Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Résumé

Nous décrivons les étapes détaillées d’un dosage chimique à haut débit chez le nématode Caenorhabditis elegans utilisé pour évaluer la toxicité germinale. Dans cet essai, la perturbation de la fonction germinale suite à une exposition à un produit chimique est surveillée à l’aide d’un rapporteur fluorescent spécifique aux embryons aneuploïdes.

Résumé

L'identification de la toxicité pour la reproduction des milliers de produits chimiques présents dans notre environnement a été l'un des défis les plus alléchantes dans le domaine de la santé environnementale. Cela est dû en partie à la rareté des systèmes modèles qui peuvent (1) récapituler précision touches caractéristiques des processus de reproduction et (2) le font dans un moyen à la mode à haut débit, sans la nécessité d'un grand nombre d'animaux vertébrés.

Nous décrivons ici un essai chez le nématode C. elegans qui permet l'identification rapide des substances toxiques de la lignée germinale en surveillant l'induction d'embryons aneuploïdes. En faisant usage d'une ligne rapporteur GFP, des erreurs dans la ségrégation des chromosomes résultant de la perturbation de la lignée germinale sont facilement visualisés et quantifiés par microscopie à fluorescence automatisé. Ainsi, la projection d'un ensemble particulier de composés pour sa toxicité peut être effectuée dans un format de plaque à 96 384 puits dans une affaire de jours. Une analyse secondaire des h positifsa peut être effectuée pour déterminer si les anomalies chromosomiques provenaient de la perturbation de la méiose ou de début erreurs chromosome de ségrégation embryonnaires. Au total, ce test représente une stratégie de premier passage rapide pour l'évaluation rapide de la dysfonction de la lignée germinale suite d'une exposition chimique.

Introduction

Il ya environ 87 000 produits chimiques inscrits pour le commerce aux États-Unis, mais seulement un petit nombre d'entre eux ont été testé pour ses effets potentiels sur la santé ^1. Parmi ceux qui ont été testés, seule une partie a été évalué pour les effets sur la santé de la reproduction en partie à cause de la difficulté à déterminer l'altération des événements reproduction début chez les mammifères, en particulier au cours du développement des cellules germinales femelles et la différenciation. En effet, les premiers événements méiotiques ont lieu pendant les premiers stades du développement embryonnaire chez les mammifères femelles et sont donc difficiles d'accès et se accumuler dans les numéros appropriés à des fins de dépistage.

La lignée germinale fournit le lien crucial entre les générations, et sa fonction appropriée dépend de l'exécution précise du programme complexe de la division cellulaire et chromosomique appelée méiose. Le dérèglement du processus méiotique peut provoquer une réduction de la fertilité et de la productiongamètes et des embryons avec un nombre anormal de chromosomes, un état appelé aneuploïdie. Chromosomiques erreurs de ségrégation dans la méiose sont très pertinents pour la santé humaine. Les anomalies chromosomiques sont communs, avec une fréquence de 1 à 150 naissances vivantes, la trisomie 21, 18 et 13 ainsi que chromosomes X et Y étant les erreurs types les plus répandus ^2,3. En outre, les malformations congénitales, y compris ceux d'origine chromosomiques, sont la principale cause de mortalité infantile aux États-Unis ⁴ L'idée que les influences environnementales peuvent affecter la ségrégation et le comportement chromosomique ne est pas nouveau ^5, mais est encore mal comprise. Il est donc crucial pour enquêter sur laquelle des produits chimiques introduits dans notre environnement sont interférer avec la fertilité humaine, le développement des jeunes et la santé reproductive en général.

À la lumière de ces limites des modèles de mammifères, nous avons développé un test de l'écran à haut débit pour tester la toxicité de la reproduction dans le ascaris C. elegans. Nous avons mobilisé plusieurs caractéristiques importantes offertes par ce système de modèle génétique communément employés comme sa petite taille, à faible coût, cycle de reproduction court, forte proportion de cellules germinales et la facilité de manipulation ^6. Worms peuvent être cultivées dans des plaques à 96 puits ou dans des cultures liquides à volume élevé et à cause de leur transparence peuvent être directement visualisés sur des plaques pour la détection des journalistes fluorescentes. Le test décrit ci-dessous tire profit de ces caractéristiques et profite d'une souche du ver contenant le rapporteur fluorescent Pxol-1 :: GFP pour détecter la perturbation lignée germinale et l'induction de l'aneuploïdie embryonnaire.

