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Article de méthode

Un modèle de Porcinet néonatale encéphalopathie hypoxique-ischémique

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DOI :

10.3791/52454

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16 mai 2015

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1The Perinatal Research Unit, Department of Pediatrics, Institute of Clinical Medicine, Aarhus University Hospital, 2Department of Otorhinolaryngology and Head & Neck Surgery, Institute of Clinical Medicine, Aarhus University Hospital

Dans cet article

Résumé

L’encéphalopathie hypoxique-ischémique suite à une asphyxie périnatale peut être étudiée à l’aide de modèles animaux. Nous démontrons les procédures nécessaires à l’établissement d’un modèle porcelet d’encéphalopathie hypoxique-ischémique néonatale.

Résumé

Asphyxie à la naissance, ce qui provoque encéphalopathie hypoxique-ischémique (HIE), représente 0,66 million de décès dans le monde chaque année, environ un quart des 2,9 millions de décès néonatals dans le monde. Les modèles animaux de HIE ont contribué à la compréhension de la physiopathologie de HIE, et ont mis en évidence le processus dynamique qui se produisent dans une lésion cérébrale due à une asphyxie périnatale. Ainsi, les études animales ont suggéré une fenêtre de temps pour les stratégies de traitement post-insulte. L'hypothermie a été testée comme traitement pour HIE dans les modèles pdiglet et ensuite avérée efficace dans les essais cliniques. Variations du modèle ont été appliquées dans l'étude des méthodes neuroprotecteurs d'appoint et des études de porcelets de xénon et la mélatonine ont conduit à la phase clinique I et II des essais 1,2. Le modèle porcelet HIE est en outre utilisée pour les études de resuscitation- et hémodynamiques néonatale ainsi que dans les enquêtes de l'hypoxie cérébrale au niveau cellulaire. Cependant, il est un défi techniquemodèle et des variations dans le protocole peuvent entraîner des lésions cérébrales trop légère ou trop sévère. Dans cet article, nous démontrons les procédures techniques nécessaires pour établir un modèle de porcelet stable néonatale HIE. Tout d'abord, le porcelet nouveau-né (<de 24 h, la médiane du poids 1500 g) est anesthésié, intubé, et surveillé dans une configuration comparable à celle trouvée dans une unité néonatale de soins intensifs. Hypoxie-ischémie globale est induite par l'abaissement de la fraction inspiratoire d'oxygène pour atteindre hypoxie mondiale, ischémie par une hypotension et un EEG plat amplitude de trace intégré (aEEG) indicatif de l'hypoxie cérébrale. La survie est favorisée par l'oxygénation de réglage en fonction de la réponse aEEG et la pression artérielle. Le traumatisme crânien est quantifiée par histopathologie et l'imagerie par résonance magnétique après 72 h.

Introduction

L'asphyxie périnatale est une affection aiguë et souvent imprévue associée à encéphalopathie hypoxique-ischémique (HIE). L'objectif global de ce protocole est de démontrer un modèle de survie des porcelets d'périnatale encéphalopathie hypoxique-ischémique. Ce modèle peut être utilisé pour étudier l'effet de divers degrés d'hypoxie-ischémie sur le cerveau du nouveau-né et de traitements expérimentaux sur la neuropathologie, l'imagerie par résonance magnétique et en spectroscopie (IRM et SRM) et de biomarqueurs dans des fluides corporels tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien et l'urine . Le modèle a également prouvé utile pour étudier le système cardiovasculaire, le système respiratoire, les reins et le foie, qui sont tous affectés à l'hypoxie-ischémie globale.

