Article de méthode

Utilisant le virus adéno-associé comme un outil pour étudier les obstacles dans la maladie de la rétine

DOI :

10.3791/52451

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19 avril 2015

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1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour étudier la perméabilité de la barrière hémato-rétinienne et l’intégrité de la membrane limitante interne dans des modèles animaux de maladie rétinienne, nous avons utilisé plusieurs variantes de virus adéno-associés (AAV) comme outils pour marquer les neurones rétiniens et les cellules gliales. L’expression du gène rapporteur médiée par le virus est ensuite utilisée comme indicateur de la perméabilité de la barrière rétinienne.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules de Müller sont les principales cellules gliales de la rétine. Leurs pieds d'extrémité forment les limites de la rétine au niveau des membranes externe et interne (ILM) de limitation, et en liaison avec les astrocytes, des pericytes et des cellules endothéliales qu'ils établissent la barrière hémato-rétinienne (BRB). BRB limite transport de matière entre dans la circulation sanguine et la rétine tandis que le MFI agit comme une membrane de sous-sol qui définit histologiquement la frontière entre la rétine et la cavité vitréenne. Étiquetage cellules de Müller est particulièrement pertinent pour étudier l'état physique des barrières de la rétine, car ces cellules sont une partie intégrante de la BRB et ILM. Les deux BRB et ILM sont fréquemment modifiées dans les maladies de la rétine et sont responsables de symptômes de la maladie.

Il existe plusieurs méthodes bien établies pour étudier l'intégrité de la BRB, tels que le test bleu Evans ou angiographie à la fluorescéine. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas d'informations sur l'ampleur de la perméabilité BRB to molécules plus grandes, dans la fourchette de nanomètre. En outre, ils ne fournissent pas d'informations sur l'état d'autres obstacles de la rétine comme l'ILM. Pour étudier BRB perméabilité aux côtés de la rétine ILM, nous avons utilisé une méthode basée AAV qui fournit des informations sur la perméabilité de la BRB à des molécules plus grandes tout en indiquant l'état des ILM et de matrice extracellulaire de protéines dans les états pathologiques. Deux variantes de l'AAV sont utiles pour cette étude: AAV5 et ShH10. AAV5 a un tropisme naturel pour photorécepteurs mais il ne peut pas obtenir à travers la rétine externe lorsqu'il est administré dans le corps vitré lorsque l'ILM est intacte (c. dans les rétines de type sauvage). ShH10 a un fort tropisme envers les cellules gliales et étiqueter sélectivement les cellules gliales Müller dans les deux rétines sains et malades. ShH10 fournit la livraison de gènes plus efficace dans les rétines où ILM est compromise. Ces outils viraux couplés par immunohistochimie et le sang-analyse de l'ADN éclairent sur l'état des barrières de la rétine dans la maladie.

Introduction

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Les cellules de Müller sont le principal composant des cellules gliales de la rétine. Morphologiquement, ils se étendent radialement à la rétine et leur endfeet, en contact avec le corps vitré, et font face à la MLI secrètes composants de ce dernier. Le MFI est une membrane de sous-sol composée d'une dizaine de différentes protéines de la matrice extracellulaire (laminine, l'agrine, le perlecan, nidogène, le collagène et les protéoglycanes de sulfate plusieurs héparine). Au cours du développement, sa présence est indispensable pour histogénèse rétinienne, la navigation des axones optiques, et la survie des cellules ganglionnaires de 1-3. Cependant, ILM est inessentiel dans la rétine adulte et peut être enlevée chirurgicalement dans certaines pathologies sans causer de dommages à la rétine 4. Dans la thérapie génique, cette membrane est une barrière physique pour la transduction efficace de la rétine en utilisant AAV 5 par injection intravitréenne.

