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Article de méthode

Synthèse d’indoxyl-glycosides pour la détection des activités de la glycosidase

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DOI :

10.3791/52442

⸱

27 mai 2015

 , 
1Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Hamburg

Dans cet article

Résumé

Les glycosides indoxyles sont des outils bien établis et largement utilisés pour le criblage enzymatique et la surveillance de l’activité enzymatique. En particulier pour les structures de type glucose, les synthèses précédentes se sont avérées difficiles et à faible rendement. Notre nouvelle approche utilise des esters d’acide indoxylique comme intermédiaires précieux pour produire un nombre considérable de glycosides d’indoxyle avec de bons rendements.

Résumé

Les glycosides indoxyles se sont avérés être des outils précieux et polyvalents pour surveiller les activités des glycosidases. Les indoxyles sont libérés par hydrolyse enzymatique et sont rapidement oxydés, par exemple par l’oxygène atmosphérique, en colorants de type indigo. Cette réaction permet un criblage in vivo rapide et facile sans isolement ni purification des enzymes, ainsi que des tests rapides sur plaques de gélose ou en solution (par exemple, criblage bleu-blanc, micro-puits) et est utilisée en biochimie, histochimie, bactériologie et biologie moléculaire. Malheureusement, la synthèse de tels substrats s’est avérée difficile, en raison de diverses réactions secondaires et de la faible réactivité de la fonction hydroxyle de l’indoxyle. En particulier pour les structures de type glucose, de faibles rendements ont été observés. Notre nouvelle approche utilise l’ester d’acide indoxylique comme intermédiaire clé. Des esters d’acide indoxylique avec des profils de substitution variés ont été préparés sur des voies évolutives. Des glycosylations de transfert de phase avec ces accepteurs et des halogénures de glycosyle peracétylés peuvent être effectuées dans des conditions courantes à des rendements élevés. Le clivage de l’ester et la glycosylation modérée par l’argent qui s’ensuit produisent les glycosides indoxyles peracétylés à haut rendement. Enfin, la déprotection est effectuée selon Zemplén.

Introduction

Pendant longtemps, la production d'indigo a constitué un processus économiquement très important. Avant que des synthèses chimiques à grande échelle ne rendent l'indigo accessible à moindre coût, des précurseurs étaient obtenus à partir de sources naturelles depuis l'époque préchrétienne. La culture des plantes productrices d'indigo (indigo naturel) en Europe est devenue peu rentable à partir du 17th siècle, car la quantité de précurseurs de l'indigo présents dans la plante indienne d'indigo (0,2-0,8 %) est environ 30 fois plus élevée. À la fin du XIXe siècle, la synthèse chimique de l'indigo a supplanté la culture traditionnelle1,2.

Les précurseurs de l'indigo présents naturellement dans les plantes comprennent l'indican (1), l'insatan A (2) et l'isatan B (3) (Figure 1). Tous comportent un motif indoxyle lié à un résidu glycosylique. Le clivage de la liaison glycosidique, par exemple par hydrolyse enzymatique, conduit à la libération de l'indoxyle (4). L'indoxyle lui-même est pratiquement incolore, mais peut être rapidement oxydé pour former un colorant indigo (5). Cette réaction sensible a été adaptée en biochimie, en histochimie, en bactériologie et en biologie moléculaire pour le suivi de l'activité enzymatique. Un criblage de l'activité in vivo, sans isolement ni purification des enzymes, ainsi que des tests rapides sur des boîtes de gélose ou en solution (par ex., criblage bleu-blanc, microplaques) sont possibles. Selon le résidu (par ex., esters, glycosides, sulfates) lié à la partie indoxyle, des substrats appropriés pour différentes classes d'enzymes (par ex., estérases, glycosidases, sulfatases) ont été développés3. Dans ce qui suit, l'accent sera mis sur la formation et l'application des glycosides d'indoxyle.

Schéma du processus d'hydrolyse de l'indican montrant les dérivés de l'indole et la formation du colorant indigo.
Figure 1 : Précurseurs naturels de l'indigo et formation du colorant indigo par hydrolyse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Le motif de substitution de la partie indoxyle détermine la couleur et les propriétés physiques du colorant indigo obtenu. Les motifs de substitution les plus courants sont le 5-bromo-4-chloro (abrévié par X ; bleu-vert), le 5-bromo (bleu) et le 5-bromo-6-chloro (magenta), car ils forment les particules de colorant les plus petites, ne forment pas de granules et présentent la moindre diffusion à partir des sites d'hydrolyse. Cette dernière propriété est particulièrement importante pour les expériences in vivo3.

