Blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres

Résumé

Cet article décrit une méthode pour créer une lésion mécanique des vaisseaux chez les embryons de poisson-zèbre. Ce modèle de blessure fournit une plate-forme pour étudier l’hémostase, l’inflammation liée à une blessure et la cicatrisation des plaies dans un organisme parfaitement adapté à la microscopie en temps réel.

Résumé

Les embryons de poisson-zèbre (Danio rerio) se sont avérés être un modèle puissant pour l’étude d’une variété de processus de développement et de maladies. Le développement externe et la transparence optique rendent ces embryons particulièrement sensibles à la microscopie, et de nombreuses lignées transgéniques qui marquent des types de cellules spécifiques avec des protéines fluorescentes sont disponibles, ce qui fait de l’embryon de poisson-zèbre un système idéal pour visualiser l’interaction des types de cellules vasculaires, hématopoïétiques et autres lors de lésions et de réparations in vivo. La génétique directe et inverse chez le poisson-zèbre est bien développée, et la manipulation pharmacologique est possible. Nous décrivons un modèle de lésion vasculaire mécanique à l’aide de techniques de micromanipulation qui exploite plusieurs de ces caractéristiques pour étudier les réponses aux lésions vasculaires, y compris l’hémostase et la réparation des vaisseaux sanguins. En utilisant une combinaison de microscopie vidéo et timelapse, nous démontrons que cette méthode de lésion vasculaire entraîne des réponses mesurables et reproductibles pendant l’hémostase et la réparation de la plaie. Cette méthode fournit un système permettant d’étudier en détail les lésions vasculaires et la réparation dans un modèle animal entier.

Introduction

Les poissons-zèbres ont été largement utilisés pour étudier une variété de sujets en biologie vasculaire, y compris le développement vasculaire, l’angiogenèse, le développement hématopoïétique et la pathologie^1-3. Les embryons développent une circulation fonctionnelle ainsi que des leucocytes et d’autres composants du système immunitaire inné 1 jour après la fécondation (dpf) ^1,4,5. La conservation de la réponse inflammatoire et leucocytaire aux lésions a fait de l’embryon de poisson-zèbre un modèle informatif pour des processus inflammatoires aussi divers que l’infection tuberculeuse, l’entérocolite et la régénération tissulaire^6-9. L....

Protocole

Nota: Les procédures utilisant le poisson zèbre ont été approuvés par Institutional Animal Care UCSF et l'utilisation Comité.

1. Préparation des outils

1. Insérer la goupille de point caractéristique dans un porte-broche et serrer la goupille.
2. Utilisation pince fine pointe de, pliez la pointe de la broche pour créer un léger crochet.
3. Pour la manipulation et à la stabilisation de l'embryon au cours de blessure, pliez la fin d'une aiguille de ½ pouce 28 jauge montée sur une seringue à insuline en utilisant une pince à bec effilé.

2. Préparation des embryons de poissons....

Résultats

Lésion vasculaire mécanique a été effectuée sur deux dpf embryons (Figure 2A - C). Résultats de blessures dans une réponse rapide et fiable la coagulation telle que mesurée par le temps à la cessation du saignement (figure 2D). Pour déterminer si les différences dans la réponse de coagulation peuvent être mesurés, l'hirudine anticoagulant a été administré à des embryons par injection dans le canal de Cuvier immédiatement avant la blessure (10.5 nl de 1 unité par ml .......

Discussion

Le poisson zèbre ont été utilisés avec succès en tant que modèle pour les différents types de plaies, y compris les blessures laser ^{13 à 15,} la thrombose induite par laser ^{16, 10} et épithéliale blessant. Nous rapportons une méthode de blessure mécanique qui est simple à exécuter et produit une blessure contrôlée dans un modèle in vivo qui est prête très bien à la microscopie en temps réel. Résultats de blessures dans une réponse hémostatique rapide et mesurable et un programme de .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Goupilles Minutia	Fine Science Tools	26002-10 Diamètre de	la pointe 0,0125 mm, diamètre de la tige 0,1 mm
Porte-goupille	de science fine	26016-12
Dumont #5 Pince à pointe fine	Outils de science fine 11254-20
Lame de dépression en verre	Écosystèmes aquatiques	M30
Agarose à bas point de fusion	Lonza  ;	50081	Préchauffé à 42 º ; C
N-Phénylthiourée (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
Acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Boîtes d’imagerie à fond de verre	Mattek	P35G-1.5-14-C
Microscope à dissection	Olympus	SZH10
Microscope à fluorescence	Zeiss	Axio Observer
Sels d’aquarium	Seringue à insuline Instant Ocean
avec aiguille de 28,5 G	Becton Dickinson  ;

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