Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

Résumé

Nous avons développé un nouveau modèle ex vivo pour étudier l'action des hormones dans le sein humain. Il est basé sur les microstructures de tissu isolé à partir d'échantillons de tissus mammaires chirurgicales qui conservent l'architecture des tissus, des interactions intercellulaires, et la signalisation paracrine.

Résumé

L'étude de l'action des hormones dans le sein humain a été entravée par le manque de systèmes de modèles appropriés. Après culture in vitro, les cellules epitheliales mammaires primaires ont tendance à perdre l'expression du récepteur de l'hormone. Largement utilisés lignes cellulaires du cancer du sein positif du récepteur de l'hormone sont d'une pertinence limitée à la situation in vivo. Ici, nous décrivons un modèle ex vivo pour étudier l'action des hormones dans le sein humain. Spécimens humains frais de tissu mammaire à partir de matériaux de défausse chirurgicale tels que plasties mammaires de réduction ou mammectomies sont mécaniquement et digestion enzymatique pour obtenir des fragments de tissus contenant des conduits et des lobules et de multiples types de cellules stromales. Ces microstructures de tissus conservés dans le milieu de base sans facteurs de croissance conservent leurs contacts intercellulaires, l'architecture des tissus, et restent hormone sensible pendant plusieurs jours. Ils sont facilement traitées pour l'ARN et l'extraction des protéines, l'analyse histologique ou stockés dans un milieu de congélation. Fluorescencetri cellulaire activé (FACS) peut être utilisé pour enrichir les populations de cellules spécifiques. Ce protocole fournit une approche simple, standard pour les études translationnelles, avec des spécimens humains variés très complexes.

Introduction

Informations sur le paysage de mutation dans le cancer du sein est en augmentation à un rythme rapide. Moins d'attention a été accordée à des facteurs systémiques qui influent sur le développement du cancer du sein. L'exposition à des hormones de la reproduction a un impact majeur sur la progression de la maladie ^1-3. Pourtant, les mécanismes par lesquels les hormones de la reproduction empiètent sur la poitrine humaine sont mal comprises. Travailler avec des modèles de souris génétiquement modifiées a révélé qu'ils impliquent Signalisation cellulaire intrinsèque et paracrine travers plusieurs effecteurs en aval ^4.

La connaissance limitée de l'action des hormones dans le sein humain est en grande partie attribuable à un manque de modèles adéquats. La plupart des travaux sur les mécanismes de récepteur d'œstrogène (ER) et le récepteur de la progestérone (PR) de signalisation a été effectué avec des lignées cellulaires de récepteur d'hormone positifs du cancer du sein, telles que les cellules MCF-7 et T47D. Ceux-ci ont été dérivées des épanchements pleuraux chez des patients atteints d'un cancer du sein avancé qui avait already reçu de multiples traitements ^5. La pertinence biologique de ces résultats dans les modèles in vitro simples du sein humain est inapproprié et gènes cibles identifiés dans plusieurs modèles in vitro sont diffèrent des gènes cibles qui sont identifiés dans les modèles animaux ^6. Lorsque les cellules epitheliales mammaires humaines primaires sont cultivées in vitro, ils ont tendance à perdre l'expression des récepteurs hormonaux et donc sensible aux récepteurs hormonaux ^7,8. Ce problème peut être circumventd par approches 3D sophistiqués utilisant matrigel. De cette manière, C. Clarke et ses collègues ont réussi à établir les cellules épithéliales mammaires qui ont maintenu l'expression des récepteurs hormonaux et ont montré une réponse proliferative à la stimulation de la progestérone ^9. Cependant, deux important dans les gènes cibles du récepteur de la progestérone in vivo, Wnt-4 et RANKL, ne ont pas été induite par stimulation de la progestérone dans ce système ^9. Cette approche a été récemment prise le plus loin avec in vitro prétraitement de l'hormone et de RANKL induction a été atteint ^10. Une mise en garde reste que matrigel a des activités qui sont indépendamment de la charge, est coûteux, et exige une conception expérimentale qui est apte pour les numéros à petites cellules seulement.