Le premier rapport sur une méthode indigène pour la détection de l'activité estérase a été publié en 1951 par Barrnett et Seligman, qui utilisaient l'acétate et le butyrate d'indoxyle4. Environ une décennie plus tard, le principe indigène a été adapté pour la localisation de la glucosidase chez les mammifères5. Depuis, plusieurs glycosides d'indoxyle ont été développés, bien que leur synthèse se soit révélée difficile. La plupart des synthèses reposent sur l'utilisation d'un indoxyle N-acétylé comme accepteur et du donneur correspondant, un halogénure de glycosyle6-14. La glycosylation est réalisée dans l'acétone en présence d'hydroxyde de sodium. Dans ces conditions, un certain nombre de réactions secondaires se produisent, réduisant considérablement le rendement. Des rendements de glycosylation particulièrement faibles ont été rapportés pour les structures de type glucose (par exemple 15 % pour le (indol-3-yle N-acétyl-5-bromo-4-chloro)-2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-glucopyranoside6 et 26 % pour le (indol-3-yle N-acétyl-5-bromo-4-chloro)-2,3,2',3',4'-penta-O-acétyl-β-ᴅ-xylobioside14 dans un exemple plus récent). Grâce à une nouvelle approche utilisant des esters d'acide indoxylique, un nombre considérable de glycosides d'indoxyle a été préparé avec de bons rendements (par exemple, (indol-3-yle N-acétyl-5-bromo-4-chloro)-2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-glucopyranoside, rendement de 57 %).

Le protocole suivant décrit la synthèse simple de l'ester allylique de l'acide indoxylique (5-bromo-4-chloro) et, à partir de celui-ci, la synthèse d'un glycoside d'indoxyle (X-Gal). Une expérience modèle simple montre la réactivité enzymatique de la β-galactosidase en utilisant X-Gal.

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Protocole

Remarques générales :

Toutes les réactions ont été effectuées à l’aide d’une hotte et d’un équipement de protection individuelle approprié. Tous les réactifs et solvants (p.a. ; teneur en eau pour les solvants secs : MeCN <50 ppm ; et2o <0,01 %; CH2Cl2 <0,003 %; Les THF <0,005 %) ont été achetés auprès de sources commerciales et utilisés tels quels. La TLC a été réalisée sur des plaques de gel de silice Merck 60 F254. Les composés ont été détectés par UV et/ou par traitement à l’EtOH/H2SO4 (9:1) et chauffage ultérieur. La chromatographie sur colonne a été réalisée avec du gel de silice Merck/Fluka 60 (230-400 mesh). Les filtrations ont été effectuées à l’aide d’un entonnoir Büchner et d’une pompe d’aspiration. Les solvants ont été éliminés à l’aide d’un évaporateur rotatif (40 °C, ~200 tr/min). Les produits ont été séchés sous vide poussé (pompe à palettes rotatives). Les réactions nécessitant des solvants secs ont été réalisées sous atmosphère d’argon.

Dans ce qui suit, la synthèse de X-Gal (16) utilisant l’ester allylique de l’acide 5-bromo-4-chloro-indoxylique (12) est décrite. Pour d’autres composés avec des profils de substitution variés ainsi que des esters méthyliques préparés selon cette séquence synthétique, voir réf.17-19.