Grâce à l'arborisation étendue de leurs processus, les cellules de Müller fournissent suppo nutritionnel et réglementairert à la fois les neurones rétiniens et les cellules vasculaires. Les cellules de Müller sont également impliqués dans la régulation de l'homéostasie de la rétine, dans la formation et le maintien de la BRB 6. Jonctions serrées entre les cellules endothéliales des capillaires rétiniens, Müller cellules, les astrocytes et les péricytes forment la BRB. BRB empêche certaines substances de pénétrer dans les nombreuses maladies retina.In comme la rétinopathie diabétique, l'occlusion veineuse rétinienne et les maladies respiratoires, l'hypoxie de la rétine provoque une fuite à travers la BRB 7-9. Cette rupture est associée à une augmentation de la perméabilité vasculaire conduisant à l'oedème vasogénique, décollement de la rétine et des dommages de la rétine.

Les cellules de Müller sont étroitement associés avec les vaisseaux sanguins et la membrane basale, jouant un rôle important à la fois l'intégrité BRB et ILM. Par conséquent, l'étiquetage des cellules gliales Müller est particulièrement pertinent pour l'étude de l'état physique de ces obstacles rétiniennes.

Classiqueallié, BRB perméabilité est mesurée en utilisant le test bleu Evans consistant en l'injection systémique de colorant bleu Evans, qui se lie de façon non covalente à l'albumine plasmatique. Ce test mesure la fuite d'albumine (protéine de taille moyenne, ~ 66 kDa) des vaisseaux sanguins dans la rétine (voir Protocoles Section 5) 10. Alternativement, la fuite vasculaire peut être visualisé par angiographie rétinienne fluorescence attestant de fuite de la fluorescéine (petite molécule, ~ 359 Da, voir Protocoles Section 6) 11. Néanmoins, les deux méthodes permettent d'évaluer la perméabilité BRB à de petites molécules et des protéines, mais ils ne fournissent pas d'informations sur l'intégrité de ILM.

Par conséquent, pour étudier la perméabilité BRB, nous avons utilisé une méthode basée AAV qui donne des informations sur la perméabilité BRB à des molécules plus grandes (par exemple, les particules AAV, diamètre de 25 nm). En effet, notre méthode peut détecter la présence de l'AAV transgène dans le sang, ce qui suggère que les particules ~ 25 nm de diamètre feriezêtre capable de se infiltrer dans la circulation sanguine. Cette méthode fournit également des informations sur la structure du GIP et des protéines de la matrice extracellulaire dans des conditions pathologiques. Deux variantes de l'AAV sont utiles pour cette étude: AAV5 et ShH10. Sous-rétinienne injecté, AAV5 a un tropisme naturel pour les photorécepteurs et épithélium pigmentaire de la rétine 12, mais il ne peut pas obtenir à travers la rétine externe lorsqu'il est administré dans le corps vitré dans les rétines de type sauvage avec ILM intacte 5,13. ShH10 est une variante de l'AAV qui a été conçu pour cibler spécifiquement les cellules gliales plus de neurones 14,15. ShH10 étiquettes sélectivement les cellules de Müller dans les deux rétines sains et malades avec une efficacité accrue dans les rétines avec des barrières compromis 16. Ces outils viraux couplés avec immuhistochemistry et l'analyse de sang-ADN fournissent des informations sur l'état des barrières de la rétine et leur implication dans la maladie (Figure 1).

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Protocole

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Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été pris en charge et traités conformément à la déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research.

1. Production d'AAV recombinant (rAAV) par transfection transitoire de cellules HEK-293 17,18

NOTE: Voir McClure C, JoVE (2011) 19.