L'utilisation de cette souche rapporteur est basé sur la présence des hommes généralement rares dans une population de vers principalement hermaphrodite. Ces mâles (<0,2%) proviennent naturellement de l'erreur dans la ségrégation du chromosome X ^7. Cependant, comme la perturbation de la lignée germinale conduit souvent à des erreurs dans la ségrégation des autosomeset hétérochromosomes, il est corrélé à la fois avec une incidence élevée de mâles phénotype (X mauvaise ségrégation) ainsi que la létalité embryonnaire (autosome de mauvaise ségrégation). Pour détecter facilement l'induction des hommes tout en contournant la question de la mortalité embryonnaire, un promoteur spécifique mâle (xol-1) est utilisé pour diriger l'expression de la GFP dans les embryons précoces encore contenues dans l'utérus de la vis sans fin. En tant que tel, l'apparition d'embryons exprimant la GFP est utilisée comme indicateur de la présence d'embryons aneuploïdes. Cette méthode a déjà été utilisée pour identifier les gènes impliqués dans le maintien de la lignée germinale et la méiose ^8,9. Adapté au dépistage chimique, cette souche est employé dans un milieu à l'écran à haut débit. Surtout, la souche rapporte fidèlement la aneugenicity de produits chimiques et est donc pertinent de paramètres de la reproduction des mammifères ^10. L'essai décrit ici sera particulièrement utile pour les toxicologues dans les milieux de l'industrie pharmaceutique et chimique à la recherched'évaluer rapidement la toxicité des produits chimiques sur les effets sur la reproduction. En outre, ce test se aligne pleinement avec les priorités gouvernementales mises en évidence dans la toxicité dans le 21 ^e rapport de ¹¹ siècle.

Protocole

1. Préparation des bactéries Alimentation

NOTE: Cette section décrit la préparation de bactéries d'alimentation (la souche de E. coli OP50).

1. Isoler une seule colonie de E. coli souche OP50 à partir d'un bouillon de lysogénie (LB) plaque de gélose et aseptique inoculer dans 300 ml de bouillon LB autoclave.
2. Laisser la culture inoculé à croître pendant une nuit dans un agitateur à 200 tpm et 37 ° C, jusqu'à ce que la saturation soit atteinte.
3. Transférer le OP50 en 6 tubes de 50 ml coniques stériles, pré-pesées. Pellet les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 6000 tpm (5000 xg).
4. Jeter le surnageant et laver les bactéries avec 50 ml d'M9 stérile. Répéter deux fois.
5. Après le second lavage retirer le M9 restant, assurant qu'aucun M9 est laissé dans le tube.
6. Déterminer le poids de la pastille par pesée du tube contenant le culot de bactéries et soustraire le poids du tube conique de 50 ml.
7. Reprendre le culot in M9 à une concentration de 100 mg / ml.
8. Conserver la solution de OP50 à 4 ° C jusqu'à son utilisation pour la culture de la vis sans fin.

2. Préparation de nématodes croissance à moyen (NGM) des boîtes de Petri

NOTE: Cette section décrit la préparation de plaques NGM Petri, qui sont les plaques où le C. vers elegans sont maintenues en routine en laboratoire.

1. Autoclave le milieu de gélose NGM.
2. En utilisant des procédures stériles, distribuer 17 ml d'une solution de gélose NGM dans des boîtes de Pétri de 6 cm en utilisant une pompe péristaltique.
   NOTE: Une quantité constante d'agar dans les plaques réduit le besoin de recentrer le microscope lors du passage d'une plaque à l'autre.
3. Laisser les plaques à température ambiante pendant 2 à 3 jours avant utilisation pour laisser la gélose solidifier et permettre à l'excès d'humidité de se évaporer.
4. Ensemencer les plaques NGM en utilisant une technique stérile. Appliquer 1-2 gouttes de culture liquide OP50 et diffuser l'aide d'une tige de verre. Veillez à ne pasfaire passer le gazon bactérien tout le chemin vers les bords des plaques.
5. Laisser la pelouse OP50 à croître pendant 1-2 jours à la température ambiante avant d'utiliser les plaques à croître vers.

3. Préparation d'une population de Worm synchrone

NOTE: Le cycle de vie de C. elegans est composé du stade embryonnaire, quatre stades larvaires (L1-L4) et l'âge adulte. Cette section décrit la préparation d'une population de vers l'âge synchrone. Tous les matériaux entrant en contact avec C. elegans après le traitement de l'eau de Javel doivent être stériles.