1. Accepteur : Synthèse de l’ester allylique18 de l’acide 5-bromo-4-chloro-indoxylique (12)

  1. N-acétylation : synthèse de N-(4-bromo-3-chloro-2-méthylphényl)-acétamide (6)
    1. Dissoudre 10,0 g (45,7 mmol) de 4-bromo-3-chloro-2-méthylaniline dans 30 ml de dichlorométhane.
      Prudence! Le dichlorométhane est nocif et refroidit la solution dans un bain de glace.
    2. Ajouter 6,50 ml (68,7 mmol) d’anhydride acétique goutte à goutte et laisser le mélange se réchauffer à température ambiante. Le mélange peut être remué pendant 8 heures ou toute la nuit. Prudence! L’anhydride acétique est corrosif et inflammable.
    3. Retirer le solvant et recristalliser à partir de l’acétate d’éthyle/méthanol 9:1 (rendement : 97 % (11,6 g, 44,2 mmol), solide incolore).
      Prudence! L’acétate d’éthyle est irritant et inflammable. Prudence! Le méthanol est toxique et inflammable.
  2. Oxydation : Synthèse de l’acide N-acétyl-5-bromo-6-chloro-anthranilique (7)
    1. Reflux : mélange de 2,30 g (8,76 mmol) de 6 (produit obtenu à l’étape 1.1) et de 2,10 g (8,52 mmol) de MgSO4•7H2O dans 40 ml d’eau dans une fiole à 3 cols à fond rond équipée d’un refroidisseur et d’un entonnoir compte-gouttes.
    2. Ajouter goutte à goutte 50 ml de solution saturée de KMnO4 dans de l’eau au mélange réactionnel pendant 3 heures. Chauffer ensuite pendant 2 heures supplémentaires sous reflux, env. 135 °C bain d’huile. Prudence! Le permanganate de potassium est nocif et oxydant.
    3. Refroidir à température ambiante et filtrer la pyrolusite (MnO2), qui se forme pendant la réaction.
      Prudence! La pyrolusite est nocive.
    4. Ajouter de l’acide chlorhydrique (37 %) au filtrat jusqu’à pH 1, puis filtrer le produit et le faire sécher sous vide (rendement : 70 % (1,80 g, 6,15 mmol), solide incolore).
      Prudence! L’acide chlorhydrique est corrosif.
  3. Désacétylation : Synthèse de l’acide 5-bromo-6-chloro-anthranilique (8)
    1. Dissoudre 3,90 g (13,3 mmol) de 7 (produit obtenu à partir de l’étape 1.2) dans 70 ml d’une solution aqueuse d’hydroxyde de sodium 1 N et chauffer à environ 100 °C (bain d’huile) pendant 5 h
      Prudence! L’hydroxyde de sodium est corrosif.
    2. Refroidir à température ambiante et ajouter de l’acide chlorhydrique (37 %) jusqu’à pH 1, puis filtrer le produit avec un entonnoir Büchner et le faire sécher sous vide (rendement : 88 % (2,93 g, 11,7 mmol), solide incolore).
  4. Formation d’anhydride : Synthèse de l’anhydride 5-bromo-6-chloro-isatoïque (9)
    1. Mettre en suspension 8,17 g (32,6 mmol) de 8 (produit obtenu à partir de l’étape 1.3) dans 33 ml d’acétonitrile sec
      Prudence! L’acétonitrile est nocif et inflammable.
    2. Agiter à température ambiante et ajouter 5,3 ml et une solution de 3,22 g (10,8 mmol) de triphosgène dans 18,5 ml de dichlorométhane sec goutte à goutte simultanément sur une période de 30 min. Puis chauffé pendant 3 h à 50 °C (bain d’huile). Prudence! La pyridine est nocive et inflammable.
      Prudence! Le triphosgène est toxique et peut libérer du phosgène.
    3. Retirez environ 75 % du solvant et éteignez la réaction en ajoutant 100 ml d’eau distillée et filtrez votre produit. Lavez avec une petite quantité de dichlorométhane froid.
    4. Sécher le produit sous vide, (rendement : 88 % (7,53 g, 27,2 mmol), solide incolore).
  5. N-alkylation : Synthèse de l’anhydride 5-bromo-6-chloro-N-[(méthoxycarbonyl)allyl]-isatoïque (10)
    1. Dissoudre 25 g (90 mmol) de 9 (produit obtenu à l’étape 1.4) dans 250 ml de diméthylformamide anhydre et refroidir avec un bain >
    2. Ajouter 1,15 équivalent d’hydrure de sodium (60 % dans la paraffine) par portions.
      Prudence! L’hydrure de sodium est corrosif et inflammable ; forte réaction avec l’eau/la glace.
    3. Après 30 min d’agitation à 0 °C, laisser chauffer à température ambiante et ajouter 1,2 équivalent de bromoacétate d’allyle goutte à goutte.
    4. Après avoir agité pendant 5 heures, éteignez la réaction en ajoutant 500 ml d’eau distillée et filtrez votre produit.
    5. Laver à l’eau (3 fois, 100 ml) et sécher le produit sous vide, (rendement : 93 % (31,5 g, 84,1 mmol), solide incolore).
  6. Ouverture de l’anhydride : Synthèse de l’ester allylique de l’acide 5-bromo-6-chloro-N-(méthoxycarbonylallyl)-anthranilique (11)
    1. Dissoudre 10 g (27 mmol) de 10 (produit obtenu à partir de l’étape 1.5) dans 100 ml d’alcool allylique.
      Prudence! L’alcool allylique est nocif et dangereux pour l’environnement.
    2. Ajouter 350 mg (8,70 mmol) d’hydrure de sodium (60 % dans la paraffine) par portions.
    3. Après avoir remué pendant 6,5 heures ou toute la nuit, retirez le solvant.
    4. Soumettre le produit brut à la chromatographie sur colonne (colonne 30 x 6 cm ; 240 g de silice) éther de pétrole/acétate d’éthyle 2:1 ; RF = 0,66), (rendement : 80 % (8,30 g, 21,3 mmol), huile jaune).
      Prudence! L’éther de pétrole est inflammable, irritant et dangereux pour l’environnement.
  7. Condensation de Dieckmann : synthèse de l’ester allyle de l’acide 5-bromo-4-chloro-indoxylique (12)
    1. Mélanger 3,0 g (7,7 mmol) de 11 (produit obtenu à l’étape 1.6) et 1,75 g (15,6 mmol) de tert-butoxyde de potassium dans 100 ml d’éther diéthylique sec.
      Prudence! Le tert-butoxyde de potassium est corrosif et inflammable.
      Prudence! L’éther diéthylique est nocif et extrêmement inflammable.
    2. Chauffer le mélange sous reflux (refroidisseur) pendant 2 heures à 40-45 °C.
    3. Retirer environ 75 % du solvant et ajouter de l’acide chlorhydrique dilué (100 ml, 1 M).
      Prudence! Ne pas sécher complètement, une décomposition peut se produire.
    4. Filtrer le produit et le faire sécher sous vide (rendement : 84 % (5,14 g, 15,5 mmol), solide incolore à légèrement vert).