  1. Purifier une préparation de plasmide à grande échelle (au moins 1 mg / ml) des plasmides de vecteurs d'AAV. Utilisez trois plasmides. Le plasmide AAV helper portant les gènes de réplication et de capside sans terminale inversée d'AAV répète RTI, la cassette d'expression du transgène portant l'AAV ITR appelé le plasmide de transfert, et le plasmide fournissant les gènes d'adénovirus helper E2, E4, et les gènes des ARN VA visés comme pHELPER.
  2. Transfecter des cellules 293 avec ces trois plasmides en utilisant de la polyéthylèneimine (ou un autre réactif de transfection). Au-dessus de 80% de l'efficacité de transfection est nécessaire pour une bonne virendements RAL.
  3. Purifier AAV recombinant de 293 lysats cellulaires sur un gradient de iodixanol. 15%, 25%, 40%, 60% et l'iodixanol est utilisée pour obtenir le gradient. Recueillir la fraction de l'iodixanol 40% contenant des particules d'AAV, on concentre la fraction après ultracentrifugation à 500000 g pendant 1 h et l'échange contre du tampon PBS (solution saline tamponnée au phosphate) avec 0,001% de Pluronic.
  4. Pour déterminer le titre génomique viral 20, effectuer une digestion ProteinaseK DNAse suivie par qPCR. Les amorces avant et arrière amplifient la région de 62 pb situé dans le AAV2 ITR. Pour la norme de plasmide, la sonde est marquée avec FAM et a un trou noir extincteur (BHQ).
  5. Effectuer qPCR (réaction en chaîne de la polymérase quantitative) dans un volume final de 25 ul en utilisant 340 nM inverser ITR amorce, 100 nM ITR l'amorce, 100 nM sonde AAV2 ITR, mM dNTP 0,4, 2 mM de MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq et 5 modèle de pi (standard, l'échantillon et aucun contrôle de modèle).
  6. Pourla norme, utiliser le plasmide pour la transfection dans 7 x 10 dilutions en série (5 pi chacun de 2 x 10 9 à 2 x 10 3 génomes / ml, aboutissent à une concentration finale de 10 oct-10 avril génomes / ml).
  7. Commencer le programme d'une étape de dénaturation initiale à 95 ° C pendant 15 min suivi par 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 1 min et d'hybridation / élongation à 60 ° C pendant 1 min. Conserver à 4 ° C pour un stockage à court terme ou à -20 ° C pendant longues périodes de stockage.

2. Injection intravitréenne de l'AAV

  1. Anesthésier les souris C57BL6J avec de la kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) et vérifier la perte du réflexe de redressement, la réponse de retrait réflexe et pincement de la queue indique une anesthésie appropriée. Dilater élèves par application à la cornée de néosynéphrine 5% et 0,5% Mydriaticum collyre. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  2. Passer un G disposab ultrafine 30aiguille à travers le l'équateur et à côté du limbe, dans la cavité vitréenne (voir Chiu K, JoVE (2007) 21). Injecter 1 ul mère contenant 1 à 4 x 10 11 vp de ShH10-GFP ou AAV5-GFP avec l'observation directe de l'aiguille dans le centre de la cavité vitréenne (Figure 1). Utilisez un œil comme un contrôle pour des expériences d'ILM. Injecter deux yeux pour des expériences BRB. Appliquer un traitement topique anti-inflammatoire et antibactérien sur les yeux injectés.
  3. Dilater élèves néosynéphrine et Mydriaticum collyre pour l'imagerie. Effectuer des examens du fond d'œil d'une caméra de fond d'œil à suivre GFP (Green Fluorescent Protein) expression 1 semaine, 2 semaines, 1 mois et 2 mois après l'injection intravitréenne (Figure 1). Sacrifiez souris par inhalation de CO 2 1 à 2 mois après l'injection.

