Transposon Mediated intégration du plasmide ADN dans le zone sous-ventriculaire de souris néonatale pour générer des modèles nouveaux de glioblastome

Résumé

Nous décrivons ici un protocole efficace et polyvalent pour induire, surveiller et analyser de nouveaux glioblastomes (GBM) à l’aide d’ADN transposon injecté dans les ventricules de souris néonatales. Les cellules de la zone sous-ventriculaire, qui absorbent le plasmide, se transforment, prolifèrent et génèrent des tumeurs présentant des caractéristiques histopathologiques du GBM humain.

Résumé

Il existe un besoin urgent de tester la contribution de nouveaux gènes à la pathogenèse et à la progression des glioblastomes humains (GBM), la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente chez les adultes au pronostic sombre. De nouvelles thérapies potentielles émergent rapidement du laboratoire et nécessitent des tests systématiques dans des modèles expérimentaux qui reproduisent fidèlement les caractéristiques saillantes de la maladie humaine. Nous décrivons ici en détail une méthode permettant d’induire de nouveaux modèles de GBM avec l’intégration de l’ADN plasmidique médiée par transposon dans les cellules de la zone sous-ventriculaire de souris néonatales. Nous présentons un moyen simple de cloner de nouveaux transposons susceptibles d’intégration génomique à l’aide du système de transposons de la Belle au bois dormant et illustrons comment surveiller l’absorption des plasmides et la progression de la maladie en utilisant la bioluminescence, l’histologie et l’immuno-histochimie. Nous décrivons également une méthode pour créer de nouvelles lignées cellulaires primaires de GBM. Idéalement, ce rapport permettra une diffusion plus poussée du système de transposon de la Belle au bois dormant parmi les chercheurs sur les tumeurs cérébrales, conduisant à une compréhension approfondie de la pathogenèse et de la progression du GBM et à la conception et à la mise à l’essai en temps opportun de thérapies efficaces pour les patients.

Introduction

Le glioblastome multiforme (GBM) est la plus fréquente (60%) tumeur primaire du cerveau chez les adultes, avec une médiane de survie de 15 à 21 mois lorsqu'ils sont traités avec la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie ^1. De nouvelles thérapies pour GBM sont impératives. Thérapies expérimentales exigent des tests dans des modèles animaux qui reproduisent de manière adéquate les principales caractéristiques de la maladie humaine. Les stratégies visant à induire GBM chez les rongeurs comprennent la mutagenèse chimique avec des agents alkylants, des altérations génétiques de lignée germinale ou somatique, ou une transplantation utilisant des lignées cellulaires de gliome ^2. Les modèles les plus couramment utilisées emploient l'implantation de lignées cellulaires de gliome, soit orthotopique, dans le cerveau ou sous-cutanée en utilisant des cellules syngéniques chez les animaux de génotype identique; ou xénogéniques, lignes le plus souvent de cellules humaines de glioblastome, implantées dans des souris immunodéficientes ^3. Xénogreffes offrent de nombreux avantages pour l'étude des tumeurs intracrâniennes: commodité de reproductibilité, Standataux de croissance rdized, moment de la mort et de la tumeur localisation. Cependant, ces modèles ont des limites en raison de l'approche chirurgicale artificielle, invasive utilisée pour implantations et une capacité limitée de reproduire fidèlement histologique caractéristiques de GBM humaine (OMS note IV): pseudo-pallisading nécrose, atypies nucléaires, l'invasion diffuse, micro-vasculaire prolifération et la formation d'anomalies vasculaires glomeruloid ^4-7. L'induction de la GBM en modifiant le génome des cellules somatiques avec de l'ADN oncogene, soit avec des vecteurs viraux ^8-12, ou avec l'intégration d'un transposon à médiation ^13, reproduit plus étroitement l'étiologie de la maladie humaine et récapitule les caractéristiques histopathologiques de glioblastome humain.

