Article de méthode

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

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DOI :

10.3791/52469

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2 février 2015

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1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de co-culture en trois dimensions, qui est utile pour étudier les interactions multicellulaires et la modulation dépendante de la matrice extracellulaire du comportement des cellules cancéreuses. Dans ce modèle expérimental, les cellules cancéreuses sont cultivées sur des gels de collagène intégrés à des fibroblastes humains associés au cancer.

Résumé

La progression du cancer (initiation, croissance, invasion et métastase) se produit par le biais d’interactions entre les cellules malignes et les cellules stromales tumorales environnantes. Le microenvironnement tumoral est composé d’une variété de types de cellules, telles que les fibroblastes, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales vasculaires, les péricytes et les cellules dérivées de la moelle osseuse, intégrées dans la matrice extracellulaire (MEC). Les fibroblastes associés au cancer (CAF) ont un rôle pro-tumorigène par la sécrétion de facteurs solubles, l’angiogenèse et le remodelage de la MEC. Les modèles expérimentaux de survie, de prolifération, de migration et d’invasion des cellules cancéreuses se sont principalement appuyés sur des cultures de tissus monocellulaires et monocouches bidimensionnelles ou sur des tests en chambre de Boyden. Cependant, ces expériences ne reflètent pas précisément les conditions physiologiques ou pathologiques d’un organe malade. Pour mieux comprendre les interactions entre le stromal tumoral ou la matrice tumorale, les cultures multicellulaires et tridimensionnelles fournissent des outils plus puissants pour étudier la communication intercellulaire et la modulation du comportement des cellules cancéreuses dépendante de l’ECM. Comme plate-forme pour ce type d’étude, nous présentons un modèle expérimental dans lequel des cellules cancéreuses sont cultivées sur des gels de collagène intégrés à des cultures primaires de CAF.

Introduction

Le tissu cancéreux peut être perçu comme un type d’organe, qui évolue grâce à des interactions étroites entre le cancer et le microenvironnement stromal tumoral, composé de fibroblastes associés au cancer (CAF), de cellules immunitaires, de vaisseaux tumoraux et de la matrice extracellulaire (MEC). Les CAF sont la principale source de facteurs solubles (cytokines, facteurs de croissance et chimiokines) qui exercent des effets mitogènes, pro-migratoires et pro-invasifs sur les cellules cancéreuses. Ils stimulent également la formation des vaisseaux tumoraux et recrutent des cellules précurseurs, telles que les cellules dérivées de la moelle osseuse (BMDC). Les CAF activés sont impliqués dans la production et le remodelage de l’ECM, favorisant ainsi la croissance et la propagation des cellules cancéreuses1. Les CAF fournissent également une niche qui facilite la colonisation des cellules tumorales et les métastases et sont capables de conférer des phénotypes de cellules souches aux cellules cancéreuses voisines. Les observations pathologiques suggèrent que les réactions stromales ou les modifications fibrotiques dans les tissus cancéreux sont indicatives d’un mauvais pronostic. Des études récentes ont également démontré que les caractéristiques stromales tumorales, telles que la signature génétique, peuvent prédire le pronostic du patient. De plus, les facteurs dérivés des CAF peuvent moduler la sensibilité à la chimiothérapie, mettant en évidence le rôle des CAF dans la détermination de la sensibilité et de la résistance aux médicaments2.

Comme les CAFs jouent un rôle multiforme dans la promotion de la progression tumorale par le biais de voies de signalisation qui médient les interactions entre les CAFs et les différents types de cellules au sein du microenvironnement tumoral, ils ont attiré de plus en plus d’attention en tant que nouvelles cibles pour les thérapies anticancéreuses. L’hétérogénéité des populations cellulaires au sein du microenvironnement cancéreux présente un obstacle au ciblage des CAF. Plusieurs marqueurs des CAFs ont été proposés, tels que l’actine musculaire α-lisse (α-SMA), la protéine d’activation des fibroblastes (FAP) et la proten-1 spécifique des fibroblastes (FSP-1 : également appelée S100A4) ; cependant, ces marqueurs moléculaires ne sont pas spécifiques pour distinguer les CAF des autres cellules présentes dans les tissus non cancéreux3. Par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour obtenir plus de connaissances sur les propriétés spécifiques des CAF. À cette fin, il est informatif de caractériser les CAF cultivés primaires par rapport aux fibroblastes normaux appariés par le patient.

