007
Reprosil-Pur LC/MS/MS Colonne phase stationnaire	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 3 µ ; m
Reprosil-Pur LC/MS/MS Précolonne phase stationnaire	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 5 µ ; arginine
marquée au SILAC	Eurisotop	CLM-2265-H-0.1
Lysine marquée au SILAC	Eurisotop	DLM-2640-0.25
Trypsine, NB Qualité de séquençage	Serva	3728301	pour digestions en gel
Trypsine, qualité de séquençage	Promega	V5111	pour digestions en solution
Tampon et solutions
Tampon de lyse cellulaire : 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris/HCl pH 7,8, 5 mM de NaF, 0,5 % de NP40, 0,1 % de laurylmaltoside, inhibiteur complet de la protéase Roche, 1 mM de Na3VO4
Tampon de lyse tissulaire : 100 mM de Tris/HCl pH 7,8, 0,1 M de DTT  ;
Urée : 8 M d’urée dans 0,1 M de Tris-HCl, pH de 8,5			pour le protocole FASP
AIA : 0,05 M d’iodoacétamide, 8 M d’urée, 0,1 M de Tris-HCl, pH de 8,5			pour le protocole FASP
0,05 M de NH4HCO<>3
10 mM de dithiothréitol (DTT) dans 0,1 M de bicarbonate			pour la digestion
en gel55 mM d’iodoacétamide (IAA) dans 0,1 mM de bicarbonate			pour la digestion en gel
. 5 % d’acide formique aqueux.