Partant du constat que, dans ER in vivo et la signalisation PR sont en grande partie médiée par des interactions paracrines ^11, nous avons fait valoir que les interactions intercellulaires doivent être maintenus. Un autre facteur important qui est perdue sous forme de tissus sont dissociées aux cellules simples de culture in vitro sont les interactions entre les cellules épithéliales avec la matrice extracellulaire; pourtant ce sont cruciaux pour la différenciation épithéliale et leur rupture est important dans la tumorigenèse ^12. Dans cet esprit, nous avons établi une méthode pour isoler microstructures des tissus du sein du matériau frais de défausse chirurgicale ^13. Le parenchyme mammaire, constituée d'un épithélium en deux couches avec luminale intérieure et extérieure myoepithelicellules d'Al, est disséqué loin de tissu adipeux et soumis à la dissociation mécanique et enzymatique. Après lavage et centrifugation, des fragments de conduits de lait sont obtenus qui conservent interactions étroites avec de nombreuses cellules stromales. Ces microstructures des tissus restent sensibles aux hormones. Le modèle a été validé dans les échantillons cliniques ^13. En tant que telle, la présente procédure peut aider à étudier l'action des hormones dans le sein dans un contexte biologique et clinique.

Protocole

Considérations générales: l'avance, mettre en place un protocole d'éthique, préparer des questionnaires pour les patients, et de voir à la formation du personnel clinique. Avant d'utiliser du matériel de la chirurgie mammoplastie de réduction, de se procurer les autorisations, et d'assurer le consentement du patient. Tissu peut être infectieux et doit être traité en conséquence. Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de l'ISREC - Institut suisse de recherche expérimentale sur le cancer.

1. tissus de récupération, le traitement et Bio-banking

Pour assurer une qualité optimale de l'échantillon pour la bio-banking, un certain nombre de mesures sont effectuées à l'hôpital avant leur transport vers le laboratoire.

À l'hôpital:

1. Obtenir tissus mammaires humains dans des conditions stériles de chirurgie mammoplastie de réduction et des échantillons de sang, si nécessaire. Tissus doit être examiné par un pathologiste qui échantillon à exclure la présence de lésions malignes.
2. Placer la poitrine témettre sous le capot sur une planche stérile et préparer ciseaux, scalpel et pince qui sont déjà stérilisés avec stérilisateur à vapeur. Assurez profonde coupure à différents sites du tissu mammaire à l'aide d'un scalpel pour l'ouvrir. Dans le tissu mammaire humain chercher des brins blancs constitués de conduits et lobules, qui sont intégrés dans le tissu adipeux jaune.
   NOTE: Le rapport de la parenchymateuse blanc du tissu adipeux jaune diffère chez les femmes; généralement les jeunes femmes ont plus de tissus épithéliaux.
3. Choisissez des morceaux de matériau blanc et les tenir avec une pince, puis séparez-les doucement du tissu adipeux avec des ciseaux. Évitez de prendre des vaisseaux sanguins.
4. Rincer les morceaux de tissus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,2 pour éliminer le sang. Transférer le tissu de bouteilles en plastique de 250 ml contenant du milieu F12 (F12 moyen de Eagle modifié par Dulbecco) sans rouge de phénol avec 2% de pénicilline / streptomycine (y compris 5000 unités / ml de pénicilline et 5,000 g / ml de streptomycine) et 1% d'unetibiotic / amphotéricine B (dont 10 000 unités / ml de pénicilline, 10 000 ug / ml de streptomycine et 25 pg / ml d'amphotéricine B). tissus de magasins dans le milieu pour le transport au laboratoire.
5. Préparez des morceaux de 3 - 5 mm de diamètre pour l'ARN et des protéines extraction et flash congeler dans cryotubes de froid (neige carbonique) isopentane. Les transférer à la boîte de glace sèche pour le transport au laboratoire.
6. Mettez des morceaux de 3-5 mm dans le moule et le couvrir avec une couche d'Optimal Cutting Temperature (OCT) et puis placez le moule sur le fond plat de boîte remplie de isopentane froid. Après congélation complète transférer le moule à la boîte de glace sèche.
7. Fixer cinq morceaux de 3 à 5 mm de diamètre dans paraformaldéhyde (PFA) 4% et 5 autres pièces en formaldéhyde (FA) 4% dans du PBS à l'analyse histologique RT plus tard. Deux différents fixateurs sont recommandés comme certains anticorps fonctionnent mieux avec l'une ou l'autre des deux.