Historiquement, les tumeurs du système nerveux central ont été classés sur la base de la cellule perçue d'origine, où il a été observé, serait un facteur prédictif de la survie ^14. GBM sont classés en primaire et secondaire. Nouvelles preuves today des points de la nature très hétérogène de glioblastome primaire ^15. GBM secondaire (15%), le résultat de la transformation maligne des astrocytomes de bas grade (OMS grade I) et l'astrocytome anaplasique (OMS grade II), sont associés à l'apparition précoce de la maladie, un meilleur pronostic et un motif "proneural" de l'expression génique , alors que GBM primaire (85%) montrent un début tardif, mauvais pronostic et gliale (classique), de neurones ou de profils d'expression mésenchymateuses. Que ces modes d'expression du gène en corrélation avec la cellule d'origine réel de la tumeur est encore étudié activement. Accumuler des données montre que la combinaison de mutations génétiques associées à GBM sont prédictifs de survie. Par exemple, la perte d'hétérozygotie (LOH) des chromosomes 1p / 19q, mutations IDH1, PDGFRa amplifications, sont associés à GBM secondaires, profil d'expression proneural et meilleur pronostic, alors que la surexpression de l'EGFR, Notch et Sonic activation de la voie de hérisson, Nf1 et la perte de PTEN et les mutations de p53 sont corrélées avec neuronal, classique ou GBM primaire mésenchymateuses et pire pronostic ^16,17. L'avènement de grands projets de séquençage à grande échelle et l'accumulation de nombreux échantillons de patients disponibles pour les tests apporte une richesse de nouvelles informations par rapport à des mutations génétiques et des voies impliquées dans le GBM pathogenèse et la progression et la possibilité de la médecine individualisée, où les thérapies peuvent être spécifiquement adaptés aux les anomalies génétiques du patient. En fin de compte, pour évaluer la valeur prédictive de ces mutations et les voies d'une manière systématique, et de tester les traitements possibles dans chaque cas, nécessite des modèles animaux de GBM à des altérations génétiques pré-déterminée. Transposon intégration médiation de l'ADN génomique offre une approche possible.

The Sleeping Beauty système de transposon, membre de la Tc1 / mariner classe de transposons, a été "réveillée" (construit) dans une procé multi-étapess de mutagenèse dirigée d'un gène de transposase salmonidés, qui est devenu il ya plus de dormance de 10.000.000 années ^18,19. En substance, transposons ADN flanqués par des séquences spécifiques (répétitions inversées / répétitions directes: IR / DR) peuvent être intégrés dans le génome d'une manière "couper et coller" au moyen de l'activité de la transposase Sleeping Beauty. La transposase reconnaît les extrémités des sites de IR, excise le transposon et l'intègre au hasard dans un autre site de l'ADN entre les bases T et A, des bases qui sont dupliquées à chaque extrémité du transposon au cours de transposition (figure 1a). La transposase Sleeping Beauty est composée de trois domaines, un domaine de liaison d'un transposon, une séquence de localisation nucléaire et un domaine catalytique. Quatre molécules de transposase sont nécessaires pour amener les deux extrémités du transposon ensemble et permettre la transposition, cependant, si un trop grand nombre de molécules de transposase sont présents, ils peuvent se dimériser et d'inhiber tetramerizela réaction de transposition ^20. Une réaction de transposition efficace nécessite un rapport optimal de transposase de transposons. L'ADN codant pour la transposase peut être expédié sur le même plasmide avec le transposon (en cis) ou sur un autre plasmide (en trans). Pour assurer le rapport optimal entre la transposase et les transposons, un promoteur ayant une activité adéquate peut être choisie pour l'expression de la transposase (pour le modèle «cis») ou le rapport des plasmides dans la solution d'injection peuvent être optimisés (par la modèle «trans»). Le système de Sleeping Beauty transposon peut être utilisé avec succès pour la génomique fonctionnelle, la mutagenèse par insertion, la transgenèse et la thérapie génique somatique ^21. Être une construction synthétique repensé à une molécule fonctionnelle d'une variante de salmonidés en sommeil, la transposase Sleeping Beauty ne se lie pas à d'autres transposons chez l'homme ou d'autres mammifères ^20. Depuis sa découverte, l'ingénierie moléculaire a enhanced efficacité de la transposition du système de transposon SB par des changements dans les séquences d'IR et plus de dinucléotides TATA flanquant le transposon, d'où les transposons pT2. Ces transposons ont optimisé la liaison de la SB le site IR et une efficacité accrue de l'excision. La transposase SB a également subi une amélioration significative; la transposase utilisé dans les expériences présentées ici est le SB100X, une transposase hyperactive générée par une stratégie de réarrangement d'ADN suivie par un criblage génétique à grande échelle dans des cellules de mammifères ^22.

Dans ce rapport, nous présentons une méthode rapide, polyvalent et reproductible pour induire GBM intrinsèque chez la souris avec des non-virale, l'intégration du transposon médiation de l'ADN plasmidique dans des cellules de la zone sous-ventriculaire de souris néonatale ^23. Nous présentons une façon simple de créer transposons avec de nouveaux gènes qui se prêtent à l'intégration génomique en utilisant la transposase Sleeping Beauty et démontrer comment surveiller plasmide absorption etla progression de la maladie en utilisant la bioluminescence. Nous caractérisons également histologiques et immuno-histochimie caractéristiques de la GBM reproduit avec ce modèle. En outre, nous présentons une méthode rapide pour générer des lignées de cellules primaires GBM de ces tumeurs. Le modèle Sleeping Beauty, dans lequel les tumeurs sont induites à partir de cellules d'origine à l'animal, permet l'évaluation fonctionnelle du rôle des gènes candidats GBM dans l'induction et la progression des tumeurs. Ce système est également bien adapté pour les essais de nouveaux traitements GBM, y compris les thérapies immunitaires chez des souris immuno-compétentes, sans la nécessité d'interventions chirurgicales invasives inflammatoires, qui peuvent modifier le microenvironnement local.