3. immunohistochimie

  1. Pour cryosections rétiniennes (figure 1), disséquer yeux énucléés pour enlever lens et de la cornée, et l'immersion correctif dans 4% de paraformaldehyde pendant 1 heure.
    1. Cryoprotect les yeux préalablement fixés dans 10% de saccharose pendant 1 heure à température ambiante, 20% de saccharose pour une autre heure à la température ambiante. Cryoprotect dans une solution de saccharose à 30%, pendant une nuit à 4 ° C. Geler et œilletons intégrer dans l'intégration résine telle que Cryo-matrice. Faire 10 um cryosections et monter sur des lames spécialement traités pour les sections de tissus congelés et améliorer l'adhérence des tissus pendant la coloration.
    2. Perméabiliser sections avec 0,1% de Triton X100 dans du PBS pH 7,4 pendant 5 min. Lavage dans PBS 2x bloc et pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS avec 1% de BSA, 0,1% de Tween 20.
  2. Pour flatmounts rétiniennes (figure 1), fixer les yeux énucléés dans 4% de paraformaldehyde pendant 15 min pour faciliter la dissection.
    1. Dans 15 à 30 min, disséquer les yeux pour enlever la cornée et le cristallin. Séparer la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la sclérotique en coupant autour de l'ora serrata etle nerf optique. Plongez dans l'univers du paraformaldéhyde 4% pendant 30 min à fixer la rétine et la protéine fluorescente dans les cellules rétiniennes transduites (fixation ne doit pas dépasser 24 heures). Laver 5 min dans du PBS stérile, pH 7,4.
    2. Changer le PBS à un tampon de blocage (PBS avec 1% de BSA, 2% de sérum de chèvre normal ou d'âne, 0,5% de Triton X-100), et incuber dans du tampon de blocage pour soit 4 heures à la température ambiante ou à 4 ° C pendant une nuit.
  3. Incuber les tissus avec des anticorps primaires dans du tampon de blocage pour soit 4 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Laver 3x avec PBS.
    NOTE: Les anticorps utilisés sont les suivants: anti-laminine (1/1000) marquer l'ILM, clone anti-rhodopsine 4D2 (1/500) tiges d'étiquetage, anti-glutamine synthétase clone GS-6 (1/1500) étiquetage cellules de Müller PNA, lectine (1/40) cônes d'étiquetage.
  4. Incuber tissus avec dilution 1: 500 d'anticorps secondaires conjugués fluor alexa au tampon de blocage pendant 1 heure (cryosections) ou 2 h (flatmounts) à la salle Temperature et protégé de la lumière. Laver 3x avec PBS.
  5. Faire des coupes à soulager la rétine et il flatmount sur une lame de verre avec soit le photorécepteur ou une cellule ganglionnaire de la rétine (RGC) côté tourné vers le haut. Ajouter mountingmedium aqueuse, appliquer lamelle et conserver à 4 ° C.
  6. Effectuer la microscopie confocale à balayage laser sur microscope confocal. Acquérir les images séquentiellement, ligne par ligne, de réduire excitation et d'émission diaphonie. Définir taille de pas en fonction de la théorème d'échantillonnage de Nyquist-Shannon. Utiliser les paramètres d'exposition qui minimisent pixels sursaturées dans les images finales. Processus images 12 bits avec les Fidji, projet Z-sections sur un seul plan utilisant l'intensité maximale en vertu de la fonction Z-projet et enfin convertir en mode couleur 8 bits RVB.

Analyse PCR 4. des échantillons de sang de souris

  1. Injecter 100 ul mère contenant 1-4 x 10 11 particules d'un AAV-GFP dans la veine du pénis de souris C57BL6J anesthésiés (5% d'isofluranepour l'induction dans une chambre close et 2,5% d'isoflurane à travers un cône de nez au cours de la chirurgie) en utilisant une seringue d'insuline avec un ultra-fine aiguille 6 mm. Cet animal servira de contrôle positif de faire circuler des particules d'AAV.
  2. Échantillon de sang de la queue de la souris avant l'injection et 3 h, 24 h, deux jours, trois jours et après ShH10 injection intravitréenne ou après l'injection intrapénienne (Figure 1). Environ 10-20 ul est recueilli dans des tubes d'héparine. Sacrifiez souris par inhalation de CO 2 après l'achèvement de la procédure.
  3. Extraire l'ADN génomique à partir d'échantillons sanguins en utilisant le kit d'extraction de votre choix.
  4. Effectuer amplification par PCR de l'ADN génomique. Pour ce protocole utiliser la paire d'amorces suivante: GFP, le sens 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-antisens CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Le programme de PCR suivant a été réalisé: 95 ° C 2 min (1 cycle); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 cycles); 72 ° C 5 min (1 cycle);4 ° C attente.

5. Facultatif Evans Méthode Bleu

REMARQUE: quantifier la perméabilité vasculaire en mesurant la fuite d'albumine à partir de vaisseaux sanguins dans la rétine en utilisant la méthode au bleu Evans 10.