Dans le laboratoire:

8. Fairecument toutes les informations sur la réduction mammaire, date de la chirurgie et si les échantillons sont issus de gauche contre le sein droit.
9. Placez les échantillons congelés à -80 ° C et de transférer les tissus fixés dans des cassettes d'histologie après 2 h de fixation. Puis les placer soit dans du PBS ou 70% d'éthanol, pour O / N stockage à 4 ° C. Le lendemain, transférer les cassettes d'histologie à des installations d'histologie pour inclusion dans la paraffine.

2. Digestion tissus et l'hormone de stimulation

1. Transférer les flacons contenant les échantillons de tissu à une hotte à flux laminaire dans une chambre de culture cellulaire P2. Placez les morceaux de tissus sur planche à découper stérile (29 x 19 cm). Maintenez le matériau avec une pince et gratter la graisse restante et les navires loin du parenchyme mammaire (partie blanche) avec un scalpel. Placez la matière blanche dans du PBS dans une boîte de culture de 10 cm.
2. Après avoir enlevé la matière grasse de tous les morceaux et les disposer selon la règle de sécurités du laboratoire, placer les parties blanches contenant les tissus épithéliaux de retour sur la planche à découper. Utilisation scalpels opposées couper le tissu et couper en morceaux d'un diamètre allant jusqu'à 2 mm.
3. Placer la matière hachée dans des tubes de taille adéquate: jusqu'à 1, 2,5 et 10 ml dans un 5, ou 15 tubes de 50 ml, respectivement. Typiquement un tube de 5 ml rendements assez de matériel pour la paraffine enfouissement et de l'hormone stimulations, et un tube de 15 ml rendements assez de matériel pour cellulaire activé par fluorescence (FACS). Grands tubes sont utilisés pour la congélation aliquotes.
4. Préparer la digestion mélange maître constitué de milieu (DMEM / F12 sans rouge de phénol) avec 1% de pénicilline / streptomycine / amphotéricine B et de la collagénase A (Clostridiopeptidase A de Clostridium histolyticum). Dose collagénase selon les temps de digestion.
   1. Pour les 12, 24 et 36 h d'incubation, en utilisant de la collagénase concentration finale de 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml et 0,5 mg / ml, respectivement. Ajouter maître de digestion mélange jusqu'à 4 fois de lavolume de la matière digérée pour assurer une agitation et une aération suffisante.
      REMARQUE: Selon la conception expérimentale et la durée de la stimulation hormonale, ajouter hormones pendant ou après l'étape de digestion enzymatique et la microstructure de récupération.
5. Ajouter hormone (s) à la concentration désirée pour tester les échantillons et le véhicule de contrôle. Pour la stimulation par 17-β-oestradiol, et promégestone (R5020) utiliser une concentration finale de 20 nM.
   REMARQUE: R5020 est un agoniste du récepteur de la progestérone synthétique, qui est plus stable que la progestérone dans du milieu naturel.
   1. Placer les tubes sur le mélangeur à rouleaux à l'intérieur d'un incubateur à 37 ° C et 40 rpm O / N. Avant de placer les échantillons sur le mélangeur, les remettre en suspension très bien pour se assurer que tout le matériel distribue le long des tubes de centrifugation.
6. Comme la digestion prend au moins 12 heures (O / N), pour des temps de stimulation de l'hormone de moins de 12 heures, ajouter les hormones après la récupération des microstructures (dequeue à l'étape 3). Ajouter les hormones que vous remettre en suspension les microstructures et placez la suspension sur des plaques de fixation ultra-faibles. microstructures de tissus peuvent être conservés sur des plaques de fixation ultra-faible pour un maximum de sept jours dans un milieu sans facteur de croissance-conservateurs environ 70% de viabilité.
7. Pour l'ARN et l'analyse des protéines, recueillir des microstructures des tissus par centrifugation à 400 g pendant 5 min et flash gel dans des tubes de centrifugeuses.