Protocole

REMARQUE: Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par l'Université de Michigan Comité pour l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA).

1. Clonage de la séquence d'intérêt dans de nouveaux couchage transposons Beauté

REMARQUE: Pour insérer des gènes ou des éléments inhibiteurs (comme shRNA) en utilisant le système de transposase Sleeping Beauty, cloner la séquence d'intérêt dans le squelette d'un pKT ou pT2 plasmide. Diriger le clonage de telle sorte que les éléments de régulation, gène d'intérêt et des marqueurs restent flanqués par les séquences répétées inverses (IR / DR). Un exemple de clonage PDGFβ dans un squelette de pKT est détaillé ci-dessous (voir aussi la figure 1b).

1. Digest 5 pg de vecteur plasmidique pKT-IRES-Katushka pendant 4 heures à 37 ° C avec 5 à 10 unités de Xbal / Xhol enzymes de restriction dans 50 ul de volume réactionnel.
2. Digérer l'ADNc mPDGFβ de 5 pg du plasmide pGEM-T mPDGFβ pendant 4 heures à 37 ° C avec 5-10 unités de Ncol / Sacl enzymes de restriction.
3. Précipiter l'ADN total en ajoutant 2,5 volumes d'éthanol à 100% et 1/10 de volume de 3M acétate de Na, pH 5,8 et on incube pendant une nuit à -20 ° C.
4. Centrifuger les échantillons à 13 800 xg pendant 15 min.
5. Laver le culot d'ADN avec 500 pi d'éthanol à 70%, centrifuger à 13 800 g pendant 1 min, répéter une fois et remettre en suspension dans 19 pi d'eau libre de DNase stérile.
6. Suivez les instructions du fabricant dans le Blunting Kit rapide pour émousser les extrémités de deux vecteur (PKT-IRES-Katushka) et insérez (mPDGFβ).
7. Chargez le vecteur émoussé et insérer sur un bromure d'éthidium gel d'agarose coloré de 1,2% et de fonctionner à 80 V pendant 40 min. Visualiser les bandes, les exciser avec une lame de rasoir propre et purifier l'ADN du gel en utilisant un kit de purification de gel selon le protocole du fabricant.
8. Ligaturer l'ADN insert et le vecteur purifié dans l'étape 1.7 en les ajoutant dans un tube à un ratio de 4: 1 molaire (insert: vecteur). Dans ce tube, pipette 1 pl de ligase T4 et 2 pi de tampon de ligase T4 (contenant de l'ATP), et ajuster le volume à 20 pi avec de l'eau stérile. Incuber la réaction de ligature pendant 18 heures à 16 ° C.
9. Transformer des cellules bactériennes compétentes DH5a chimiquement avec les produits ligaturés.
   1. Décongeler les cellules compétentes sur la glace.
   2. Ajouter la totalité du volume de la réaction de ligature à 50 pi de cellules compétentes, secouer doucement le tube et incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique pour les bactéries 45 sec à 42 ° C et de retourner immédiatement à la glace; incuber sur de la glace pendant 2 min.
   3. Ajouter 950 pi de bouillon de Luria à la culture et incuber sous agitation à 37 ° C pendant 1 heure. bactéries de centrifugeuses à 2400 g pendant 3 min et remettre en suspension le culot dans 200 pi de LB.
   4. Répartir les bactéries transformées sur une boîte de Petri revêtue de LB-agarose et l'antibiotique correspondant. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C.
   5. Enfin, la collecte 5-10 bactecolonies Rial et culture de la nuit à 37 ° C dans 5 ml de milieu LB avec antibiotiques.
   6. On purifie l'ADN plasmidique en utilisant un kit de mini-plasmide d'ADN selon les instructions du fabricant. Effectuer une restriction de diagnostic digérer pour vérifier la bonne intégration de l'insert dans le vecteur et soumettre clones positifs pour le séquençage de l'ADN afin d'assurer la bonne orientation de l'insert.
10. Sélectionnez les colonies correctes et intensifier la production d'ADN en utilisant une haute qualité, endotoxine libre kit de préparation de plasmide.
11. Eluer l'ADN dans de l'eau stérile ou 1 mM de Tris-HCl. ADN Conserver à -20 ° C jusqu'au moment de injecter dans les nouveau-nés.