L'asphyxie périnatale est le résultat de compromis intrapartum d'alimentation en oxygène ou dans la période post-partum immédiat. Événements hypoxiques partum représentent 0,66 million de décès dans le monde chaque année, environ un quart des 2,9 moulin du mondeion décès néonatals en 2012 3. En 2010, 1,15 million de bébés ont été estimées à avoir développé encéphalopathie néonatale suivante asphyxie à la naissance 4. HIE défini comme l'encéphalopathie chez les nourrissons nés après 34 semaines de gestation se produit dans 1-3 / 1 000 naissances vivantes 5 dans le monde industrialisé et jusqu'à 8,5 / 1 000 naissances vivantes dans les pays en développement 4. Le risque de décès est de 10-60%, et le risque de handicap neurologique chez les survivants 30-100% 6,7. 50,2 millions d'années de vie ajustées sur l'incapacité (DALY) sont attribuées à des événements intrapartum hypoxiques 4. Actuellement, le seul traitement autre que de soutien pour HIE est l'hypothermie post-hypoxique. Ainsi, les progrès dans les procédures de diagnostic et des stratégies de traitement sont essentielles pour améliorer la gestion des HIE 8.

Améliorations dans le pronostic après l'asphyxie et la gestion de la lésion cérébrale néonatale périnatale sont fondées sur l'expansion de la connaissance des mécanismes pathologiques sous-jacents d'uned traitements possibles. Les modèles animaux de HIE sont particulièrement utiles comme différentes manifestations cliniques peuvent conduire à HIE et l'incidence dans tout centre de naissance unique est faible 5. Un dispositif expérimental dans lequel l'influence de la variation biologique peut être réduite au minimum, est indispensable lors de l'essai de nouveaux outils de diagnostic et de pronostic et de stratégies de traitement. Un modèle animal devrait se rapprocher de la situation clinique le plus fidèlement possible, contribuant ainsi à la compréhension des mécanismes pathologiques sous-jacents de la lésion induite et le processus dynamique impliqué dans la maladie et d'une manière résultats 9. Les modèles animaux de HIE néonatale ont inclus un certain nombre d'espèces, y compris les rongeurs, l'agneau, et les porcs. En comparaison, le porcelet nouveau-né a plus de ressemblance à un nouveau-né humain par rapport à la taille, le système cardiovasculaire et du cerveau 10 maturité au moment de la livraison 11,12. Surveillance, l'instrumentation et l'évaluation des résultats dans le modèle de porcelet est similaire à that utilisé dans les soins cliniques des nourrissons atteints HIE. En conséquence, il existe un degré élevé de la traduction dans les soins du nouveau-né à partir de ce modèle.

Porcelets modèles d'hypoxie périnatale et HIE sont utilisés par de nombreux groupes et varient dans un certain nombre de domaines 13. Selon le but de l'expérience, une attention particulière doit être accordée au choix des médicaments, méthode d'induction de l'hypoxie-ischémie, la méthode de contrôle de la durée et de la gravité de l'insulte, l'insulte post-réanimation et de soins, et l'évaluation des résultats. Pour éviter les biais d'une conception de l'essai randomisé devrait toujours être utilisé dans les études interventionnelles.

La méthode appliquée lorsque induire une lésion hypoxique-ischémique est important. Hypoxie globale conduisant à HIE se traduit souvent par une défaillance multiviscérale impliquant cerveau, le cœur, les poumons, les reins et le foie. Selon les résultats évalués, les modèles de HIE devraient être fondées sur l'hypoxie et l'ischémie globale plutôt que de compter sur ischémie focale, par exemple., Par ligature de voitureartères OTID 14. Une étude récente a appliqué une combinaison de l'hypoxie (FiO2 12%) et la compression de l'artère carotide moyenne tout en maintenant la pression artérielle> 40 mm Hg 2. Un autre groupe induite par l'hypoxie globale de 8% O 2 jusqu'à ce que l'excès de base négatif> 20 mmol / L ou moyenne pression artérielle (PSAM) <15 mm Hg, et sacrifié les animaux à 4 h 15. L'hypoxie a également été titré par le débit cardiaque (à 30-40% de la valeur initiale), la PAM (à 30-35 mm Hg) et le pH artériel (6,95-7,05) 16.