3. Récupération de microstructures de tissus

1. Centrifuger le tube (s) à 400 g pendant 5 min. Aspirer la graisse à partir du haut du tube de centrifugeuse et transférer le surnageant du surnageant aqueux restant, qui est enrichi en fibroblastes, dans un nouveau tube de centrifugation et centrifuger à 1250 g pendant 5 min.
   NOTE: Comme les microstructures des tissus du sein sont très collant, pour toutes les étapes ultérieures remettre le culot en agitant doucement le tube. Pipetage ne est pas recommandée en raison du risque de matériel perdre.
2. Remettre en suspension les pastilles enrichies en microstructures et dans les fibroblastes dérivés de surnageant aqueux dans du PBS, 2% de sérum de veau foetal (FCS). Tourner la suite les deux tubes à 1250 g pendant 5 min puis jetez les surnageants.
3. Remettre en suspension les pastilles dans 3-5 ml de tampon de lyse rouge sanguin de cellules et les transférer dans des tubes propres. Incuber les pendant 5 min à température ambiante.
4. Ajouter 2x volume de PBS, 2% de FCS et centrifuger eux à 1 250 g pendant 5 min. Laver les pastilles avec PBS, 2% de FCS et centrifuger à 1250 g pendant 5 min. Répéter deux fois cette étape.

4. Les échantillons de cytométrie en flux

1. Ajouter 1 à 2 ml de trypsine 0,25% au culot et le mélanger par pipetage de haut en bas très doucement pendant 2 min avec un Pipetman 1000 pi de dissocier les cellules.
2. Inhiber l'activité de la trypsine en ajoutant 9 ml de PBS, 2% de FCS. Centrifuger à 450 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot dans 10 ml de PBS, 2% de FCS.
3. Transférer la suspension cellulaire sur un tamis cellulaire de 40 pm placée sur top d'un tube de centrifugeuse de 50 ml pour préparer des cellules individuelles. Si quelques microlitres de suspension cellulaire restent sur le dessus du filtre, les aider à passer à travers le filtre en les aspirant de l'autre côté de la crépine avec une pipette et les ajouter aux microstructures filtrés.
4. Cellules immunitaires distinctes, les fibroblastes et les cellules endothéliales de microstructures avec un cocktail d'anti-CD45, anti-FAP et anti-CD31 anticorps, puis les trier avec FACS, sur la base pan-épithéliale EpCAM marqueur et CD10 pour séparer les cellules de luminales et basales respectivement ¹⁰ .

5. Les échantillons pour l'histologie

1. Après lavage de la matière mécaniquement et digéré par voie enzymatique comme décrit ci-dessus, de fixer des pastilles 1,5 ml matériau de départ dans 1 ml de PFA à 4% dans du PBS à température ambiante pendant 30 min.
2. Centrifuger à 1250 g pendant 5 min et laver avec 1-2 ml de PBS deux fois.
3. Centrifuger à 16 000 g pendant 10 min. Pendant ce temps, préparer une polyvalente% d'agarose dans du Tris-acétate-EDTA (TAE) tampon et chauffer la solution dans le four à micro-ondes jusqu'à ce que la solution commence à bouillir.
   1. Retirer la solution du four à micro-ondes et agiter la fiole délicatement pour mélanger la solution et remettre en suspension des particules d'agarose restants. Refroidir la solution d'agarose à 50 ° C et verser 1 ml dans un moule à base de paraffine de taille 31 x 23 x 13,5 mm.
4. Jeter le surnageant et placer les pastilles au-dessus de la couche solidifiée (1 - 3 mm) d'agarose à l'aide d'une spatule avec une extrémité plate. Tous Couvrir avec une couche supplémentaire d'agarose (40 ° C).
5. Après la solidification agarose, habituellement dans les 5 min, mettre les blocs d'agarose dans les cassettes d'histologie pour la paraffine encastrement. Avec les échantillons d'agarose placer un papier de bureau blanc dans la cassette avec toutes les informations sur le nombre mammoplastie de réduction, condition expérimentale, et la date écrite en petits caractères au crayon; cette écriture résiste à toutes les étapes de traitement ultérieures.
6. Mettez les cassettesPBS O / N, ou 70% d'éthanol pour le stockage sur le week-end, à 4 ° C. Nous ne avons pas remarqué de différence entre les deux solutions de stockage. Puis transfert cassettes d'histologie à des installations d'histologie pour inclusion dans la paraffine.

