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Article de méthode

Blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres

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DOI :

10.3791/52460

⸱

17 février 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit une méthode pour créer une lésion mécanique des vaisseaux chez les embryons de poisson-zèbre. Ce modèle de blessure fournit une plate-forme pour étudier l’hémostase, l’inflammation liée à une blessure et la cicatrisation des plaies dans un organisme parfaitement adapté à la microscopie en temps réel.

Résumé

Les embryons de poisson-zèbre (Danio rerio) se sont avérés être un modèle puissant pour l’étude d’une variété de processus de développement et de maladies. Le développement externe et la transparence optique rendent ces embryons particulièrement sensibles à la microscopie, et de nombreuses lignées transgéniques qui marquent des types de cellules spécifiques avec des protéines fluorescentes sont disponibles, ce qui fait de l’embryon de poisson-zèbre un système idéal pour visualiser l’interaction des types de cellules vasculaires, hématopoïétiques et autres lors de lésions et de réparations in vivo. La génétique directe et inverse chez le poisson-zèbre est bien développée, et la manipulation pharmacologique est possible. Nous décrivons un modèle de lésion vasculaire mécanique à l’aide de techniques de micromanipulation qui exploite plusieurs de ces caractéristiques pour étudier les réponses aux lésions vasculaires, y compris l’hémostase et la réparation des vaisseaux sanguins. En utilisant une combinaison de microscopie vidéo et timelapse, nous démontrons que cette méthode de lésion vasculaire entraîne des réponses mesurables et reproductibles pendant l’hémostase et la réparation de la plaie. Cette méthode fournit un système permettant d’étudier en détail les lésions vasculaires et la réparation dans un modèle animal entier.

Introduction

Les poissons-zèbres ont été largement utilisés pour étudier une variété de sujets en biologie vasculaire, y compris le développement vasculaire, l’angiogenèse, le développement hématopoïétique et la pathologie1-3. Les embryons développent une circulation fonctionnelle ainsi que des leucocytes et d’autres composants du système immunitaire inné 1 jour après la fécondation (dpf) 1,4,5. La conservation de la réponse inflammatoire et leucocytaire aux lésions a fait de l’embryon de poisson-zèbre un modèle informatif pour des processus inflammatoires aussi divers que l’infection tuberculeuse, l’entérocolite et la régénération tissulaire6-9. Les embryons de poisson-zèbre ont été utilisés pour étudier l’inflammation liée à une blessure, en particulier dans le contexte des lésions épithéliales et de la réponse des neutrophiles10,11. Les lésions infligées à l’embryon entraînent une réponse cellulaire hautement conservée des cellules situées sur le site de la lésion et des cellules immunitaires innées recrutées pour répondre à la lésion et réguler sa résolution11,12. D’autres modèles de lésions ont utilisé des impulsions laser focalisées pour localiser spatialement les lésions dans des types de cellules spécifiques, notamment les neurones, les cellules musculaires et les cardiomyocytes13-15.

Les embryons de poisson-zèbre ont été utilisés comme modèle pour étudier l’hémostase et la thrombose dans des conditions de manipulation pharmacologique et génétique, en utilisant à la fois la formation mécanique et induite par laser16-19. Les composants de la cascade de coagulation semblent être bien conservés et les transgéniques ont permis d’étudier en détail le dépôt de thrombocytes et de fibrine au site de la coagulation17,20,21. La procédure présentée dans cet article complète ces méthodes en fournissant un système d’étude des lésions mécaniques des vaisseaux entraînant une brèche dans les vaisseaux, la formation et la résolution de thrombus et la réparation des vaisseaux.

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Protocole

Nota: Les procédures utilisant le poisson zèbre ont été approuvés par Institutional Animal Care UCSF et l'utilisation Comité.

1. Préparation des outils

  1. Insérer la goupille de point caractéristique dans un porte-broche et serrer la goupille.
  2. Utilisation pince fine pointe de, pliez la pointe de la broche pour créer un léger crochet.
  3. Pour la manipulation et à la stabilisation de l'embryon au cours de blessure, pliez la fin d'une aiguille de ½ pouce 28 jauge montée sur une seringue à insuline en utilisant une pince à bec effilé.

2. Préparation des embryons de poissons zèbres pour blessures

  1. Mettre en place couples reproducteurs de poisson zèbre et de ramasser les œufs dans l'eau d'œuf (60ug / mL sels d'aquarium) comme indiqué précédemment 22.
  2. Ajouter 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) à l'eau d'œuf lorsque les embryons sont environ après la fécondation de 8 heures (HPF) pour empêcher mélanisation.
  3. Dechorionate deux fertilisation poste de jour (DPF) embryons avant l'expérience à l'aide de pince fine de pointe.
    NOTE: Les embryons peuvent être blessés à tout moment après le début de la circulation. Les données présentées ici sont pour 2 dpf embryons, mais la technique a été appliquée avec succès dans les embryons jusqu'à 5 dpf.
  4. Anesthésier les embryons avec 0,02% tamponné acide 3-aminobenzoïque (tricaïne) environ 10 min avant de manipulations.