Les modèles de l'hypoxie-ischémie globale titré par aEEG suppression similaire à celle présentée dans ce rapport, ont démontré encéphalopathie qui est cliniquement, électrophysiologie, et neuropathologique comparable à la condition trouvé chez le nourrisson terme asphyxié 17,18.

Le degré de HIE induite est essentiel. Un modèle animal utile de HIE doit également permettre de tester de nouveaux diales procédures et les options de traitement gnostique. Pour ce faire, les modèles devraient induire HIE modérée où il ya un potentiel de traitement aussi sévère traumatisme crânien avec peu ou pas de potentiel de traitement serait moins pertinente lors de l'évaluation de nouveaux traitements. La tolérance à l'hypoxie varie considérablement entre les animaux d'essai. Des études antérieures ont montré que d'une lésion cérébrale plus cohérente peut être atteint et que plus d'animaux survivre 17,19 en individualisant l'hypoxie induite selon la réponse cérébrale de chaque porcelet évaluée par amplitude intégré électroencéphalographie (aEEG) plutôt que d'utiliser un ensemble FiO valeur 2 à travers le événement hypoxique. La durée de la suppression aEEG corrélée au degré de lésion cérébrale, avec peu de changements histopathologiques à <20 min suppression aEEG et des crises graves croissantes à> 45 min suppression aEEG. Un examen récent des traitements neuroprotecteurs pour HIE identifié la nécessité pour les modèles de survie permettant AME de résultats comportementauxUres dans des modèles animaux 20.

Il ya de nombreux avantages du modèle de porcelet HIE présenté. Il est basé sur un espèce où les résultats sont très susceptibles de se traduire par la physiologie humaine. Les modèles globaux hypoxie-ischémie défaillance multiviscérale et le titrage de l'hypoxie-ischémie par aEEG induit un degré constant de lésion cérébrale à la survie des résultats cliniques pertinentes telles que les biomarqueurs, l'IRM et le comportement peuvent être évaluées à des moments pertinents.

modèles de Porcinet d'asphyxie périnatale et HIE ont non seulement contribué de manière significative à un aperçu courant dans HIE physiopathologie, mais ont également précédé avec succès les essais cliniques, entraînant finalement dans de nouveaux traitements chez l'homme. Études de modèles porcelets ont joué un rôle clé dans l'établissement d'hypothermie comme traitement pour HIE 21, et sont utilisés dans la recherche sur la réanimation néonatale 22. Divers groupes ont utilisé des modèles de porcelets lors de l'exécution des recherches au sein de l'asphyxie et HIE, unétudes d hypothermie comprennent 23, l'hormone alpha-mélanotrope 24, 25 arrêt cardiaque, l'activité tyrosine hydroxylase 26, l'exposition répétée hypoxique 27, l'activité des récepteurs NMDA 14 et spectroscopie proche infrarouge 28.

Le modèle HIE porcelet présentée dans ce rapport est techniquement difficile de travailler avec, comme des ajustements mineurs au cours de la procédure peuvent entraîner des blessures trop légère ou trop sévère cerveau 29,2. Nous avons constaté que la littérature existante manquait suffisamment de détails pour reproduire les modèles publiés antérieurement. Ainsi, nous démontrons ici chaque étape des procédures techniques nécessaires à la mise en place d'un modèle de 72 h la survie des porcelets dans le présent rapport, permettant aux chercheurs d'établir ce modèle de pointe pour l'étude des HIE.

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Protocole

Le présent protocole a été approuvé par l'Inspection danoise sur l'expérimentation animale. Tous les animaux d'essai ont été anesthésiés au cours des procédures. La reproduction de ce protocole doit être effectuée conformément à l'éthique et des directives nationales de protection des animaux, et approuvé par les comités d'éthique locaux.