6. microstructures de congélation (Future culture)

1. Microstructures de tissus remettre en suspension dans un milieu de congélation constitué de FCS avec 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) et congeler des aliquotes de 1 ml dans les tubes cryogéniques. Le nombre de tubes cryogéniques obtenus dépend de la quantité de matière première obtenue à partir de la réduction mammaire.
2. Congeler les cryotubes contenant des microstructures de tissus en utilisant un congélateur à vitesse contrôlée avec le programme suivant: 5 min logement à 4 ° C, diminution de la température de -7 ° C à raison de 6 ° C / min, ce qui diminue la température à -12 ° C avec taux de 6 ° C / min, 10 min logement, ce qui diminue la température à -40 ° C avec un taux de 6 ° C / min, ce qui diminue la température à -80 ° C avectaux de 6 ° C / min. Puis transférer les tubes cryogéniques à -80 ° C congélateur.
3. Le lendemain, transférer les tubes cryogéniques à partir de -80 ° C à réservoir d'azote liquide pour un stockage prolongé.

Résultats

Pour étudier le rôle des oestrogènes et de la progestérone et de mieux comprendre leurs fonctions moléculaires dans le cœur humain, nous collectons des échantillons de tissus du sein humaines fraîches de patients subissant plasties mammaires de réduction (Figure 1) après avoir obtenu leur consentement éclairé. Nous obtenons aussi l'histoire médicale et reproductive des patients, ainsi que d'un échantillon de sang pour déterminer les niveaux de progestérone sériques au moment de la chirurgie. Le ...

Discussion

La culture ex vivo décrit ici fournit des microstructures de tissus mammaires contenant des conduits et des lobules intactes, ainsi que d'autres types de cellules qui se trouvent normalement dans le sein de la femme humaine. Dans le traitement du tissu mammaire humain généralement obtenu à partir de plasties mammaires de réduction, l'élimination de tissu adipeux, la digestion mécanique et enzymatique de la matrice du stroma, et la lyse des globules rouges enrichit de fragments de conduit de lait et des ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Centrifugeuse Microlitre	Heraeus Biofuge Fresco	75005521
Centrifugeuse 5810R	Eppendorf	5810 000.327
Cryobox	Nalgene  ;   ;	5100-0001
Congélateur à débit contrôlé EF600 Grant	Asymptote  ;	EF600
Incubateur CO2	Hera Cell Heraeus	51022391
Mélangeur à rouleaux SRT9D	Sturt	SRT9D
Cassettes d’histologie	Medizintechnik	81-0021-00
Cell Strainer	Falcon	352340
Lame chirurgicale strile  ;	Aesculap	BB536  ;
Scalpel	Aesculap	BB084R
Pince	Aesculap	BD047R
Ciseaux	Aesculap	BC374R
Moule à base de paraffine	SAKURA	4166
Température de Coupe Optimale (OCT) Cryomatrice	Thermoscientifique	6769006
Pénicilline/Streptomycine  ;	Life Technologies	15070-063
Antibiotiques/Antimycosiques	Life Technologies	15240-062
DMEM F/12	Life Technologies	11039-021	Préchauffage (37 ° ; C)
Collagénase	Roche	11 088 793 001	Préchaud (37 ° ; C)
Fetal Bovin Serum	Life Technologies	10270	cellules sériques de veau fœtal
	Sigma	R7757
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Agarose	Invitrogen	16500-500
Formaldéhyde	Sigma	F1635
Paraformaldéhyde	Roth	335
Isopentane	Sigma	M32631
Éthanol	Merck	1009831000
Flacons cryogéniques (5,0 ml)	VWR, International	479-0820
Plat de culture à très faible attachement	Corning, NY 14831	3471

Peut être remplacé par le tampon de lyse sanguine de