  1. Préparation de colorant bleu d'Evans par dissolution dans une solution saline normale (6 mg / ml), traitement aux ultrasons pendant 5 min dans un bain à ultrasons, et filtration à travers un filtre de 5 um.
  2. Anesthésier souris C57BL6J (isoflurane inhalation, voir l'étape 4.1), vérifiez la perte du réflexe de redressement, le réflexe de retrait et la réponse queue de pincement indiquant une anesthésie appropriée, et injecter bleu Evans (45 mg / kg) dans la veine du pénis (figure 1). Vérifiez que les pattes, le museau et les oreilles de souris deviennent clairement bleu suivant Evans injection bleu, confirmant l'absorption et la distribution du colorant.
  3. Anesthésier les souris C57BL6J 3 h après l'injection du colorant avec de la kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) et vérifier la perte de righting reflex indiquant une anesthésie appropriée. Exemple intracardiaque environ 500 pi de sang dans des tubes d'héparine et perfuser des souris pendant 2 min via le ventricule gauche avec un tampon citrate (0,05 M, pH 3,5; dissoudre 7,8 g d'acide citrique et 3,8 g de citrate de sodium dans 1 L d'eau distillée) préchauffée à 37 ° C pour éviter la vasoconstriction. Les souris sont sacrifiées par la perfusion.
  4. Après perfusion, énucléer et soigneusement disséquer les deux yeux sous un microscope opératoire pour recueillir les rétines (voir section 3.2). Rétines sec dans un évaporateur centrifuge nuit, pèsent, et d'extraire le colorant bleu Evans en incubant rétines avec 100 pi de formamide pendant 18 heures à 65 ° C avec agitation (100 xg). Échantillons Centrifugeuse de la rétine à 30K tubes filtrants oméga à 20,798.5 xg pendant 2 h à 4 ° C et des échantillons de sang de centrifugeuse à 20,798.5 g pendant 15 min à 4 ° C.
  5. Utilisez les deux surnageants pour mesurer l'absorbance. Déterminer l'absorbance de chaque échantillon en soustrayant le maximum d'absorbance for Evans bleu à 620 nm au minimum d'absorbance à 740 nm. Calculer Evans concentration de bleu dans le plasma et de la rétine à partir d'une courbe standard de bleu Evans dans le formamide. Exprimez BRB perméabilité dans microlitre de bleu Evans par gramme de la rétine sèche par heure (ul plasma / g de poids sec de la rétine / h).

6. Facultatif angiographie à la fluorescéine

REMARQUE: Les fuites de vaisseaux sanguins rétiniens chez les souris peut être visualisée par injection intraperitoneale de fluorescéine de sodium.

  1. Anesthésier souris C57BL6J (isoflurane inhalation, voir l'étape 4.1) et dilater les élèves avec des gouttes oculaires (néosynéphrine et Mydriaticum). Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  2. Injecter par voie intraperitoneale de 0,01 à 0,02 ml de fluorescéine de sodium à 10% dans 0,1 ml de solution saline stérile pour angiographie à la fluorescéine.
  3. Recueillir des images des deux yeux après l'injection à l'aide d'une caméra de fond d'œil. Sacrifiez souris par inhalation de CO 2 après la proprocédure.
    NOTE: 20 sec sont nécessaires pour les vaisseaux rétiniens deviennent visibles à l'angiographie. Images doivent être capturé entre 3-10 min après injection de fluorescéine maximale. Les points de fuite (le cas échéant) sont observables après 2,5 min. Aux points de temps plus tard, la qualité d'image est perdue en raison de la fluorescéine de sodium diffusant dans les images donc que peu vitreux, obtenus après sont utilisés pour l'analyse.

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Résultats

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Nous nous attendons augmenté transduction rétinienne des cellules gliales Müller utilisant ShH10 si le modèle animal montre des perturbations dans la structure de l'ILM (Figure 2A - B). Par exemple, nous avons montré qu'en l'absence de Dp71, cibles ShH10 spécifiquement mais plus efficacement les cellules gliales Müller par injection intravitréenne, indiquant augmentation de la perméabilité de l'ILM dans cette lignée de souris par rapport à souris de type sauvage 16<...