2. intra-ventriculaires néonatales Injections

1. Trois à quatre semaines avant d'expérimenter, mettre en place un élevage cage de souris avec un mâle et une souris femelle, et un igloo de plastique coloré. Ceci fournit un environnement enrichi et facilite le processus d'accouplement.
2. Lorsque la grossesse est confirmée, retirez le male à une nouvelle cage. Dix-huit jours après l'accouplement, surveiller cage tous les jours pour la livraison. Effectuer injections intraventriculaire jours après la naissance 1 (P1).
3. Préparation de la solution d'injection
   REMARQUE: La solution d'injection est préparée en mélangeant l'ADN plasmidique avec le réactif de transfection pour créer des particules pour la transfection. Voici un exemple sur la préparation d'une solution d'injection à l'aide d'un plasmide codant pour la transposase Sleeping Beauty et la luciférase: pT2 / SB100x-Luc et deux plasmides de transposons: PT / CAGGS-NRASV12 et Pt / CMV-SV40-LGT, dans un rapport de 1: 2: 2. Tous les plasmides ont une concentration de 2 ug / ul. Des détails importants sur la préparation de la solution d'injection sont présentées dans l'analyse.
   1. Préparer la solution d'ADN en ajoutant: 4 ug (2 pi) de pT2 / SB100x-Luc, 8 pg (4 pi) de Pt / CAGGS-NRASV12 et 8 pg (4 pi) du Pt / CMV-SV40-LGT et 10 pi de glucose à 10% à un volume final de 20 ul à une concentration de 1 ug / mlADN et 5% de glucose.
   2. Préparer la solution par addition de PEI 2,8 ul de jet PEI in vivo, 7,2 ul d'eau stérile et 10 ul de 10% de glucose à une concentration finale de 5% de glucose.
   3. Ajouter la solution de PEI à la solution d'ADN, mélanger et vortex et laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 20 min. La solution est maintenant prête pour l'injection. Après une heure à température ambiante, maintenir la solution sur de la glace.
   4. Monter une seringue propre de 10 pi équipé d'une aiguille hypodermique de calibre 30 avec 12,5 ° biseau dans la micropompe (Figure 2 # 1).
4. Pour vérifier le bon fonctionnement du système d'injection, utiliser l'injecteur automatique (Figure 2 # 1) de retirer 10 ul d'eau dans la seringue, puis vider la seringue complètement
5. Refroidir le stade néonatal stéréotaxique (Figure 2 # 3) avec une suspension de neige carbonique et d'alcool à une température de 2-8 ° C.
6. Induire une anesthésie en plaçant les petits sur la glace mouilléependant 2 min. Anesthésie continuera sur le cadre stéréotaxique réfrigérés pour le reste de la procédure. Le maintien de la température du cadre-dessus de zéro, entre 2-8 ° C permettra d'éviter les brûlures thermiques. Comme chiots de précaution spéciale peuvent être enveloppés dans de la gaze avant de placer sur de la glace.
7. Remplir la seringue avec la solution ADN / PEI.
8. Immobiliser le chiot dans le cadre stéréotaxique en plaçant sa tête entre les barreaux de l'oreille de gaze couvert (Figure 2b). Se assurer que la face dorsale du crâne est horizontal, parallèle à la surface du cadre et que les sutures crâniennes sont clairement visibles. Essuyez la tête avec 70% d'éthanol.
9. Abaissez l'aiguille de la seringue et ajuster coordonnées stéréotaxiques utilisant cadrans du cadre stéréotaxique ce que l'aiguille touche le lambda (l'intersection de la ligne médiane du pariétal et occipital) (Figure 2b).
10. Soulevez l'aiguille et ajuster coordonnées stéréotaxiques à 0,8 mm latéral et 1,5 mm rostral au lambda (figure 2b).
11. Abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche et fossettes légèrement la peau. Mesurer les coordonnées. Abaissez l'aiguille encore 1,5 mm. L'aiguille risque de transpercer la peau et le crâne, et passer à travers le cortex pour entrer dans le ventricule latéral (figure 2c).
12. Utilisation de l'injecteur automatique, injecter 0,75 ul de la solution d'ADN / PEI à un débit de 0,5 ul / min
13. Gardez le chiot sur le cadre pour une autre minute pour permettre la solution de se disperser dans les ventricules. Dans l'intervalle, anesthésier un autre chiot, sur de la glace pendant 2 minutes pour préparer l'injection suivante.
14. Doucement et lentement soulever l'aiguille, et placez le chiot sous une lampe chauffante. Surveiller la respiration et de l'activité. Si nécessaire, fournir une stimulation douce des membres jusqu'à la première respiration se ensuit.
15. Retour le chiot à sa mère après qu'il se est réchauffé, a atteint une couleur rose, respire régulièrement et est actif, normalement 5-7 min. Si more d'un chiot est injecté à la fois, garder tous les chiots ensemble jusqu'à ce que toutes les injections sont faites. Si injections prennent plus de temps de 30 min, retourner la moitié des petits après les 30 premières minutes et le reste à la fin de la procédure.
16. Surveiller que le barrage est sensible et stimulant à ses chiots. Si nécessaire, ajouter une maman de substitution à la cage.
17. Assurez-vous que l'intervalle entre plaçant le chiot sur la glace et en la plaçant sous la lampe chauffante est inférieure à 10 min. Le plus rapide la procédure meilleure est la survie. Habituellement, le temps nécessaire pour anesthésier et injecter un chiot est de 4 min.