1. Les animaux

  1. Porcelets Landrace danois <âgé de 24 h pesant environ 1,500 - 2,000 g.

2. Anesthésie et maintenance des fluides

  1. Préparer le matériel nécessaire pour l'anesthésie (Figure 1): Un masque pour l'administration de sévoflurane, tampons d'alcool, cathéter intraveineux périphérique, bande de caoutchouc, des seringues avec une solution saline, le propofol (5 mg / kg), le fentanyl (10 ug / kg), et la procaine benzylpénicilline (15 000 UI / kg).
  2. Induire une anesthésie en fournissant 1-2% sévoflurane à travers un masque respiratoire.
    1. Évaluer la profondeur de l'anesthésie par l'évaluation pour palpébrale et le retrait réflexes. Lorsque certain que le porcelet est profondément anesthésié, insérez percutanée un cathéter intraveineux périphérique dans la veine de l'oreille.
    2. Pour confirmer la perméabilité du cathéter intraveineux périphérique, rincez le cathéter avec 1-2 ml de solution saline stérile à 0,9%. Administrer des injections en bolus de propofol (5 mg / kg) et de fentanyl (10 ug / kg). À la suite de l'administration par injection bolus rincer le cathéter intraveineux, une deuxième fois en utilisant 1-2 ml de solution saline stérile à 0,9%.
    3. La place seringues avec propofol (10 mg / ml) et de fentanyl (10 ug / ml) dans deux pompes séparées de perfusion à seringue. Connecter iv tubes des deux pompes à seringue à un robinet d'arrêt à trois voies joindre infusions en une seule ligne qui est connectée au cathéter par voie intraveineuse. Lancer continue perfusion intraveineuse de propofol (4-12 mg / kg / h) et de fentanyl (10 ug / kg / h). Une fois perfusions continues sont en cours d'exécution, ne donnent pas de nouvelles injections de bolus de propofol et fentanyl.
    4. Cesser l'administration de l'anest de gaz sévofluranehesia.
    5. Injecter procaine benzylpénicilline (15 000 UI / kg) sous-cutanée ou intramusculaire selon les instructions locales pour une prophylaxie antibiotique. Répéter quotidiennement. La vidéo montre administration sous-cutanée, qui a été montré chez les porcelets au résultat de la concentration plasmatique plus élevée et de plus longue demi-vie par rapport à l'administration im.
    6. Appliquer une pommade oculaire lubrifiant pour éviter le dessèchement des yeux. Tirez la paupière inférieure vers le bas doucement pour former une ouverture en forme de poche. Déposer une petite quantité de pommade à l'intérieur de la poche. Fermer les yeux pour distribuer pommade. Vérifier la sécheresse horaire et réappliquer si nécessaire.
    7. Initier une perfusion à débit continu de dextrose à 5% / 0,45% de NaCl iv à 10 ml / kg / h. Réduire le taux à 5 ml / kg / h pendant et après l'hypoxie. Ajuster la vitesse de perfusion pour maintenir des niveaux de glycémie entre 2-10 mmol / L.

figure-protocol-1
Figure 1. équipements pour l'anesthésie et l'intubation. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. intubation et la ventilation