2. Indoxyl-glycoside : synthèse de X-Gal17

  1. Glycosylation par transfert de phase : Synthèse de (ester allylique de l’acide 5-bromo-4-chloro-indox-3-ylique) 2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-galactopyranoside (14)
    1. Mélanger 400 mg (1,21 mmol) d’allylester 12 (produit obtenu à l’étape 1.7), 410 mg (1,21 mmol) d’hydrogénosulfate de tétrabutylammonium et 500 mg (1,21 mmol) de bromure de 2,3,4,6-tétra-O-O-acétyl-α-ᴅ-galactopyranosyle (α-acétobromogalactose) dans 10 ml de dichlorométhane. Prudence! Le sulfate d’hydrogène de tétrabutylammonium est nocif.
    2. Ajouter 10 ml d’une solution aqueuse de carbonate de potassium (1 M).
      Prudence! Le carbonate de potassium est corrosif.
    3. Remuer à température ambiante jusqu’à consommation complète du donneur (CCM : éther de pétrole/acétate d’éthyle).
    4. Séparer la phase organique (entonnoir séparateur), sécher sur Na2SO4 et retirer le solvant.
    5. Soumettre le produit brut à la chromatographie sur colonne (éther de pétrole/acétate d’éthyle 1:1 ; RF = 0,33). (rendement : 86 % (690 mg, 1,04 mmol), solide incolore).
  2. Clivage et décarboxylation des esters : synthèse de (N-acétyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl) 2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-galactopyranoside (15)
    1. Dissoudre 600 mg (0,908 mmol) de 14 (produit obtenu à partir de l’étape 2.1) dans 15 ml de tétrahydrofurane.
      Prudence! Le tétrahydrofurane est nocif et inflammable.
    2. Ajouter 800 μl de morpholine et 105 mg (9,09 μmol) de tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) et remuer toute la nuit à température ambiante.
      Mise en garde ! La morpholine est inflammable et corrosive.
    3. Retirez le solvant.
    4. Ajouter 400 mg (2,40 mmol) d’acétate d’argent, 800 mg (5,79 mmol) de carbonate de potassium et 10 ml d><'anhydride acétique. Prudence! L’acétate d’argent est irritant et dangereux pour l’environnement.
    5. Chauffer à 90-100 °C pendant 20 min.
    6. Après refroidissement à température ambiante, diluer avec du dichlorométhane.
    7. Lavez le mélange deux fois avec de l’eau et une fois avec une solution diluée de NaHCO3 (10 %).
      Prudence! Le bicarbonate de sodium est corrosif.
    8. Sécher la phase organique sur Na2SO4 (filtre) et retirer le solvant.
    9. Soumettre le produit brut à la chromatographie sur colonne (PE/EA 1:1 ; RF = 0,24), (rendement : 88 % (495 mg, 8,00 mmol), solide incolore).
  3. Désacétylation de Zemplén : Synthèse de (5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-β-ᴅ-galactopyranoside (16)
    1. Dissoudre 396 mg (0,436 mmol) 15 (produit obtenu à l’étape 2.2) dans 10 ml de méthanol.
    2. Ajoutez une quantité catalytique de méthanolate de sodium et remuez toute la nuit à température ambiante.
      Prudence! Le méthanolate de sodium est inflammable et corrosif.
    3. Neutraliser avec Amberlite IR-120 H+ (filtre) et concentrate.
      Prudence! L’Amberlite IR-120 H+ est irritant.
    4. Sécher le produit sous vide, (rendement : 87 % (170 mg, 0,416 mmol), solide incolore).