Récemment, des analyses sur des CAF dérivées de patients ont été rapportées dans plusieurs types de cancer, révélant des modèles d’expression génique et des comportements cellulaires uniques par rapport aux fibroblastes dérivés de tissus non cancéreux. En utilisant des CAF isolés de tissus humains atteints de cancer du poumon, nous avons développé une méthode de co-culture tridimensionnelle, nous permettant d’évaluer les propriétés des CAF pulmonaires. Dans ce modèle, nous avons étudié les effets des CAFs sur l’invasion des cellules cancéreuses du poumon, la prolifération et la contraction du gel de collagène, ce qui a récapitulé expérimentalement les rôles de promotion tumorale des CAFs pulmonaires4.

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Protocole

NOTE: Cette étude a été approuvée par les comités d'éthique appropriés.

1. Culture primaire des fibroblastes pulmonaires humains

  1. Collecte de tissu pulmonaire:
    1. Obtenir des échantillons humains de tissus pulmonaires de la salle d'opération chirurgicale directement. Prélever environ 1 cm 3 pâtés de maisons de tissus pulmonaires cancéreuses et non-cancéreuses, avec l'échantillon non-cancéreuse recueillies aussi loin de la tumeur que possible.
    2. Suspendre les échantillons dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 0,25 pg / ml d'amphotéricine B (milieu sans sérum). Maintenir les échantillons en suspension dans 50 ml tubes stériles et de transférer au laboratoire.
      NOTE: Les fibroblastes sont hautement migratoires et proliférative rapport à d'autres types de cellules, comme épithéliales, endothéliales et les cellules musculaires lisses. Le procédé de l'excroissance tire profit de ces caractéristiques de fibroblastes, et outgrocellules de l'aile de coupes de tissus sont abondants dans les fibroblastes. Après plusieurs passages cellulaires, d'autres types de cellules ne parviennent pas à survivre et à se propager dans du DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), ce qui entraîne dans des cultures cellulaires de fibroblastes purifiés. Les cellules pourraient être utilisées 3-7 passages suivants culture primaire.
  2. Explantation culture et de conditionnement pour excroissance de cellules:
    1. Effectuer culture primaire de fibroblastes en utilisant un protocole indiqué précédemment avec des modifications 5.
    2. Dans le laboratoire, placer l'échantillon de tissu sur une boîte de 10 cm de culture de tissu sans milieu de culture et les couper en petites sections ~ 2-3 mm de taille à l'aide de pinces stériles et un scalpel. Pendant ce processus, éviter de faire la section sèche, sinon l'efficacité de l'excroissance des cellules est altérée.
  3. La séparation de la couche de cellules epitheliales et du tissu conjonctif:
    1. Faire tremper les coupes de tissus de coupe dans un milieu de culture contenant 2000 PU / ml dispase I et la culture pendant 16 heures à 4 ° C.
    2. Transférer les sections de tissu à plat, et on sépare la couche de cellules épithéliales à partir du tissu conjonctif adjacent. Traiter les sections dans un banc propre pour éviter la contamination des micro-organismes.
      NOTE: Si la culture primaire de cellules épithéliales est nécessaire, effectuer l'étape 1.3. Si seulement les fibroblastes sont d'être isolé, omettre l'étape 1.3, car les Explant et cellulaires passages ultérieurs sont défavorables pour les cellules épithéliales, qui donnent populations de fibroblastes purifiés.
  4. Fixation des coupes de tissus:
    1. Émincer les tissus en morceaux de 1 mm à l'aide de deux scalpels. Si les pièces ne sont pas assez petit, elles se détachent plus facilement de l'antenne, et les cellules ne parviennent pas à dépasser sur la surface de la boîte.
    2. Passer petites sections de tissu pulmonaire les unes des autres pour maintenir une zone vide entourant chaque pièce. Assurez-rayures sur la surface de la boîte de culture tissulaire en utilisant une lame de scalpel pour faciliter la fixation des coupes de tissus.
      REMARQUE: Grattersemble également faciliter l'excroissance des cellules, fournissent des pistes le long de laquelle les cellules peuvent migrer.
      1. Alternativement, placer des morceaux de tissus hachés individuellement dans chaque puits d'une plaque à 6 puits, et les couvrir avec une lamelle. Fixez la lamelle à la surface de la plaque avec de la graisse de silicone.
      2. Placez la graisse de silicone à deux points 1,5 cm à part dans chaque puits en utilisant une goupille stérile. Couverture des morceaux de tissu améliore l'efficacité de l'excroissance des cellules et la propagation des cellules après plusieurs passages.
  5. Explant ultérieure:
    1. Ajouter délicatement milieu de culture à l'antenne avant les coupes de tissus se dessèchent, aussi efficace excroissance cellulaire est perdu pour la plupart si les échantillons sécher. Ne versez pas le support trop rapidement que les coupes de tissus seraient détacher.
    2. des cellules de culture dans du DMEM avec 10% de FBS. Utiliser suffisamment de support pour couvrir tout le tissu, mais pas trop qu'il permet flottant, comme la flottabilité supplémentaire favorise le détachement duplat.
  6. Cellule passage:
    1. Manipulez le milieu de culture avec soin en tout temps que les mouvements répétés de la boîte de culture peuvent conduire au détachement des sections de tissus.
    2. Placez les boîtes de culture dans un incubateur à 37 ° C pendant 5-7 jours. Actualiser le milieu tous les deux jours, et de gérer les boîtes de culture minimale pendant les moyennes changements. Fibroblastes grandissent à partir du bord des sections de tissus au cours des prochaines semaines.
      REMARQUE: Après ~ 2-3 semaines, les fibroblastes excroissance presque atteignent la confluence, en fonction de la quantité d'aire de surface.
    3. Laver les cellules avec PBS 1x, et ajouter 1 ml de trypsine I de la plaque.
    4. Après trypsinisation, détacher les cellules en utilisant 9 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Recueillir les cellules en suspension dans le milieu dans un tube de 10 ml, ainsi que les coupes de tissu. Après centrifugation pour former des pastilles de cellules, remettre en suspension les culots obtenus dans le nouveau milieu.
    5. Ensemencer les cellules et des coupes de tissus sur un nouveau culplat de ture, à quel point les tissus ne parviennent pas à fixer à la boîte tandis que les cellules adhèrent et se développent. Le lendemain, retirez les morceaux de tissu flottant par aspiration, et de changer le milieu. Fibroblastes attachés propagent avec les cultures suivantes.