3. La bioluminescence le suivi des tumeurs formation et la progression

3.1) Surveillance plasmide Absorption Après injection

1. 24-72 h après l'injection, retirez tous les chiots de la cage et la place de la mère dans un six puits propre boîte de culture de tissu, un seul petit par puits.
2. Préparer une solution à 30 mg / ml de luciférine dissous dans une solution saline normale ou phosphate tampon. Préparer cette solution à l'avance et de garder en petites aliquotes à -20 ° C.
3. En utilisant une seringue de 1 ml munie d'une aiguille hypodermique de calibre 30 injecter 30 pl de luciférine voie sous-cutanée entre les omoplates du chiot. Assurez-vous que l'aiguille ne perce pas tous les organes, en pinçant la peau et en le soulevant légèrement avant d'insérer l'aiguille.
4. Photo immédiatement, en utilisant un système d'imagerie in vivo de bioluminescence dans. Pour le spectre IVIS, utilisez les paramètres suivants pour les acquisitions: exposition automatique, binning grande, et l'ouverture f = 1.

3.2) Formation surveillance et la progression tumorale

REMARQUE: Les animaux commencent à se former des tumeurs macroscopiques détectables par bioluminescence et l'histologie dans les 2½-six semaines, selon les plasmides oncogènes injectés.

1. En utilisant une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de calibre 26 injecter 100 ul d'une / ml solution de 30 mg de luciférine intra-péritonéale.
2. Placer l'animal dans la chambre d'anesthésie. Injecter un maximum de cinq animaux en même temps.
3. Attendre 5 min, puis démarrer le flux d'oxygène / isoflurane (1.5 à 2.5% d'isoflurane) pour anesthésier les animaux. Après 3-4 min, retirer les animaux de la chambre de l'anesthésie, démarrer le flux d'oxygène / isoflurane dans la chambre de bioluminescence. Placez les animaux dans les fentes respectives équipées de cônes de nez du verre pour permettre un passage non obstrué anesthésie et de la lumière.
4. Typiquement, l'acquisition d'une série de 6 images, à intervalles de 2 min avec un temps d'exposition automatique, binning médiane et une ouverture ouverte de f = 1.
5. Définir la région d'intérêt pour tous les animaux imagées, typiquement un ovale sur la région de la tête, et de mesurer l'intensité de luminescence en utilisant les unités photons calibrés / s / cm ² / sr.
6. Notez la valeur maximale pour chaque animal. Par la suite, les enregistrements peuvent être comparées au cours de la progression de la tumeur pour chaque animal et / ou entre les animaux, par exemple WHEn différents traitements sont employés.

4. histologique et immunohistochimique Analyse de la Nouvelle-GBM

REMARQUE: Lorsque les tumeurs ont atteint le expérimentale point de temps désiré, les animaux peuvent être sacrifiés, perfusés cerveaux, fixes et analysées. Pour les analyses de survie au stade moribond représente le critère de l'expérience, lorsque les animaux sont sacrifiés humainement dès les premiers signes de la charge tumorale, tel que défini par le stade clinique lorsque l'animal devient symptomatique démontrant une mobilité réduite, une posture voûtée et la fourrure miteuse. Une brève description des méthodes histologiques et immunohistochimiques standard utilisés est présenté ci-dessous.