  1. Préparer le matériel nécessaire pour l'intubation (Figure 1): le bromure de rocuronium (1 mg / kg) pour la relaxation musculaire, une élingue (attacher les deux extrémités de la même corde en nylon de 4 mm ensemble pour former un cercle, comme le montre la figure 1) pour l'ouverture la bouche, un coton-tige écouvillon et laryngoscope vétérinaire avec lame droite, xylocaïne pulvérisation (100 mg / ml), divers tubes endotrachéaux taille avec brassard (tailles 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), 500 ml sac auto-gonflant (soupape de sac masquer) pour la ventilation, 2 ml seringue pour le gonflage du brassard, et d'un stéthoscope.
  2. Intuber en suivant les étapes ci-dessous:
    1. Lieu porcelet en position couchée soutenir le cou de chaque côté pour fixer une ligne droite pas du larynxsauge pour l'intubation.
    2. Estimer la longueur de la sonde endotrachéale en mesurant de la pointe du museau à la fourchette sternale (généralement autour de 13 cm).
    3. Lieu élingue autour de la mâchoire supérieure (vers le bas) et maintenez la mâchoire inférieure et la langue vers le haut pour garder la bouche ouverte.
    4. Administrer le bromure de rocuronium (1 mg / kg) iv pour induire la relaxation musculaire.
    5. Utilisez laryngoscope pour soulever la languette vers le haut.
    6. Utilisez le coton-tige écouvillon pour libérer longue épiglotte du porcelet, qui peuvent être soit rétroversion dans l'œsophage ou pris derrière le palais mou.
    7. Avancez laryngoscope à garder l'épiglotte levé contre la base de la langue permettant la vue des cartilages aryténoïdes et cordes vocales.
    8. Appliquer xylocaïne pulvérisation (100 mg / ml) par voie topique dans le larynx de prévenir les spasmes du larynx.
    9. Avancez sonde endotrachéale à travers les cordes vocales. Utilisez un mouvement de rotation pour faciliter le passage des cartilages de la trachée étroites. Advance acco tuberding à la distance prémesuré et se connecter à un sac auto-gonflant (sac masque de valve) pour la ventilation manuelle. Pour aider à réduire la friction lors de l'intubation pulvériser le 1/3 distal de la sonde endotrachéale xylocaïne pulvérisation.
    10. Pour confirmer le placement de sonde endotrachéale correcte: observer pour toute indication de la difficulté à respirer, ausculter la poitrine en écoutant une entrée d'air bilatérale dans les deux poumons, confirmer visuellement la présence de condensation dans la partie proximale de la sonde endotrachéale, et vérifier la présence de fin carbone marée un détecteur de dioxyde de dioxyde de carbone colorimétrique ou par CO 2 expiratoire lecture relative à la ventilation mécanique le cas échéant. Fin normale de dioxyde de carbone de marée est d'environ 5%. Une valeur supérieure à 2% avec une forme d'onde d'apparence normale confirmera que le tube endotrachéal est dans la trachée.
    11. Gonflez la chambre brassard endotrachéale pour prévenir l'aspiration. La pression de gonflage du brassard doit être inférieure à 25 cm H 2 O afin d'éviter les lésions ischémiques pour les tissus environnants. Tenir la sonde endotrachéale en place, enroulez un morceau de ruban autour du tube, fermer la mâchoire et continuer taping autour du museau à fixer le tube en place. Tirez doucement sur le tube pour assurer qu'il reste en place.
    12. Connectez sonde endotrachéale à ventilateur mécanique.
  3. Réglez les paramètres de ventilation: la ventilation en volume contrôlé, le volume courant (TV): 10 ml / kg [ou de la pression inspiratoire de pointe (PIP) de 15 cm avec une ventilation à pression contrôlée]. La pression positive en fin d'expiration (PEEP): 5 cm. Rapport I: E 1: 2. La fréquence respiratoire: 35 (régler le débit pour maintenir en fin d'expiration de CO 2 entre 4,5-5,5 kPa).