2. Trois dimensions Co-culture de fibroblastes de poumon humain et les cellules cancéreuses

  1. Préparation des cellules et des réactifs:
    1. Utiliser environ 2 x 10 5 cellules épithéliales et 2,5 x 10 5 fibroblastes par puits. Préparation de collagène de type IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), un tampon de reconstitution (NaOH 50 mM, 260 mM NaHCO 3 mM, HEPES 200), 5x DMEM, DMEM complété avec 10% de FBS pour la culture des fibroblastes, et un milieu de co-culture en 3D (un mélange 1: de milieu de culture de fibroblastes et une milieu de culture pour les cellules cancéreuses).
    2. Des cellules d'adénocarcinome du poumon A549, la culture des fibroblastes et la co-culture 3D A549 dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS.
  2. Collagène gel formation:
    1. Laver les fibroblastes cultivés sur 10 cm plat avec 1x PBS, et ajouter 1 ml de trypsine I de la plaque. Après trypsinisation de ~ 5 min à 37 ° C, de détacher les cellules en utilisant 9 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Recueillir les cellules en suspension dans le milieu dans un tube de 10 ml, et les centrifuger à 200 à 300 xg pour former des pastilles cellulaires.
    2. Remettre en suspension les pastilles résultantes à 100% de FBS à une densité de 5 x 10 5 / ml.
    3. Préparer le gel de collagène sur de la glace. Refroidir les réactifs, pipettes et les tubes dans un réfrigérateur avant la procédure suivante. Même sur de la glace, le mélange se solidifie dans une certaine mesure, et le volume total est inférieur à la somme de tous les constituants.
    4. Dans chaque puits, de préparer le gel de collagène en mélangeant 0,5 ml de suspension de fibroblastes (2,5 x 10 5 cellules) de FBS, 2,3 ml de collagène de type IA, 670 ul de DMEM 5x, et 330 ul de tampon de reconstitution. Laisser les gels de mettre facilement à la température ambiante.
      1. Pipette vigoureusement pour assurer un km homogènexture. Éviter de créer des bulles pendant le processus de pipetage.
    5. Ajouter le mélange (3 ml) à chaque puits d'une plaque à 6 puits et laisser gélifier dans l'incubateur à 37 ° C sans perturbation pendant 30 à 60 min.
  3. culture de cellules de cancer sur le gel de collagène:
    1. Effectuer co-culture en trois dimensions en utilisant un protocole indiqué précédemment, avec les adaptations 6.
    2. Resuspendre les cellules cancéreuses dans le milieu de co-culture en 3D (ou dans du DMEM avec 10% de FBS dans le cas des cellules A549) à une densité de 1 x 10 5 / ml.
    3. Verser 2 ml de la solution de cellules remis en suspension (2 x 10 5 cellules) sur la surface de chaque gel. Modifier le nombre de cellules des cellules cancéreuses ou des fibroblastes en co-culture en fonction des conditions expérimentales.
  4. Gel contraction:
    1. Incuber des gels pendant une nuit à 37 ° C de sorte que les cellules cancéreuses peuvent adhérer au gel de collagène. Détachez chaque gel, et de générer une «culture flottant» dans chaque puits of la plaque de 6 puits.
      NOTE: En utilisant une culture flottante, divers changements dans la taille du gel sont induits par une tension mécanique et la dégradation du collagène, qui sont médiés par l'interaction cellulaire entre les cellules cancéreuses et des fibroblastes co-cultivés.
    2. Utilisez une aiguille 21 G angle ou petite spatule pour séparer chaque gel à partir du bord du puits. Tous les 2-3 jours, rafraîchir les puits avec 2 ml de 3D milieu de co-culture. Mesurer la taille de chaque gel tous les jours pendant 5 jours.
  5. L'analyse des gels de collagène:
    1. Mesure de la teneur en collagène de chaque gel en utilisant des méthodes de quantification de collagène, tels que le dosage Sircol. Effectuer une analyse transcriptomique ou RT-PCR quantitative après avoir recueilli l'ARN à partir des gels 5.