4.1) Fixation de perfusion et

1. Anesthésier la souris par une injection intra-péritonéale de 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine.
2. Vérifier le réflexe de pédale en pinçant le pied de la souris. Lorsque ce réflexe est aboli, indiquant anesthésie profonde, immobilize la souris sur une planche de dissection avec des épingles, ouvrir la cavité abdominale, disséquer le diaphragme et ouvrir la cavité thoracique de visualiser le coeur.
3. Insérez une canule de calibre 20 émoussée dans le ventricule gauche du cœur. Connectez la canule avec des tubes en plastique en passant par une pompe péristaltique dans un récipient avec une solution oxygénée et héparine de Tyrode (NaCl à 0,8%, 0,0264% _CaCl2 2H ₂ O, 0,005% de NaH ₂ PO _4, 0,1% de glucose, 0,1% NaHCO _3, 0,02 % KCl). Démarrer l'écoulement de la solution de Tyrode en ajustant la vitesse de la pompe péristaltique afin d'assurer un écoulement lent et constant, à environ une goutte par seconde ou moins si les animaux sont plus petites.
4. Faire une petite incision dans l'oreillette droite du cœur pour permettre la fuite de sang et de Tyrode.
5. Surveiller l'efficacité de perfusion par l'observation de blanchiment d'organes internes (plus évidents dans le foie et les reins) dès qu'ils sont dépourvus de sang.
6. Lorsque lesolution vidange du cœur est clair (3-5 min), passer les solutions de Tyrode à 4% de paraformaldéhyde pour la fixation (4% PFA, pH 7,34 en tampon phosphate salin).
7. Contrôler la bonne fixation des tissus par la rigidité accrue du cou et de la queue.
8. Décapiter la souris et disséquer soigneusement le cerveau du crâne.
   1. Tirez la fourrure qui couvre le crâne rostralement, vers le nez, et de saisir fermement à stabiliser la tête, dorsale vers le haut.
   2. Avec un scalpel aiguisé, couper vers le bas le long du bord de l'orbite, à sectionner les muscles orbitaux et les arcades zygomatiques sous-jacents.
   3. Tourner la tête face ventrale et enlever les muscles du cou attaché à l'aide d'un rongeur. Écraser la première vertèbre et le retirer de le tronc cérébral.
   4. Visualisez la cochlée, saisir l'os temporal recouvrant avec le rongeur et de créer une ouverture entre l'os temporal et occipital. Décoller l'os occipital de la surface du cervelet.
   5. Crush l'os recouvrant le nez avec le rongeur. Retirez délicatement le reste frontal et pariétal os de la surface du cerveau en étant conscient de ne pas endommager la surface du cerveau. Portez une attention particulière dans la zone orbitale.
   6. Tournez la tête ventrale vers le haut. Le cerveau va glisser vers le bas du reste du crâne, connecté maintenant uniquement par les nerfs crâniens. Utilisation de petits ciseaux coupent le olfactif, optique et nerfs trijumeau. Cela libérera le cerveau.
9. Placez cerveau dans 4% PFA nuit à 4 ° C pour la post-fixation.
10. Pour l'analyse histologique et hématoxyline-éosine, transférer les cerveaux de tampon phosphate pendant 24 heures, puis procéder à l'inclusion en paraffine.
11. Pour l'analyse immuno-histologique, transférer cerveau dans une solution de saccharose à 30% dans une solution saline tamponnée au phosphate pour 24 à 48 h (jusqu'à ce que le cerveau se déposent au fond du tube)
12. Section cerveaux moitié par le milieu de la région de la tumeur, placent la coupevers le bas dans un moule de congélation, intégrer dans les milieux de cryo-enrobage (OCT composé), et le flash-gel dans une suspension d'éthanol de glace sèche, isopentane glace sèche ou dans l'azote liquide. Gardez blocs congelés à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe et la coloration.

4.2) Brains d'analyse de intrinsèque GBM Histo-pathologique hématoxyline-éosine de inclus en paraffine

1. Section inclus en paraffine cerveaux à 4 um d'épaisseur, déposer dans un bain-marie à 42 ° et le monter sur des lames de verre.
2. De paraffinize-lames en les plaçant pendant 10 min dans un four à 60 ° C, puis de les transférer à intervalles de 5 min à travers une série de trois récipients remplis de diapositives avec du xylene.
3. Hydrater les diapositives à travers une série de bains d'éthanol: l'éthanol 100% pendant 2 min, répéter une fois, 95% d'éthanol pendant 2 min, répéter une fois, 70% d'éthanol pendant 2 min puis transférer diapositives à l'eau.
4. Colorer les lames en les trempant dans un récipient rempli de glissement avec l'hématoxyline de Harris pendant 2 min.
5. Rincer à l'eau du robinet jusqu'à l'eau est claire.
6. Tremper les lames deux fois dans une solution de bleuissement (0,1% de bicarbonate de sodium).
7. Laissez diapositives sont dans l'eau du robinet pendant 2 min, puis transfert à l'éthanol à 80% pendant 2 min.
8. Colorer les lames en les trempant dans un récipient rempli d'éosine pendant 5 min.
9. Déshydrater diapositives dans une série de bains d'éthanol (80% d'éthanol 3-4 trempettes, 95% d'éthanol 2 min, répéter une fois, 100% d'éthanol 2 min, répéter une fois).
10. Effacer avec 3 salles de bains consécutifs de xylène, 3 min chacun.
11. Lamelle avec un milieu de montage à base de xylène et laisser sécher sur une surface plane à la température ambiante avant d'être prêt pour l'imagerie. Entreposer à la température ambiante.