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Discussion

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La BRB règle l'échange de molécules entre le sang et la rétine. Sa ventilation est associée à diverses maladies telles que la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Nous avons récemment montré que, dans une souris de la dystrophine knock-out, qui affiche perméable BRB, la rétine devient plus permissive à la livraison de gènes médié par des vecteurs viraux adéno-associés (AAV). Cependant, malgré la perméabilité BRB particules d'AAV injectée par voie intraoculaire rester co...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions la plateforme d’imagerie de l’Institut de la Vision. Nous remercions l’Association Française des Myopathies (AFM) pour une bourse de thèse à O.V. et Allergan INC. Ce travail réalisé dans le cadre du LABEX LIFESENSES [référence ANR-10-LABX-65] a été soutenu par des fonds publics français gérés par l’ANR. Nous remercions Peggy Barbe et Mélissa Desrosiers pour l’aide technique qu’elles ont apportée à la préparation des AAV. Nous sommes reconnaissants à Stéphane Fouquet pour son excellente assistance technique en microscopie confocale et sa contribution experte à l’interprétation des résultats.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
C57BL6J souris soucheJANVIER LABSsouris
Kétamine 500Virbac Franceanesthésique
Xylazine Rompun 2 %BayerHealthcareanesthésique
Néosynéphrine 5 % FaureEurophtadilatant
Mydriaticum 0,5 %Theadilatant
SterdexNovartisanti-inflammatoire
Résine d’enrobage CryomatrixThermo Scientific6769006
Superfrost Plus Lames d’adhésionThermo Scientific10143352lames
anti-laminineSigmaL9393anticorps
anti-rhodopsine clone 4D2MilliporeMABN15
anti-glutamine synthétase clone GS-6Anticorps MilliporeMAB302
Protéine acide fibrillaire anti-glialeAnticorps Dako334Anticorps
PNA LectineInvitrogenL32459Sonde
Alexa Anticorps secondaires conjugués au fluor AlexaAnticorpsInvitrogen
Réactif Fluorsave Supportde montage Calbiochem345789
QIAmp DNA Micro KitQIAGEN56304
GoTaq ADN polymérasePromegaM3001
Evans Bleu colorantSigmaE2129colorant
5 µ ; m filterMillipore
Citrate de sodiumSigmaS1804
Acide citriqueSigmaC1909-2.5KG
Spectrophotométrie de formamideSigma295876-2L
FluorescéineSigmaF2456colorant
Micron IIILaboratoires derecherche de PhoenixLe système de microscopie basé sur une caméra couleur à 3 CCD, une carte d’acquisition d’images et un logiciel standard permet aux chercheurs d’imager les rétines des souris.
Seringues à insulineTerumoSS30M3109
Seringue 10 µ ; l HamiltonDutscher74487Seringue 1701
Aiguille RN G33, 25 mm, PST 2Fisher Scientific11530332Injection intravitréenne
UltraMicroPump UMP3World Precision InstrumentsUMP3L’injecteur polyvalent utilise des microseringues pour délivrer des volumes de picolitres
UltraMicroPump (UMP3) (un) avec contrôleur SYS-Micro4Contrôleurnumérique UMP3-1
Loupe binoculaire SZ76ADVILABADV-76B2Zoom 0.66 x 5 x LEDs avec support epi et dia / Dissection des rétines
Ciseaux à ressort droits - 8.5 cmBionic France S.a.r.l15003-08Dissection des rétines
courbée Ciseaux Vanna15004-08
Pince Dumont 511254-20
Veriti 96-Well Thermal CyclerLife technologies4375786Thermocycleur
Nettoyeur à ultrasonsFournitures de laboratoireG1125P1T
Nanosep 30k omega tubesVWR
SpeedvacFisher ScientificSC 110 A
SpectrofluorimètreTECANinfinite M1000
anticorps

Références

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  1. Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
  2. Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
  3. Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
  4. Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
  5. Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
  6. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  7. Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
  8. Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
  9. Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
  10. Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
  11. Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
  12. Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
  13. Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
  14. Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
  15. Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467(2009).
  16. Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
  17. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
  18. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
  19. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348(2011).
  20. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  21. Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313(2007).
  22. Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
  23. Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329(2009).
  24. Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).

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