1. Jour 1 - Préparation de gravides Worm population
   1. Utilisez des assiettes NGM dans lequel la majorité de la population de vers se compose de larves L1 affamés.
   2. Recueillir les larves L1 avec un ver stérilisée ramasser et de les transférer au frais 6 cm de plaques NGM ensemencé avec OP50. Incuber pendant environ 65 heures à 20 ° C jusqu'à ce que la majorité des vers adultes sont gravides. Àéviter plaque surpeuplement et permettent les vers de se développer sans épuiser les bactéries, ne pas transférer plus d'un ou deux groupes de larves L1 à chaque plaque NGM frais.
2. Jour 4 - Création d'un synchronisée L1 larves population
   1. Recueillir les vers gravides des plaques NGM en les lavant avec 1-2 ml de M9 et de les transférer à un tube conique de 15 ml.
   2. Laissez les vers gravides sédimentent au fond du tube de 15 ml conique pour environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin.
   3. Transférer le culot de ver 2-4 microtubes et ajouter 1 ml d'eau de Javel / solution de NaOH. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante. Surveillez la progression de la réaction sous la loupe binoculaire pour confirmer tous les vers sont morts. Ne pas blanchir plus de 5 min que les embryons pourraient mourir.
   4. Recueillir les vers par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 xg). Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de M9 stérileneutraliser la réaction.
   5. Laver les vers deux fois par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 x g).
   6. Retirer le surnageant et ajouter M9 jusqu'à 100-200 ul.
   7. En utilisant une pipette Pasteur en verre ajouter une goutte de la vis sans fin / M9 mélanger pour effacer plaques NGM et incuber pendant au moins 24 heures à 20 ° C pour permettre aux embryons éclosent.
      REMARQUE: Sans nourriture la croissance des larves sera arrêtée au stade L1.
3. Jour 5 - Création d'un synchronisée larves L4 population
   1. Recueillir les larves L1 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
   2. Laissez les morts vers adultes sédiment au fond du tube conique de 15 ml pendant environ 5 min.
   3. Recueillir le surnageant, où les vers sont L1, dans un nouveau tube conique de 15 ml, et précipiter les vers par centrifugation pendant 2 min à 2600 rpm (1000 xg).
   4. Eliminer le surnageant leyant environ 500 pi.
   5. Déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l'aide d'un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes.
   6. Ajuster la concentration des vers à 20-25 vers / ul et ajouter 50 ul du ver / M9 mélange sur des plaques NGM ensemencés avec OP50.
   7. Incuber pendant 65 heures à 15 ° C (pour l'incubation à travers le week-end) pour permettre à la population synchronisée L1 à grandir jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade L4.

4. Exposition de Worms à des produits chimiques dans les plaques à 96 puits

NOTE: Cette section décrit l'utilisation de Pxol1 :: rapporteur transcriptionnel GFP contenant C. souche elegans pour le dépistage de l'induction de l'aneuploïdie.

1. Recueillir les larves L4 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
2. Laissez le L4 vers sédiments au fond de la15 ml tube conique de environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin.
3. Ajouter 3-5 ml de M9 et déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l'aide d'un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes pour chaque échantillon.
4. Remettre en suspension les vers à une concentration de 1,000 / ml dans les vers M9.
5. Diluer les bactéries OP50 de l'article 1 10 fois avec M9. Assurez-vous que les bactéries remises en suspension atteignent la température ambiante parce que la température inférieure affecte le développement du ver.
6. En utilisant une pipette multicanaux, d'abord ajouter 100 ul du ver / M9 mélange (de l'étape 4.4) et puis ajouter 400 pl des bactéries OP50 dilué (de l'étape 4.5) pour chaque puits d'une 2 ml ronde profonde de plaque de 96 puits à fond. À la fin, chaque puits aura 100 vers dans 500 pi.
7. Ajouter 0,5 ul de la substance d'essai ou le contrôle approprié pour les puits souhaités, pour parvenir à une concentr finale suggéréation de 100 uM, une concentration couramment utilisé dans les écrans chimiques en C. elegans ^12. Exposer l'éthanol ou le DMSO témoins de solvant à une concentration finale de 0,1%.
   NOTE: Nous vous recommandons l'utilisation de nocodazole (100 M) comme témoin positif.
8. Sceller la plaque avec un film adhésif. Ne oubliez pas de sceller la plaque bien de prévenir la contamination croisée entre les puits.
9. Envelopper la plaque avec une feuille d'aluminium.
10. Transférer la plaque à un agitateur (170 à 180 rpm) de la température appropriée pour la longueur de temps appropriée (24 ou 65 h). La température de la pièce affecte la croissance des vers; maintenir la température autour de 20 ° C.