4. Suivi et de l'Organe d'échantillonnage Fluid

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Figure 2. équipements pour la surveillance.ank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Préparer le matériel nécessaire pour la surveillance (Figure 2): ruban adhésif, de lubrifiant stérile, la sonde de mesure de la température rectale continue, l'électrocardiogramme (ECG) électrodes, électrodes oxymètre de pouls, rasoir, et EEG.
    1. Placez la sonde de saturation sur une patte arrière, lubrifier la sonde de température rectale et insérer 6 cm dans le rectum, placez radiants suspendus et / ou chauffée matelas gonflable pour maintenir la température rectale au niveau physiologique de 38,5 à 39 ° C, et le lieu ECG des électrodes.
    2. Placez porcelet dans la position couchée à se raser les zones de 1 cm x 1 cm pour le placement des électrodes sous-cutanées aiguille EEG; une en face de l'oreille, et l'électrode de référence dans la ligne médiane, juste derrière les yeux. Nettoyer le site de l'électrode avec un tampon imbibé d'alcool, puis insérez la voie sous-cutanée de l'électrode de l'aiguille. Électrodes sécurisés avec du ruban adhésif et le retour porcelet à la po couchéesition.
    3. Tournez sur le moniteur aEEG.
      NOTE: L'amplitude intégré EEG compose d'une trace dense avec des marges supérieures et inférieures. Marges inférieures et supérieures de ce modèle sont généralement 15-50 mV, souvent plus élevées que celle observée chez les nourrissons. Au cours de l'hypoxie, il est important de noter que l'artefact de l'ECG peut faussement élever la trace aEEG. médicaments de bolus (de propofol ou fentanyl) peuvent également transitoirement supprimer la trace aEEG et devraient être évités si possible pendant l'expérience. Administration de médicaments cliniques et des événements devrait être marqué pour faciliter l'interprétation de la trace aEEG.
  2. Préparer le matériel nécessaire pour placer des cathéters ombilicaux pour artérielle centrale de surveillance de la pression artérielle et le prélèvement de sang (Figure 3): gants stériles, drapage stérile, scalpel, tampons d'alcool, lingettes stériles, cathéter de veine ombilicale (5 Fr), cathéter de l'artère ombilicale (3,5 Fr ), suture fixé avec une pince, pince micro courbes, ciseaux, porte-aiguille et suture (par exemple, la taille 3-0), un patch adhésif transparent, seringues de 5 ml pour le prélèvement de sang.

figure-protocol-3
Figure 3. équipements pour lignes ombilicaux et des échantillons de sang. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Stériliser et le drapé de la zone autour de l'ombilic. Utiliser un scalpel pour couper le cordon ombilical au plus près possible de la peau. Si cela ne pas exposer les vaisseaux ombilicaux chez le porcelet anesthésié, couper la peau ombilical 2 mm en dessous du cordon ombilical pour exposer les navires. Identifier les deux petites artères ombilicales et une plus grande veine ombilicale (figure 4).
  2. Utilisez micro pince courbe pour dilater l'artère (Figure 4) et insérer le cathéter artériel ombilical(3,5 Fr). Estimation longueur d'insertion en cm à 3 x poids (kg) + 10 (formule empirique basée sur le placement correct dans l'aorte descendante au-dessus des artères rénales à l'autopsie).
  3. Placez un deuxième cathéter 5 Fr 5 cm dans la veine ombilicale (Figure 4). Vérifiez la pose du cathéter intravasculaire par retour de sang. Cathéters sécurisés par placer une suture en bourse autour de l'ombilic, passent la suture se termine autour de chacun des cathéters ombilicaux et faire un nœud. Couvrir cathéters avec pansement adhésif transparent.
  4. Recueillir des échantillons de sang à des moments pré-spécifiée: 1) immédiatement avant l'hypoxie, 2) 30 min dans l'insulte hypoxique 3) à la fin des 45 min hypoxique insulte 4) 2 h après l'agression hypoxique. En fonction du but de l'expérience d'autres points dans le temps pour des échantillons de sang peut être choisi.
  5. Utilisation artériel analyse des gaz du sang à partir d'échantillons de sang prélevés au cours de l'hypoxie pour vérifier les changements de gaz sanguins provoquées par l'hypoxie-ischémie (Tableau 1). On notera que les porcelets ont un faible taux d'hémoglobinet la naissance (environ 8 g / dL) et peut devenir anémique de fréquents prélèvements sanguins. Retirer moins de 2 ml de sang / kg de poids corporel par tirage au sort, à moins de 5 ml de sang / kg de poids corporel dans les 24 h et se conformer aux directives locales pour la prise de sang. Signes de l'anémie comprennent hématocrite et la tachycardie décroissante.
  6. Branchez la ligne artérielle à un moniteur pour continue intra-artérielle surveillance de la pression artérielle (PSAM). Utiliser une ligne veineuse pour l'administration de liquide et de la drogue.