3. navire mécanique blessures d'embryons

  1. Transfert d'embryons anesthésiés à une diapositive de la dépression sur un stéréomicroscope à dissection en utilisant une pipette de transfert.
  2. En utilisant le côté plat court de l'aiguille de la seringue pour manipuler l'embryon avec la main dominante, placer l'embryon sur le côté avec la face ventrale tournée à l'opposé de l'aiguille.
  3. Positionner la goupille de minutie avec la pointe dirigée directement contre la surface ventrale de la partie postérieure de poisson à l'ouverture de urogénital. Placez la tige de minutie à un léger angle tel que l'extrémité incurvée est capable de percer le périderme directement dans la veine caudale (Figure 1 </ Strong>).
  4. Utilisation de l'aiguille de la seringue pour manipuler l'embryon, percer la veine caudale avec la broche de point caractéristique en appuyant sur l'embryon dans l'axe pour raccorder la broche légèrement dans la veine.
  5. Utilisation de l'aiguille de la seringue, l'embryon tirer loin de l'axe de minutie pour créer une petite déchirure dans le récipient.
    NOTE: Une blessure réussie entraîner des saignements immédiate de la veine.

4. Analyse de l'hémostase

  1. Choisissez seuls les embryons avec circulation visiblement cellules sanguines pour cette procédure.
  2. Préparer la minuterie pour commencer dès que la broche de point caractéristique est extrait de la cuve.
  3. Lancer la minuterie dès que la perte de sang peut être visualisé à partir de la plaie. Lorsque la perte de sang de la plaie cesse, arrêter le chronomètre et le temps total que Temps de saignement. Si la coagulation est inhibée, enregistrer le temps au moment où il n'y a plus visiblement les cellules sanguines circulantes.

5. Analyse de la cicatrisation

  1. Transfert post-blessures animaux dans des plats d'imagerie à fond de verre pour la microscopie.
  2. Retirer la majorité de l'eau de l'oeuf.
  3. Couvrir les embryons dans 0,3 à 1,2% bas point de fusion agarose dissous dans l'eau d'œuf, chauffé entre 42 et 45 ° C et additionné de 0,02% tricaïne.
  4. embryons de position sur leurs côtés à l'aide de pinces.
  5. Après l'agarose refroidit, remplir la cuve avec 0,02% de tricaïne dans l'eau d'œuf.
  6. Acquérir des images à l'aide de clair, épifluorescence ou microscopie confocale.
  7. Retirer embryon à partir de l'agarose en utilisant une pince et transfert retour à l'eau d'œuf.

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Résultats

Lésion vasculaire mécanique a été effectuée sur deux dpf embryons (Figure 2A - C). Résultats de blessures dans une réponse rapide et fiable la coagulation telle que mesurée par le temps à la cessation du saignement (figure 2D). Pour déterminer si les différences dans la réponse de coagulation peuvent être mesurés, l'hirudine anticoagulant a été administré à des embryons par injection dans le canal de Cuvier immédiatement avant la blessure (10.5 nl de 1 unité par ml ...

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Discussion

Le poisson zèbre ont été utilisés avec succès en tant que modèle pour les différents types de plaies, y compris les blessures laser 13 à 15, la thrombose induite par laser 16, 10 et épithéliale blessant. Nous rapportons une méthode de blessure mécanique qui est simple à exécuter et produit une blessure contrôlée dans un modèle in vivo qui est prête très bien à la microscopie en temps réel. Résultats de blessures dans une réponse hémostatique rapide et mesurable et un programme de ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les Drs Stephen Wilson et Lisa Wilsbacher pour leurs discussions utiles. Ce travail a été soutenu en partie par les NIH HL054737.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Goupilles MinutiaFine Science Tools26002-10 Diamètre dela pointe 0,0125 mm, diamètre de la tige 0,1 mm
Porte-goupillede science fine26016-12
Dumont #5 Pince à pointe fineOutils de science fine 11254-20
Lame de dépression en verreÉcosystèmes aquatiquesM30
Agarose à bas point de fusionLonza  ;50081Préchauffé à 42 º ; C
N-Phénylthiourée (PTU)Sigma AldrichP7629
Acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
Boîtes d’imagerie à fond de verreMattekP35G-1.5-14-C
Microscope à dissectionOlympusSZH10
Microscope à fluorescenceZeissAxio Observer
Sels d’aquariumSeringue à insuline Instant Ocean
avec aiguille de 28,5 GBecton Dickinson  ;
Outils 329461

Références

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