3. Air-liquide Interface Culture et Invasion Assay

  1. Après la culture des gels de collagène à 37 ° C pendant 5 jours, exposer les gels contractés à l'air en les plaçant sur un maillage (70 um taille des pores) dans la nouvelle 6-plaques à puits. Faire le maillage du tamis cellulaires disponibles dans le commerce utilisés pour la cytométrie de flux.
  2. Versez doucement chaque puits avec 11 ml de 3D milieu de co-culture.
  3. Placez les gels sur le maillage en utilisant une cuillère stérile, et retirer tout support restant dans les gels. A cette condition, gels immerger dans le milieu tandis que d'exposer la surface supérieure du gel à l'air. Définir cette condition de la culture comme interface air-liquide.
    REMARQUE: Après 5-7 jours de culture en maintenant l'interface air-liquide à 37 ° C dans l'incubateur, les cellules cancéreuses invasives migrent dans le gel. Selon le type de cellule et à la suite d'interactions cellulaires, des degrés variables de changement morphologique cellulaire dans les cellules cancéreuses sont induits par la culture d'interface air-liquide.
  4. Pour l'évaluation histologique, fixer le gel dans une solution de formol nuit à la température ambiante et l'intégrer dans de la paraffine. Colorer sections verticales (4 um) avec hématoxyline et l'éosine (H & E). Effectuer une analyse immunohistochimique on les sections 4.

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Résultats

Cette méthode de co-culture, imitant le micro-environnement de la tumeur, est un outil utile pour étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et les fibroblastes incorporés dans des gels de collagène. Dans l'étude précédente, trois paramètres ont été évalués dans ce modèle expérimental: contraction du gel de collagène, l'invasion des cellules cancéreuses et les changements morphologiques. la prolifération des cellules du cancer a également été estimée en utilisant une immunocoloration 4 Ki...

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Discussion

CAF forment une composante majeure de l'ECM entourant les cellules cancéreuses et non seulement fournir un échafaudage pour la tumeur, mais aussi participer activement au développement de la tumeur 7. L'accumulation de preuves dénoue l'impact de la CAF ou de leurs molécules apparentées sur le pronostic éventuelle, en soulignant le rôle crucial de la progression tumorale CAF médiation 8.

Dans l'étude précédente, nous avons utilisé la méthode pour isoler C...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 et 25460137).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Collagène de type IAGélatine Nitta Inc.CELL-1A
Tampon de reconstitutionNitta gelatin Inc.
CouvercleNUNC174934
Graisse siliconeDow Corning TorayGraisse
Dispase IWAKO386-02271
Plaque 6 puitsBD Falcon353046
Filtre à cellules (70 &mu ; m)BD Falcon352350
sous vide poussé

Références

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Mots-clés

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