4.3) Immuno-histochimie de Brains embarqués Cryo-préservés pour la caractérisation moléculaire et cellulaire de De Novo induite GBM

1. Récupérer blocs congelés de la C de stockage -80 °, placer dans cryostat et permettent des températures se équilibrer pendant 30 min.
2. Section 12-14 Um sections épaisses et montage 2-3 sections sur des lames de verre chargées positivement. Couper des sections en série, en recueillant des sections adjacentes sur différentes diapositives. Cela permet à la coloration avec des anticorps différents sur des coupes de tissus adjacents à l'intérieur de la tumeur.
3. Diapositives sécher dans un dessiccateur pendant au moins 1 heure après la coupe pour permettre une bonne adhérence du tissu.
4. Créer une barrière hydrophobe (avec un marqueur hydrophobe) à chaque extrémité de la lame pour permettre de liquide pour recouvrir les sections et de rester sur la diapositive pendant les lavages. Couvrir les sections avec une solution de saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de Triton-X (PBS 0,1% Tx) et agiter doucement pendant 5 min sur un agitateur horizontal pour perméabiliser le tissu. Répéter deux fois.
5. Bloquer la liaison non spécifique avec une solution de 10% de sérum de chèvre normal (ou de sérum provenant de l'animal dans lequel l'anticorps secondaire a été élevée) pendant 30 min en agitant doucement
6. Préparer la solution d'anticorps primaire dans 2% de sérum de chèvre normal dans du PBS 0,1%Tx et pipette la solution sur les sections. Placer les lames dans une chambre humide couvert de l'obscurité et de garder à température ambiante jusqu'au lendemain.
7. Le lendemain, laver sections trois fois pendant 5 min avec du PBS 0,1% Tx et incuber dans l'anticorps secondaire fluorescent dilué dans 2% de sérum de chèvre normal du PBS 0,1% Tx pendant une heure.
8. Lavez sections trois fois pendant 5 min avec du PBS 0,1% Tx, contre-colorer avec un colorant nucléaire (par exemple, DAPI) pendant 2 min, laver une fois de plus, clairement dans l'eau et avec une lamelle à base d'eau milieu de montage qui permettra de préserver la fluorescence. Placer les lames sur une surface plane et laissez-les sécher au moins 24 heures, dans l'obscurité, avant d'être prêt pour l'imagerie. Conserver à 4 ° C par la suite.

5. Génération de lignées cellulaires tumorales primaires présentant des altérations génétiques spécifiques.

1. Pour générer des lignées cellulaires à partir de couchage souris porteuses de tumeurs de beauté sélectionner une souris avec grande tumeur (par bioluminescence 10 ⁷ -10 ⁸ photons / s / cm confirmé2 / sr).
2. Euthanasier la souris avec une surdose d'anesthésique isoflurane, décapiter l'animal et soigneusement disséquer le cerveau du crâne (comme décrit à la section 4). Placez le cerveau dans une boîte de Petri propre.
3. En utilisant une lame de rasoir, faire des coupes coronales antérieure et postérieure à la tumeur. La localisation de la tumeur est généralement reconnaissable du fait de la transparence du cerveau.
4. Disséquer la tumeur, généralement 5-7 mm de diamètre avec une pince fine et placer dans un tube de 1,5 ml remplie avec 300 pi Neural Stem Cell Media (NSC Médias: DMEM / F12 avec B-27 en sus, N2 et Normocin, complétée par EGF et bFGF humain recombinant à une concentration de 20 ng / ml chaque).
5. Homogénéiser doucement la tumeur avec un pilon en plastique, qui se adapte aux parois du tube.
6. Ajouter 1 ml de solution de dissociation des tissus sans enzyme et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
7. Faire passer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 70 pm, laver le filtre avec 10 ml deMédias NSC, centrifuger à 300 g pendant 4 min, surnageant décanter et remettre en suspension plomb dans 7 ml de médias NSC.
8. Plate sur un flacon de culture T25 et culture à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire avec l'atmosphère et de 95% d'air et 5% de CO _2. Après trois jours, certaines cellules sont morts, certains ont adhéré au bas de la boîte de culture, et certains sont neurosphères formant, flottant librement dans les médias.
9. Enlevez ces cellules en suspension et re-plaque sur un flacon de culture de tissu T75.
10. Après trois autres jours de culture, recueillir neurosphères, dissocier, comme décrit dans l'étape 5.6, la souche passoire cellulaire et compter les cellules. Congeler les cellules dans des aliquotes de sérum bovin fœtal 10% de DMSO et les cellules de passage à une densité de un million de cellules dans 14 ml de NSC supplémenté avec de l'EGF et FGF pour un flacon T75. Le taux de croissance dépendra des oncogènes utilisées pour produire des tumeurs. Adapter les conditions de culture cellulaire pour empêcher la prolifération et de maintenir les cellules à densité relativement élevée.