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Figure 4. vaisseaux ombilicaux. Veine ombilicale (à droite) et l'un des deux artères ombilicales (gauche). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. hypoxie

  1. Attendre 60 min après la fin de la surveillance. Provoquer l'hypoxie en passant à 4% O 2 / 96% de mélange de gaz N 2. Surveiller les paramètres vitaux et aEEG près et continuera hypoxie pendant 45 min.
  2. Une fois la trace aEEG est plat (marge supérieure <7 mV), ajuster l'oxygénation en modifiant la fraction d'oxygène inspiré (FiO2) et la pression moyenne des voies aériennes à la plus haute FiO2 niveau maintenir une trace plate aEEG selon l'organigramme de la Figure 5. But pour PSAM en dessous de 70% de la ligne de base pendant au moins 10 min et, si nécessaire FiO 2 inférieur à assurer l'hypotension et de l'ischémie. Le niveau de l'hypotension décrit a été montré précédemment par d'autres 19,13,30 pour produire des lésions cérébrales pertinentes hypoxique-ischémique.
  3. En cas d'hypotension sévère (PSAM <25 mm Hg) à traiter par étapes comme suit: augmenter brièvement FiO 2 par 1-5% bolus de solution saline (10 ml / kg), infusion de dopamine (5-20 ug / kg / min), et infusion de noradrénaline (20 ng-1 ug / kg / min).
  4. En cas de crises durables> 10 min (cloniques, toniques or crises myocloniques, généralement focal ou comme indiqué par des changements soudains dans aEEG amplitude) traitent étapes avec (permettant 30 minutes avant de procéder à l'injection suivante): lent bolus de phénobarbital iv 20 mg / kg, répéter phénobarbital iv 20 mg / kg, et midazolam iv de 0,5 mg / kg.
    1. Si les crises se développent et sont répondant pas au traitement médicamenteux est indiqué l'euthanasie.

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Figure 5. hypoxie-ischémie organigramme. Organigramme montrant des ajustements dans l'oxygénation (F i O 2 et P aw) selon la réponse aEEG. Pression des voies aériennes (P aw) moyenne a été ajustée en changeant PIP / TV (PIP inférieure donne inférieure P aw) et la fréquence respiratoire (RR inférieure donne inférieure P aw). Cible aEEG = marge supérieure de trace <5 mV et la marge inférieure de traces> 3 mV (en moyenne 4 mV). Ciblela fréquence cardiaque (HR) => 80. cible moyenne de la pression artérielle (PSAM) = MABP> 25. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

6. survie de 72 h

  1. Surveiller le porcelet de près après l'insulte hypoxique, et de réduire progressivement les taux de perfusion de propofol et du fentanyl. Extuber au point où l'animal respire volontairement.
  2. Au cours de la période de survie, garder les porcelets à une animalerie avec montre de 24 heures par un personnel qualifié dans les soins et la surveillance intensive. Administrer perfusions iv de glucose 20 ml / kg 2-3 horaire. À 26-48 heures après l'hypoxie-ischémie bouteille alimentation partielle peuvent être engagées. L'aspiration à la trachée et les poumons peut se produire par l'alimentation au biberon si le réflexe nauséeux est pas présent.
  3. Le cas échéant à l'expérience, d'évaluer l'état neurologique en utilisant le système de notation élaboré par Thoresen et al., Décrit dansdétail dans la publication originale 17.