3. Démonstration de l’expérience du modèle : Preuve d’activité de la β-galactosidase utilisant X-Gal

  1. Préparez une solution de 0,5 mM de X-Gal dans un tampon de 500 μl (Tris-HCl 20 mM ; pH 7,4 ; 50 mM de NaCl, 0,1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique ; ou tout autre tampon approprié pour votre enzyme) dans un tube de microcentrifugation (le X-Gal peut être dissous dans quelques μl de diméthylsulfoxyde).
  2. Ajouter 1 μl de β,1-3-galactosidase (EC 3.2.1.23 10 000 U/ml ; ou tout autre β-galactosidase approprié) et agiter (600 rps) à 37 °C.
  3. Suivez la réaction. Le colorant de type indigo se forme après une courte période de temps.

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Résultats

Les toutes premières synthèses de l'indicane et du 5-bromo-indicane ont été publiées par Robertson dès 1927 et 192915,16. En utilisant l'ester méthylique de l'acide indoxylique comme accepteur, la position réactive en 2 a été bloquée, ce qui a permis de supprimer partiellement les réactions secondaires. La glycosylation en présence d'acétone et d'hydroxyde de sodium, suivie d'une déprotection et d'une décarboxylation (160 °C, anhydride acétique, 1 h), puis d'une déacétylation finale, a conduit à l'obtention de...

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Discussion

En raison de faibles rendements et de limitations, en particulier pour les structures de type glucose et les saccharides plus complexes, une nouvelle approche synthétique des glycosides d’indoxyle a été développée. Les esters d’acide indoxylique se sont avérés être des intermédiaires clés précieux et ont été obtenus dans une voie modulaire et évolutive. Toutes les étapes sont à haut rendement et, grâce à des matériaux de départ bon marché et à un travail facile, des synthèses de plusieurs grammes sont possibles. L’avanta...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Le soutien de ce travail par Glycom A/S, Copenhague, Danemark, est vivement remercié.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anhydride acétiqueGrü ; ssing10298Corrosif, inflammable
AcétonitrileSigma-Aldrich608-001-00-3Nocif, inflammable
Alcool allyliqueAldrich453021Nocif, dangereux pour l’environnement
Amberlite IR-120 H+Fluka06428
Irritant Acide bromoacétiqueMerck802260Corrosif, toxique, dangereux pour l’environnement
4-Bromo-3-chloro-2-méthylanilineABCRAB 171687
DichlorométhaneACROS326850010
Éther diéthyliqueGrü ; ssing10274nocif, extrêmement inflammable
ACROS348430010nocif, inflammable
Sigma-Aldrich41648
Acétate d’éthyleSigma-Aldrich607-022-00-5Irritant, inflammable
Acide éthylènediaminetétraacétiqueAppliChemA1103.0500Irritant
&bêta ; 1,3-galactosidase recombinante E. coliCalbiochem345795
Acide chlorhydriqueVWR20252.290Corrosif
Sulfate de magnésium hydratéMerck105885
MéthanolACROS326950010Toxique, inflammable
MorpholineJanssen Chimica15.868.57Corrosif, inflammable
Éther de pétroleAzelis111053Inflammable, irritant, dangereux pour l’environnement
Carbonate de potassiumGrü ; ssing12005
Permanganate de potassiumGrü ; ssing12056Nocif, oxydant
Tert-butoxyde de potassiumMerck804918Corrosif, inflammable
PyridineSigma-Aldrich613-002-00-7Nocif, inflammable
Acétate d’argentFluka85140Irritant, dangereux pour l’environnement
Bicarbonate de sodiumGrü ; ssing12144Corrosif
Hydrure de sodiumMerck814552Corrosif, inflammable
Hydroxyde de sodiumRiedel-de Hä ; frS181200corrosif
Merck806538corrosif et inflammable
Grü ; ssing12175
Sulfate d’hydrogénium de tétrabutylammoniumLancaster5438
TétrahydrofuraneSigma-Aldrich87371Nocif et inflammable
Tetrakis (triphénylphosphine)palladium(0)Sigma-Aldrich216666
TriphosgeneFluka15217Tris
(hydroxyméthyl)aminométhane toxique chlorhydrateSigmaT-3253Irritant
irritant nocif Diméthylformamide Diméthylsulfoxyde corrosif Méthanolate de sodium Sulfate de sodium nocif

Références

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