Acquisition 5. Image gravides Worms dans une plaque 384 puits

NOTE: Cette section décrit l'utilisation d'un microscope à haute teneur à l'image de la Pxol1 exposée :: vers GFP, de visualiser l'expression de la GFP dans les embryons dans l'utérus d'hermaphrodites adultes. Pourchaque plaque 384 puits à cribler, utiliser des vers de plaques 4 x 96 puits.

1. Après exposition aux produits chimiques dans le shaker, laissez la plaque à 96 puits de repos pendant 10-15 min pour permettre les vers adultes dans les sédiments au fond de la plaque.
2. En utilisant une pipette multicanaux, retirer 350 pi de la M9, ​​en faisant très attention à ne pas déranger les vers dans le fond de la plaque.
3. Laver les vers avec 1 ml de M9 et répétez l'étape 5.1.
4. En utilisant une pipette multicanaux, retirez 1 ml de la M9, ​​étant Vey attention à ne pas déranger les vers dans le bas de la plaque.
5. En utilisant une pipette multicanaux, remettre en suspension les vers dans le M9 restante et de recueillir 100 pi du ver / M9 mélange des plaques à 96 puits et le charger dans les puits d'une murs noirs / plaque de fond claire 384 puits. Répétez le processus en utilisant les vers de plaques 4 x 96 puits, jusqu'à ce que tous les puits de la plaque 384 puits ont été chargés.
   NOTE: Il est important pour tous les puits d'avoir le même volume pour augmenter lal'efficacité et la rapidité de la mise au point automatique pendant le processus d'acquisition d'image. Chaque puits doit contenir entre 80 à 100 vers.
6. Ajouter 1 ul de lévamisole (100 M) à chaque puits et laisser les vers incuber pendant environ 30 min.
   REMARQUE: lévamisole agit comme un agoniste du récepteur de l'acétylcholine et immobilise les vers.
7. Transférer la plaque à un microscope haute teneur grand champ capable de fournir l'imagerie automatisée.
8. Pour l'acquisition de l'image, utiliser une acquisition et d'analyse d'image logiciel teneur élevée selon les directives du fabricant. Sélectionnez l'objectif 4X pour acquérir une image par bien.
9. Avant de commencer l'acquisition de l'image, réglez les paramètres d'imagerie de la GFP à 45 ms de l'exposition et de la résolution de 2160 x image pour 2160.
10. Recueillir les données que le nombre de vers GFP-positives divisé par le nombre total de vers dans le puits, cette dernière mesure étant relativement constante entre les puits.

Résultats

L'exposition de la Pxol-1 :: GFP souche rapporteuse à des agents chimiques tels que les microtubules poison nocodazole (figure 1) conduit à l'induction d'une forte proportion d'embryons exprimant la GFP dans l'utérus d'hermaphrodites adultes exposés par rapport à un témoin de DMSO. Les embryons GFP-positives sont significativement plus lumineux que le fond faible fluorescence observé dans d'autres embryons ainsi que l'auto-fluorescence observée dans l'intesti...

Discussion

La méthode décrite ici constitue la première stratégie de grande échelle pour l'identification de substances toxiques de la lignée germinale. Il nécessite l'utilisation d'un transgénique GFP Pxol-1 :: GFP contenant la souche qui rend fidèlement l'induction de l'aneuploïdie dans les embryons précoces qui est utilisé comme un proxy pour le dysfonctionnement de la lignée germinale. La méthode implique la synchronisation minutieuse d'un C. elegans population de vers et de l'expo...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
60 mm Ventilée, arête vive Boîtes de Pétri	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96 puits ronds clairs clairs 2 ml plaque à puits profond en polypropylène	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
Eau de Javel	Clorox
Chlorure de calcium (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholestérol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Centre		de génétique Caenorhabditishttp://www.cbs.umn.edu/cgc
Éthanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 plaques puits	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Chlorhydrate de lévamisole	Fluka	31742
Sulfate de magnésium anhydre (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress Acquisition d’images à haut contenu & Logiciel d’analyse	Dispositifs
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Films de rayonne pour cultures biologiques	VWR	60941-086
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ 745	Ce microscope a un grossissement total de 3,35X à 300X. N’importe quel microscope ayant des caractéristiques similaires fonctionnera.
TY2441 C. elegans, Pxol-1 ::GFP souche rapporteuse	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Extrait de levure	Becton Dickinson	212750