Résultats

Afin de caractériser les caractéristiques histopathologiques de glioblastomes SB-induites, les souris néonatales C57 / BL6 ont été injectés en P1 avec une luciférase de plasmide codant pour (PT2 / SB100x-Luc) en combinaison avec des plasmides codant pour des transposons avec de l'ADN oncogene, ce est à dire, les ARN (pT / CAGGS -NRASV12) et SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Figure 3c) ou un plasmide codant pour un p53 en épingle à cheveux court avec PDGFβ et un rapporteur GFP (pT2shp53 / GFP4 / mPDG...

Discussion

Dans cet article, nous détaillons une méthode polyvalente et reproductible pour générer de nouveaux modèles de GBM à l'aide intégration SB transposase- médiation d'ADN plasmidique oncogène dans les cellules entourant la zone sous-ventriculaire de souris néonatales. Nous présentons un protocole pour générer des plasmides de transposons avec de nouveaux gènes d'intérêt, illustrons comment surveiller la progression des tumeurs chez les animaux vivants, et comment caractériser caractéristiques histopathologiques...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Norme de laboratoire de Stoelting avec adaptateurs pour rats et souris	Stoelting	51670	D’autres sociétés produisent des cadres similaires, tous ceux avec de petits adaptateurs de souris conviennent.
Injecteur stéréotaxique par excellence (QSI)	Stoelting	53311	Les injections peuvent être effectuées sans lui, ,mais  ;   ;   ; L’injecteur automatique permet une reproductibilité et une commodité accrues
10 &mu ; l Série 700 Seringue MICROLITER manuelle	Hamilton	Modèle 701	Ce modèle de seringue délivrera de 0,5 à 500 ul de solution de manière fiable. D’autres aiguilles hypodermiques de calibre 30 (par exemple 5 ul, modèle 75) peuvent également être utilisées
< aiguille hypodermique >de calibre 30 (1,25", 15o biseau)  ;	Hamilton	S/O# 197462	Cette aiguille est idéale pour percer la peau et le crâne d’une souris néonatale sans avoir besoin d’autres procédures invasives. S’il devient terne (ne pénètre pas facilement dans la peau), il doit être remplacé.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquote en petits volumes et maintenir à -20 oC  ;
D-Luciférine, sel de potassium	Goldbio.com	LuckK-1g	D’autres sources de luciole lucifierase sont tout aussi adéquates
Solution d’hématoxyline, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	Pour l’intégration de cerveaux pour la cryosection et l’immunohistovhémistry
Advanced DMEM/F-12, sans glutamine	Life Technologies	12634-010	Pour la culture des neurosphères
B-27¨ ; Supplément (50X), sans sérum	Life Technologies	17504-044	Supplément sans sérum pour la culture des neurosphères
N2 Supplément (100x)	Life Technologies	17502-048	Supplément sans sérum pour la culture des neurosphères
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Agent anti-mycoplasme pour la culture des neurosphères
Recombinant Humain EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Supplément de facteur de croissance pour la culture de  ; neurosphères
Humain recombinant FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Supplément de facteur de croissance pour la culture des  ; neurosphères
[en-tête]
HyClone HyQTase  ; Réactif de détachement cellulaire  ;	Thermo Scientific	SV3003001	Pour la dissociation des neurosphères
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	Pour la dissociation de tumeurs fraîchement disséquées
Falcon Cell Strainers Maille taille 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	Pour générer des suspensions unicellulaires de neurosphères dissociées
Xylènes Grade histologique	Fisher Scientific	C8H10
Protocole Harris Hématoxyline sans mercure (acidifiée)	Fisher Scientific	245-678
Protocole Eosyn Y Solution (intensifiée)	Fisher Scientific	314-631