7. Évaluation du résultat

  1. Après 72 h, anesthésier et ventiler à nouveau comme décrit dans la section 2 et 3. Effectuer IRM avec des modalités d'imagerie pertinentes comme décrit par Munkeby et al 31 et autres 2.
  2. A la fin de l'expérience euthanasie porcelets avec une dose létale de pentobarbital (5 g / kg iv).
  3. Préparer le cerveau pour examen selon le but de l'expérience.
    1. Pour l'histologie du cerveau au formol tissu fixé:.. Utiliser perfusion cardiaque avec 4% de paraformaldehyde dans PBS, suivi par la dissection et post-fixation en paraformaldehyde comme décrit par Robertson et al 2, Chakkarapani et al 1 ou Liu et al 18 ou supprimer le cerveau et plongez dans 4% de paraformaldehyde comme décrit par Andresen et al. 32
    2. Pour l'analyse nécessitant tissu snap-congelés (par exemple, l'ARNanalyse des enzymes ou des dosages d'activité 33). Retirer le cerveau, disséquer les régions du cerveau d'intérêt et par encliquetage gel blocs de tissus de maximum 1 cm x 1 cm de l'azote liquide comme décrit par Munkeby et al 33

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Résultats

Les effets de l'hypoxie-ischémie sur le cerveau qui se produisent pendant l'insulte induite sont documentés par l'enregistrement de la trace aEEG. Un représentant aEEG trace est représentée sur la figure 6.

figure-results-1
Figure 6. Représentant aEEG trace. Faible amplitude due à une hypoxie-ischémie.

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Discussion

En raison de sa complexité, le modèle décrit ne peut être mis en œuvre dans les établissements accrédités et expérimentés dans la recherche animale. Approbation par les comités d'éthique locaux doit être obtenue avant le début des expériences, et optimale bien-être animal doit être assurée en tout temps. Comme le modèle est basé sur la survie des animaux d'essai, il est important que un environnement stérile est maintenu au cours de procédures invasives pour prévenir les infections.

...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier John Kristensen et Søren Braad Andersen du Département de Communication de l’hôpital universitaire d’Aarhus, au Danemark, pour leur aide exceptionnelle lors du tournage et du montage. Diana Gyldenløve, technicienne animalière, et Birgitte Kousgaard, vétérinaire, de l’Institut de médecine clinique de l’hôpital universitaire d’Aarhus, au Danemark, pour leur aide dans les soins aux animaux. Cette étude a été financée par la Fondation Lundbeck, la Fondation Laerdal pour la médecine aiguë, la Fondation pour la recherche de la région du Danemark central, la Fondation Augustinus, la Fondation Aase et Ejnar Danielsens, l’Institut de médecine clinique de l’hôpital universitaire d’Aarhus, la Fondation Brødrene Hartmanns, la Fondation Karen Elise Jensens, Fonden til Lægevidenskabens Fremme, et Marie Dorthea og Holger From, Haderslevs Fond.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Couverture pédiatrique au toucher chaudCovidien5030840
Adhésif Apertrue DrapeBarrier915447
Champ utilitaire (stérile) 75x80 cmBarrier800530
NeoflonBD - Luer391350
LaryngoscopeMiller85-0045
Tube endotrachéal 2,5 mm  ;Covidien111-25
Sonde endotrachéale 3,0 mm avec brassardUnomedicalMM61110030
Sonde endotrachéale 3,5 mm avec brassardUnomedicalMM61110035
Appareil d’anesthésieGE Healthcare1009-9002-000
EEG - électrodes/électrode à aiguille sous-cutanée jetableCephalonACCE120550
ECG - électrodesmedtronic3010107-003
Électrodes ECG pour IRMphilipsACCE120550
Échantillonneur de sang artériel - aspirateurRadiomètre médical ApS956552
Polyuréthane Cathéter de veine ombilicale (5 Fr/Ch)Covidien8888160341
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de suture (taille 3-0)Covidien8886 623341
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Kit

Références

  1. Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
  2. Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
  3. Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
  4. Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
  5. Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
  6. Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
  7. Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
  8. Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
  9. Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
  10. Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
  11. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early human development. 3, 79-83 (1979).
  12. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
  13. Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
  14. LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
  15. Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
  16. Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  17. Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
  18. Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
  19. Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
  20. Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
  21. Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311(2013).
  22. Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
  23. Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
  24. Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
  25. Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
  26. Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
  27. Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
  28. Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
  29. Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
  30. Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
  31. Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
  32. Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
  33. Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).

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